Neonatal Murine Cochlear Explant Technique come un

L'obiettivo generale di questa procedura è la preparazione, coltura, trattamento e immunomarcatura di espianti cocleari murini neonatali da utilizzare come strumento di screening in vitro nella ricerca sull'udito. Questo metodo può contribuire a rispondere a domande fondamentali nel campo della ricerca sull'udito, come permettere lo studio simultaneo di cellule ciliate cocleari, sinapsi, neuriti e neuroni in un modello ex vivo e fornire informazioni sui meccanismi d'azione di molecole nuove per la coclea, inclusi fattori presenti nelle secrezioni umane. Il principale vantaggio di questa tecnica è che il processo di screening di composti terapeutici candidati può essere accelerato prima del loro test in vivo.

Iniziare con una testa di neonato appena raccolta, contenuta in etanolo al 70% nel coperchio di una piastra di Petri. Utilizzare una lama di bisturi per effettuare un taglio superficiale nella pelle dall'estremità anteriore a quella posteriore del cranio. Quindi tagliare entrambi i condotti uditivi esterni e ripiegare la pelle anteriormente per esporre l'intero cranio.

Successivamente, aprire il cranio lungo la sutura sagittale muovendo delicatamente la lama del bisturi dall'alto verso il basso, in direzione antero-posteriore, per evitare la compressione della coclea. Rimuovere e scartare il muso effettuando un taglio verticale immediatamente posteriore alle orbite. La parte posteriore del cranio dovrebbe ancora contenere il cervello e la coclea.

Quindi utilizzare 4 pinzette per dissezionare in modo ottuso ed eliminare il proencefalo, il cervelletto e il tronco encefalico. Posizionare le due metà del cranio in una piastra di Petri di plastica da 60 millimetri riempita con HBSS freddo. Quindi utilizzare 4 pinzette per esporre completamente la coclea, che è adiacente all'arteria stapediale circostante, e separare in modo ottuso l'organo dall'osso temporale.

Trasferire il coclea in una piastra di Petri da 50 millimetri con fondo in vetro trasparente contenente HBSS e posizionare la piastra sotto il microscopio. Mettere la piastra di Petri in plastica da 60 millimetri con l'altra metà del cranio sul ghiaccio. Successivamente, utilizzare 4 pinzette per dissezionare con attenzione la capsula otica del coclea.

Ora, utilizzare un microbisturi o due pinzette da 55 forze per separare con attenzione il legamento spirale, aderente all'organo del Corti, dal resto della coclea e dal medialis. Questa operazione può essere eseguita afferrando il legamento spirale nella sua parte più basale e svolgendolo delicatamente mentre ci si sposta in direzione apicale. Dopo aver rimosso il legamento spirale, posizionare il campione in modo da ottenere una vista sagittale longitudinale della coclea.

Quindi tagliare la coclea in due o tre sezioni utilizzando il microbisturi, classificando queste sezioni come giri apicale e basale. Rimuovere il tessuto superiore per il frammento più apicale e quello inferiore per il frammento più basale, fino allo strato effettivo di cellule ciliate e neuriti, in modo da permettere all'espianto cocleare di adagiarsi orizzontalmente sulla piastra di Petri. Successivamente, utilizzare la pinzetta per afferrare delicatamente e staccare la membrana tettoria, un sottile strato traslucido immediatamente superiore all'organo del Corti.

Il passaggio tecnicamente più complesso è probabilmente la rimozione della sottile membrana tettoria traslucida, poiché si rischia facilmente di danneggiare le cellule ciliate sottostanti. Partendo dai margini del tessuto, si preservano le cellule ciliate lungo tutta la lunghezza dell'espianto, ad eccezione del bordo estremo in cui è iniziata la rimozione della membrana tettoria. Infine, rimuovere la membrana di Reissner immediatamente superiore ai neuroni del ganglio spirale toccandola con la pinzetta su entrambi i lati e staccandola.

Il campione cocleare è ora pronto per la coltura, dopo aver rimosso eventuali aree danneggiate ai margini. Iniziare la procedura di coltura bagnando la punta di una pipetta da un millilitro con circa 120 microlitri di DMEM per evitare che l'espianto aderisca all'interno della punta. Utilizzare quindi la punta pre-umidificata per pipettare un massimo di 70 microlitri dalla piastra di Petri con fondo in vetro e posizionare il campione insieme al liquido su uno dei quattro inserti presenti nella piastra di Petri a quattro pozzetti.

Verificare al microscopio che l'espianto sia nella corretta orientazione. Assicurarsi che la zona di cellule ciliate da cui è stata rimossa la membrana tettoriale sia rivolta verso l'alto e che la membrana basilare insieme alla parte basale tagliata della medialis sia rivolta verso il basso e aderisca al frammento di coprivetrino. Se al controllo il campione risulta orientato al contrario, come mostrato qui, aggiungere HBSS dalla punta della pipetta e riposizionare il frammento finché non sarà correttamente orientato.

Una volta che l'espianto è correttamente orientato, aspirare l'eccesso di HBSS e attendere 15 secondi. Successivamente, pipettare 60 microlitri di mezzo di coltura caldo direttamente sul campione, avendo cura di non toccare il campione con la pipetta. Riposizionare i coperchi interno ed esterno della piastra di Petri e incubare tutta la notte a 37 gradi Celsius.

Il giorno successivo, trasferire l'espianto cocleare contenuto nelle piastre di Petri dall'incubatore all'armadietto a flusso laminare. Aspirare il vecchio mezzo di coltura privo di FBS dall'inserito. Aggiungere 60 microlitri per pozzetto del mezzo di trattamento preparato e riscaldato.

Riposizionare la piastra di Petri nell'incubatore fino alla colorazione delle colture dopo un massimo di sette giorni. Come mostrato in questa immagine confocale, questa tecnica preserva l'anatomia dell'intero giro cocleare, inclusi i neuroni del ganglio spirale o SGN, permettendo l'analisi degli effetti del trattamento sui neuriti e sui somi dei SGN oltre all'organo del Corti. Come mostrato qui, questi espianti possono essere utilizzati per confrontare simultaneamente l'effetto del trattamento sui giri apicale e basale dopo colorazione immunofluorescente.

I recettori uditivi sono mostrati in verde e le strutture neuronali appaiono in rosso. Le sinapsi integre possono essere valutate mediante etichettatura delle proteine pre-sinaptiche mostrate in rosso e delle proteine post-sinaptiche mostrate in verde, insieme alla colorazione delle strutture neuronali in blu. Questa figura mostra immagini rappresentative di espianti cocleari apicali e basali dopo sette giorni di coltura, con 3% FBS a sinistra o 1% FBS a destra.

Le cellule incubate in FBS al 3% iniziano a migrare tra il quarto e il quinto giorno, come indicato dalle frecce grigio chiaro per le cellule ciliate e dalle frecce rosse per i neuriti. Gli espianti in FBS all'1% mantengono l'integrità organizzativa fino al settimo giorno. Durante il tentativo di questa procedura, è importante ricordare di verificare visivamente l'integrità strutturale e l'orientamento del tessuto cocleare prima di aggiungere il mezzo di coltura finale e le sostanze di interesse.

Seguendo questa procedura, è possibile eseguire una ricostruzione tridimensionale per confermare la localizzazione specifica per tipo cellulare delle cellule che esprimono GFP all'interno del medialis.