Name: Neonatal Murine Cochlear Explant Technique come un In vitro Strumento di screening nella ricerca acustica (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-06-08T15:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 30 s
Description: Impara la tecnica degli esplanti cocleari neonatali murini per la ricerca sull'udito. Questo metodo consente lo screening in vitro di composti terapeutici candidati prima dei test in vivo.

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Questo lavoro è stato sostenuto dall&#39;Istituto Nazionale di Sordità e altri Disturbi della Comunicazione con sovvenzioni R01DC015824 (KMS) e T32DC00038 (supporto SD), il Dipartimento della Difesa concede la W81XWH-15-1-0472 (KMS), la Fondazione Bertarelli (KMS) La Fondazione di Nancy Sayles Day (KMS) e il Centro di ricerca di tinnito di Lauer (KMS). Ringraziamo Jessica E. Sagers, BA per commenti insightful sul manoscritto.

Il protocollo di studio è stato approvato dal Comitato Istituzionale di Assistenza e Assistenza Civile (IACUC) di Massachusetts Eye and Ear. Gli esperimenti sono stati condotti secondo il Codice Etico dell&#39;Associazione Medica Mondiale. 1. Preparazione della dissezione <ol><li> Preparazione del tavolo chirurgico <ol><li> Usa il 70% di etanolo per disinfettare il tavolo chirurgico. </li><li> Posizionare due pasticci nonsterili accanto al microscopio. </li><li> Preparare il vassoio strumenti, forbici operative a caldo sterilizzato, una maniglia per bisturi, un micro coltello e una pinza (due ciascuno di # 4 &amp; # 55). Posizionare il vassoio dello strumento e un piatto di petri da 50 mm, chiaro a parete, in vetro, su un tampone non sterile. </li><li> Ottenere una lama sterile # 15 a bisturi; Un sacchetto o contenitore di plastica sigillabile (per smaltire le carcasse in linea con gli orientamenti istituzionali); Ghiaccio in un secchio; E fredda, sterile Hank&#39;s Balanced Salt Solution (HBSS). Posizionare questi elementi sulAltro tampone nonsterile. </li><li> Trasferire l&#39;HBSS in un tubo di laboratorio di plastica da 50 ml e metterlo su ghiaccio. </li></ol></li><li> Preparazione della cultura <ol><li> Preparare tutti i materiali in un cappuccio flusso laminare. Per ogni quattro esemplari, mettere quattro vetri autoclavati di vetro da 10 mm scivolano nei quattro inlay del piatto da Petri di 4 pozzetti da 35 mm. </li><li> Per ogni 4 esemplari, miscelare un volume totale di 300 μL composto di seguito in un tubo di microcentrifuga: 10 μL di adesivo tissutale, 285 μL di NaHCO3 e 5 μL di NaOH. </li><li> Mettere 45 μL della soluzione risultante su ciascuna copertura di copertura e lasciarla lì per almeno 20 minuti a RT; Questa soluzione può essere lasciata sul coperchio per diverse ore ma non può essere lasciata O / N. </li><li> Posizionare uno o due piatti da Petri da 4 canali da 35 mm all&#39;interno di un piatto di Petri da 10 cm al fine di creare due barriere contro la contaminazione. </li><li> Preparare il mezzo di coltura contenente il 98% di Dulbecco&#39;s Modified Eagle&#39;s Medium (DMEM), 1% N-2 e 1% ampicillina (65 μL per pozzetto in un tubo centrifugo (micro)). Riscaldare la soluzione a 25 ° C prima dell&#39;uso. </li></ol></li></ol> 2. Dissezione Explorante Cochlear Murina <ol><li> Decapitazione del mouse neonatale <ol><li> Ottenete un piatto di petri di plastica da 60 millimetri e spruzzate il 70% di etanolo nel suo coperchio in modo che la superficie sia bagnata. </li><li> Versare il freddo HBSS dal tubo di laboratorio in plastica nella parte inferiore della plastica da 60 mm e dal piatto di Petri da 50 mm a parete chiara a vetro. Conservare il tubo di laboratorio in plastica e entrambi i piatti di Petri su ghiaccio per mantenere freddo il tessuto ogni volta che non viene disciolto. </li><li> Posizionare un mouse neonatale di età P3 - P5 in ghiaccio in un dito tagliente di un guanto di lattice e attendere che l&#39;ipotermia induca perdita di coscienza (circa 1-3 minuti). </li><li> Decapitate rapidamente il mouse con forbici operative e smalti il ​​corpo nel sacchetto di plastica sigillabile. Mettere la testa di neonato tagliata nella70% di etanolo nel coperchio del piatto di petri di plastica da 60 mm. </li></ol></li><li> Sezione macroscopica dell&#39;osso temporale <ol><li> Rimuove la pelle del cranio facendo un taglio superficiale dall&#39;anteriore all&#39;estremità posteriore (direttamente sulla sutura sagittale) usando la lama del bisturi. </li><li> Tagliare entrambi i canali uditivi esterni con la lama del bisturi e piegare la pelle anteriormente per esporre tutto il cranio. NOTA: sebbene non sia necessario un microscopio di dissezione per questo passaggio, può essere utilizzato per una migliore visualizzazione. </li><li> Aprire il cranio lungo la sutura sagittale utilizzando la lama # 15 a bisturi. Assicurarsi di tagliare il cranio spingendo delicatamente la lama su e giù da anteriore a posteriore per evitare la compressione delle coclee. NOTA: Il cranio non deve essere ossificato in questa età e dovrebbe tagliarsi facilmente. </li><li> Rimuovere e scartare il muso facendo un taglio verticale direttamente posteriore alle orbite usando il bisturi # 15lama. NOTA: la parte posteriore del cranio dovrebbe comunque contenere il cervello e le coclee. </li><li> Smaltire il forebrain, il cervelletto e il tronco cerebrale attraverso una dissezione sbarrata con # 4 pinze. </li></ol></li><li> Estrazione microscopica delle coclee <ol><li> Regolare il microscopio (ingrandimento 6.5X) e la sorgente luminosa mettendo la pinza sotto il campo di applicazione e ottimizzando l&#39;illuminazione e la messa a fuoco. </li><li> Posizionare le due metà del cranio nel piatto di petri di 60 mm riempito con HBSS freddo. </li><li> Completamente esporre la coclea / e, identificabile come adiacente all&#39;arteria stapediale circostante (un&#39;arteria tortuosa all&#39;interno dell&#39;osso temporale) e separare l&#39;organo esternamente dall&#39;oscurità temporale utilizzando # 4 pinze. </li><li> Trasferire la coclea nel piatto di Petri a 50 mm di fondo chiaro e posizionare il piatto sotto il microscopio. </li><li> Posizionare il piatto di petri di plastica da 60 mm con l&#39;altra metà del cranio sul ghiaccio. </li&gt; <li> Rimuovere la coclea dal sistema vestibolare e disciparle attentamente la capsula otterica coclea (tipicamente cartilaginea a questa età) con # 4 pinze. Usa # 55 pinze per tutti i passi successivi. </li></ol></li><li> Fasi finali dell&#39;elaborazione dei tessuti <ol><li> Continuare con l&#39;elaborazione del tessuto interno dell&#39;orecchio separando con attenzione il legamento a spirale aderente all&#39;organo di Corti dal resto della cochlea e dal modiolus usando il micro coltello o due pinze. <ol><li> Tagliare nella zona più scura e traslucida alla fessura tra il legamento a spirale e la regione delle cellule dei capelli e procedere alla successiva rimozione del legamento a spirale afferrandola all&#39;aspetto più basale e delicatamente svolgendola mentre si muove apicamente. </li></ol></li><li> Posizionare il campione per ottenere una vista longitudinale e sagittale della coclea e tagliare la coclea in due o tre sezioni usando il micro coltello, classificando queste sezioni come apicali, (medio) e bAsal gira. Rimuovere il tessuto superiore e inferiore allo strato effettivo di cellule e neuriti di capelli per ottenere un pezzo esplante cocleare che può giacere orizzontalmente sul piatto di Petri. NOTA: Una dimensione appropriata per un&#39;adeguata adesione al piatto di coltura è di circa metà di un giro cocholare. </li><li> Rimuovere la membrana tectoriale, un sottile strato traslucido immediatamente superiore all&#39;organo di Corti, levigandolo delicatamente con le pinze. </li><li> Rimuovere la membrana di Reissner, immediatamente superiori agli SGN, toccandola con le pinze da entrambi i lati e sbucciarla. NOTA: Rimuovere le zone celle danneggiate poste in posizione laterale tagliandole con il micro coltello. </li></ol></li></ol> 3. Trasferimento di esemplari ai piatti della coltura <ol><li> Rimuovere le 45 μL di soluzione adesiva tissutale dai quattro scivoloni di copertura. Lavare ogni copertura con 50 μl di H 2 O sterile. Aspirare l&#39;acqua. </li><li> Prendere la pipetta da 1 ml. Bagnare la punta della pipetta con circa 120 μL di DMEM per evitare che il campione si aderisca all&#39;interno della punta. </li><li> Trasferire i campioni individualmente usando la pipetta da 1 ml. Pipettate un massimo di 70 μl dal piatto petri a base di vetro pieno e parzialmente pieno, chiuso a tinta unita, e posizionare il campione insieme al liquido su uno dei 4 inlay (preparati con coperture) nel piatto Petri da 4 pozzetti . </li><li> Controllare sotto il microscopio (ingrandimento 50X) che il campione è nell&#39;orientamento corretto. Assicurarsi che l&#39;area delle cellule di capelli da cui è stata rimossa la membrana tectoriale sia rivolta verso l&#39;alto. Assicurarsi che la membrana basilare, insieme alla parte basale del modiolus, sia rivestita verso il basso e aderisce alla copertura. <ol><li> Se il campione è orientato verso l&#39;alto durante l&#39;ispezione, depositare l&#39;HBSS che rimane nella punta della pipetta nell&#39;intarsio e riposizionare il pezzo finché non è correttamente orientato. NOTE: Questo impedirà le cellule di capelli di galleggiare nel mezzo di coltura senza supporto strutturale dalla copertura, che potrebbe portare alla degenerazione. </li></ol></li><li> Aspirare l&#39;eccesso di HBSS utilizzando la pipetta da 1 ml. Attendere 15 s. </li><li> Pipettare direttamente sul campione 60 μl del mezzo di coltura caldo preparato (98% DMEM, 1% N-2 e 1% ampicillina). Fare attenzione a non toccare il campione con la pipetta. Sostituire i coperchi piatti di Petri interni ed esterni e incubare O / N a 37 ° C. </li><li> Riporre tutte le soluzioni di riserva nei propri luoghi, smaltire carcasse e residui di rifiuti, decontaminare il tavolo chirurgico secondo linee guida istituzionali ( ad esempio, utilizzando etanolo o ipoclorito), pulire e autoclave gli strumenti e scartare gli arnesi nel contenitore appropriato . </li></ol> 4. Aggiunta di Media Finale e Sostanze di Interesse NOTA: Gli esplosivi cochleari saranno pronti per l&#39;uso dopo 10-16 h. <ol><li> Preparare un miscuglio1% di N-2 e 1% di ampicillina (65 μl per pozzetto in un tubo di microcentrifuga, riscaldare la soluzione a 25 ° C prima dell&#39;uso), del 97% DMEM, 1% di siero di fegato fetale (FBS). </li><li> Aggiungere altre sostanze di interesse alle soluzioni per i rispettivi gruppi di trattamento. Se vengono aggiunte sostanze fluorescenti ( ad es. Virus che esprimono GFP), in una recente pubblicazione è stata utilizzata una concentrazione di 10 10 GC di virus adeno-associati (AAVs) per 48 h in 50 μL) 18 , proteggere da leggero. </li><li> Trasferire dall&#39;incubatore i piatti petri contenenti esplosivi cocleari e posizionarli sotto il cappuccio flusso laminare. </li><li> Aspirare il vecchio mezzo di coltura (senza FBS) con la pipetta dalle intarsi. </li><li> Aggiungere 60 μl per pozzetto del mezzo di preparazione (trattamento) caldo preparato (97% DMEM, 1% FBS, 1% N-2, 1% ampicillina e le sostanze di interesse). </li><li> Posizionare il piatto di Petri nell&#39;incubatore (37 ° C). </li><li> Visualizza rEgularmente sotto il microscopio per individuare segni di contaminazione, migrazione cellulare o distacco dell&#39;esplosione cochleare e eseguire la colorazione dopo un massimo di 7 giorni. </li></ol> 5. Immunofluorescenza - Giorno 1 <ol><li> Preparare la soluzione di blocco (94% di fosfato-tamponato salino (PBS), 5% normale caprino o cavallo di cavallo (NGS / NHS, a seconda degli anticorpi secondari) e 1% di tensioattivo non ionico (vedi tabella dei materiali ) Soluzione anticorpale (98,6% PBS, 1% NHS e 0,4% tensioattivo non ionico con i rispettivi anticorpi). NOTA: Gli anticorpi comprendono anti-Myo7A coniglio a una concentrazione di 1: 400+ (miosina 7A, per le cellule dei capelli interne ed esterne) e mouse anti-TuJ1 1: 200+ (β-tubulina, per SGNs) o topo (IgG1) anti (Densità postsinaptica, per postsynapse) e pollo anti-NF-H 1: 1000+ (neurofilamento, anti-NF-H 1: Per SGN e fibre nervose). &quot;+&quot; MeaNs &quot;o superiore&quot;. </li><li> Aspirare il mezzo di coltura usando una pipetta. Fare attenzione a non toccare il campione. </li><li> Sotto la cappa a flusso laminare, risciacquare due esplosioni cochleari con PBS sterile, posizionando gli esemplari su un agitatore per 5 minuti dopo ogni lavaggio. </li><li> Fissare il tessuto in 4% di paraformaldeide (PFA - CAUTION) per 20 minuti sull&#39;agitatore (sotto la cappa). Aspirare il PFA. </li><li> Applicare 60 μL di PBS agli esplosivi cocleari e posizionare il piatto di Petri su un agitatore per 5 min. Aspirare il PBS. Ripeti 3x. </li><li> Posizionare gli esplosivi cochleari in soluzione di bloccaggio preparato (94% PBS, 5% NHS e 1% di tensioattivo non ionico) per 30 minuti in agitatore. </li><li> Posizionare gli esplosivi cochleari in una soluzione anticorpale di riserva preparata (98,6% PBS, 1% NHS e 0,4% tensioattivo non ionico) con i rispettivi anticorpi primari (vortex prima dell&#39;uso) O / N su un contatore a RT. NOTA: avvolgere i piatti di Petri con gli asciugamani umidi chiusi in un involucro di plastica (o foglio di alluminio se la soluzione aggiuntaIon contiene materiali fluorescenti come i virus che esprimono GFP) per mantenere i piatti umidi e per prevenire l&#39;evaporazione della soluzione anticorpale O / N. </li></ol> 6. Immunofluorescenza - Giorno 2 <ol><li> Preparare la macchia di 4 &#39;, 6-diammino-2-fenilindolo (DAPI) (300 nM) e utilizzare la soluzione anticorpale di riserva per ottenere le corrette miscele anticorpali secondarie complementari agli anticorpi primari del punto 5.1. ( Ad esempio , anti-coniglio caprino 488 1: 200+ e anti-topo caprino 568 1: 200+ ovvero anti-mouse caprino (IgG1) 568 1: 1000+, anti-mouse caprino (IgG2a) 488 1: 500+, E anti-pollo caprino 647 1: 200+ O Phalloidin 568 1: 200+ (per cellule capelli interne ed esterne)). </li><li> Aspirare la soluzione anticorpale primaria. </li><li> Applicare 60 μL di PBS agli esplosivi cocleari e posizionare il piatto di Petri su un agitatore per 5 min. Aspirare il PBS. Ripeti 3x. </li><li> Posizionare gli esplosivi cocleari in soluzione anticorpale di riserva preparata (98,6% PBS, 1% NHS e 0,4% non tensioattivo) con le resAnticorpi secondari pectivi (vortex prima dell&#39;uso) per 1,5 ore su un contatore e proteggendoli dalla luce. </li><li> Aspirare la soluzione anticorpale secondaria e sciacquare gli esplosivi cochleari con una macchia DAPI (mettere su un agitatore per 1 min e poi aspirare). </li><li> Applicare 60 μL di PBS agli esplosivi cocleari e posizionare il piatto di Petri su un agitatore per 5 min. Aspirare il PBS. Ripeti 3x. </li><li> Usare le pinze per rimuovere le copertine con i campioni provenienti dalla piastra a 4 pozzetti, immergetele in un recipiente riempito di H 2 O distillato e asciugare le copertine verticalmente portandole a contatto con gli asciugamani. </li><li> Posizionare una goccia di mezzo di montaggio antifade sullo scivolo del microscopio e invertire le copertine per immergere il tessuto rivolto verso il basso nel mezzo. </li><li> Sigillare la copertura con un lucido chiodo che copre circonferenzialmente il bordo (senza schiacciare il campione sotto il vetro). Lasciare le diapositive che si trovano in una zona coperta lontano dalla luce per 15 - 20 minuti fino a quando non si asciugaLi metterli in una scatola o esaminare sotto il microscopio confocale. NOTA: La colorazione fluorescente è meglio conservata conservando le diapositive a 4 o -20 ° C. </li></ol> 7. Confocal Imaging <ol><li> Ottieni una panoramica e immagini ingrandite per l&#39;organo della regione Corti, comprese le neuriti e gli SGN. NOTA: Impostazioni standard per il processo di imaging: formato di 1.024 x 1.024 pixel, velocità di 400 Hz, media frame di 3, 20% di intensità laser complessiva e di solito 20X e 63X con immersione in olio (potenzialmente combinata con zoom digitale 2X). Le impostazioni dei canali per il protocollo di colorazione DAPI, Myo7A e TuJ1 sono descritte in precedenza: 405 5% DAPI, &quot;Smart Gain&quot; 766,8V, &quot;Smart Offset&quot; 0,0% - 488 15% fluoresceina isotiocianato (FITC), Smart Gain 622,2V , &quot;Smart Offset&quot; 0,0% - 561 13% tetrametilrhomadina isotiocianato (TRITC), &quot;Smart Gain&quot; 562,4V, &quot;Smart Offset&quot; 0,0%. </li><li> Unire le immagini in una z-stack usando il tastoSoftware per ottenere una proiezione di asse z. </li></ol>

<ol><li>Mathers, C., Smith, A., Concha, M. Global burden of hearing loss in the year. World Health Organization (WHO). , Available from: 
 <a target="_blank" href="http://www.who.int/healthinfo/statistics/bod_hearingloss.pdf">http://www.who.int/healthinfo/statistics/bod_hearingloss.pdf</a> (2000).</li>
<li>Geleoc, G. S., Holt, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sound+strategies+for+hearing+restoration%29%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Sound strategies for hearing restoration).</a> Science. 344 (6184), 1241062(2014).</li>
<li>Kujawa, S. G., Liberman, M. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Acceleration+of+age-related+hearing+loss+by+early+noise+exposure%3A+evidence+of+a+misspent+youth%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Acceleration of age-related hearing loss by early noise exposure: evidence of a misspent youth.</a> J Neurosci. 26 (7), 2115-2123 (2006).</li>
<li>Kujawa, S. G., Liberman, M. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Adding+insult+to+injury%3A+cochlear+nerve+degeneration+after+%26%2334%3Btemporary%26%2334%3B+noise-induced+hearing+loss%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Adding insult to injury: cochlear nerve degeneration after &#34;temporary&#34; noise-induced hearing loss.</a> J Neurosci. 29 (45), 14077-14085 (2009).</li>
<li>Makary, C. A., Shin, J., Kujawa, S. G., Liberman, M. C., Merchant, S. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Age-related+primary+cochlear+neuronal+degeneration+in+human+temporal+bones%5BTitle%5D)+AND+%22J+Assoc+Res+Otolaryngol%22%5BJournal%5D)">Age-related primary cochlear neuronal degeneration in human temporal bones.</a> J Assoc Res Otolaryngol. 12 (6), 711-717 (2011).</li>
<li>Jensen, J. B., Lysaght, A. C., Liberman, M. C., Qvortrup, K., Stankovic, K. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Immediate+and+delayed+cochlear+neuropathy+after+noise+exposure+in+pubescent+mice%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Immediate and delayed cochlear neuropathy after noise exposure in pubescent mice.</a> PLoS One. 10 (5), (2015).</li>
<li>Landegger, L. D., Psaltis, D., Stankovic, K. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+audiometric+thresholds+do+not+predict+specific+cellular+damage+in+the+inner+ear%5BTitle%5D)+AND+%22Hear+Res%22%5BJournal%5D)">Human audiometric thresholds do not predict specific cellular damage in the inner ear.</a> Hear Res. , 83-93 (2016).</li>
<li>Wang, H. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Spontaneous+Activity+of+Cochlear+Hair+Cells+Triggered+by+Fluid+Secretion+Mechanism+in+Adjacent+Support+Cells%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Spontaneous Activity of Cochlear Hair Cells Triggered by Fluid Secretion Mechanism in Adjacent Support Cells.</a> Cell. 163 (6), 1348-1359 (2015).</li>
<li>Barclay, M., Ryan, A. F., Housley, G. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Type+I+vs+type+II+spiral+ganglion+neurons+exhibit+differential+survival+and+neuritogenesis+during+cochlear+development%5BTitle%5D)+AND+%22Neural+Dev%22%5BJournal%5D)">Type I vs type II spiral ganglion neurons exhibit differential survival and neuritogenesis during cochlear development.</a> Neural Dev. 6, (2011).</li>
<li>Dinh, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Short+interfering+RNA+against+Bax+attenuates+TNFalpha-induced+ototoxicity+in+rat+organ+of+Corti+explants%5BTitle%5D)+AND+%22Otolaryngol+Head+Neck+Surg%22%5BJournal%5D)">Short interfering RNA against Bax attenuates TNFalpha-induced ototoxicity in rat organ of Corti explants.</a> Otolaryngol Head Neck Surg. 148 (5), 834-840 (2013).</li>
<li>Mazurek, B., Yu, Y., Haupt, H., Szczepek, A. J., Olze, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Salicylate+modulates+Hsp70+expression+in+the+explanted+organ+of+Corti%5BTitle%5D)+AND+%22Neurosci+Lett%22%5BJournal%5D)">Salicylate modulates Hsp70 expression in the explanted organ of Corti.</a> Neurosci Lett. 501 (2), 67-71 (2011).</li>
<li>Kao, S. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Loss+of+osteoprotegerin+expression+in+the+inner+ear+causes+degeneration+of+the+cochlear+nerve+and+sensorineural+hearing+loss%5BTitle%5D)+AND+%22Neurobiol+Dis%22%5BJournal%5D)">Loss of osteoprotegerin expression in the inner ear causes degeneration of the cochlear nerve and sensorineural hearing loss.</a> Neurobiol Dis. 56, 25-33 (2013).</li>
<li>Jan, T. A., Chai, R., Sayyid, Z. N., Cheng, A. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolating+LacZ-expressing+cells+from+mouse+inner+ear+tissues+using+flow+cytometry%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Isolating LacZ-expressing cells from mouse inner ear tissues using flow cytometry.</a> J Vis Exp. (58), e3432(2011).</li>
<li>Haque, K. D., Pandey, A. K., Kelley, M. W., Puligilla, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Culture+of+embryonic+mouse+cochlear+explants+and+gene+transfer+by+electroporation%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Culture of embryonic mouse cochlear explants and gene transfer by electroporation.</a> J Vis Exp. (95), e52260(2015).</li>
<li>Parker, M., Brugeaud, A., Edge, A. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Primary+culture+and+plasmid+electroporation+of+the+murine+organ+of+Corti%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Primary culture and plasmid electroporation of the murine organ of Corti.</a> J Vis Exp. (36), (2010).</li>
<li>Mulvaney, J. F., Dabdoub, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Long-term+time+lapse+imaging+of+mouse+cochlear+explants%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Long-term time lapse imaging of mouse cochlear explants.</a> J Vis Exp. (93), e52101(2014).</li>
<li>Wang, Q., Green, S. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Functional+role+of+neurotrophin-3+in+synapse+regeneration+by+spiral+ganglion+neurons+on+inner+hair+cells+after+excitotoxic+trauma+in+vitro%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Functional role of neurotrophin-3 in synapse regeneration by spiral ganglion neurons on inner hair cells after excitotoxic trauma in vitro.</a> J Neurosci. 31 (21), 7938-7949 (2011).</li>
<li>Landegger, L. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+synthetic+AAV+vector+enables+safe+and+efficient+gene+transfer+to+the+mammalian+inner+ear%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">A synthetic AAV vector enables safe and efficient gene transfer to the mammalian inner ear.</a> Nat Biotechnol. 35 (3), 280-284 (2017).</li>
<li>Dilwali, S., Landegger, L. D., Soares, V. Y., Deschler, D. G., Stankovic, K. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Secreted+Factors+from+Human+Vestibular+Schwannomas+Can+Cause+Cochlear+Damage%5BTitle%5D)+AND+%22Sci+Rep%22%5BJournal%5D)">Secreted Factors from Human Vestibular Schwannomas Can Cause Cochlear Damage.</a> Sci Rep. 5, 18599(2015).</li>
<li>Soares, V. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Extracellular+vesicles+derived+from+human+vestibular+schwannomas+associated+with+poor+hearing+damage+cochlear+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Neuro+Oncol%22%5BJournal%5D)">Extracellular vesicles derived from human vestibular schwannomas associated with poor hearing damage cochlear cells.</a> Neuro Oncol. , (2016).</li>
<li>Tong, M., Brugeaud, A., Edge, A. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Regenerated+synapses+between+postnatal+hair+cells+and+auditory+neurons%5BTitle%5D)+AND+%22J+Assoc+Res+Otolaryngol%22%5BJournal%5D)">Regenerated synapses between postnatal hair cells and auditory neurons.</a> J Assoc Res Otolaryngol. 14 (3), 321-329 (2013).</li>
<li>Yuan, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ouabain-induced+cochlear+nerve+degeneration%3A+synaptic+loss+and+plasticity+in+a+mouse+model+of+auditory+neuropathy%5BTitle%5D)+AND+%22J+Assoc+Res+Otolaryngol%22%5BJournal%5D)">Ouabain-induced cochlear nerve degeneration: synaptic loss and plasticity in a mouse model of auditory neuropathy.</a> J Assoc Res Otolaryngol. 15 (1), 31-43 (2014).</li>
<li>Fernandez, K. A., Jeffers, P. W., Lall, K., Liberman, M. C., Kujawa, S. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Aging+after+noise+exposure%3A+acceleration+of+cochlear+synaptopathy+in+%26%2334%3Brecovered%26%2334%3B+ears%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Aging after noise exposure: acceleration of cochlear synaptopathy in &#34;recovered&#34; ears.</a> J Neurosci. 35 (19), 7509-7520 (2015).</li>
<li>Barclay, M., Constable, R., James, N. R., Thorne, P. R., Montgomery, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Reduced+sensory+stimulation+alters+the+molecular+make-up+of+glutamatergic+hair+cell+synapses+in+the+developing+cochlea%5BTitle%5D)+AND+%22Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Reduced sensory stimulation alters the molecular make-up of glutamatergic hair cell synapses in the developing cochlea.</a> Neuroscience. , 50-62 (2016).</li>
<li>Zinn, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+Silico+Reconstruction+of+the+Viral+Evolutionary+Lineage+Yields+a+Potent+Gene+Therapy+Vector%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Rep%22%5BJournal%5D)">In Silico Reconstruction of the Viral Evolutionary Lineage Yields a Potent Gene Therapy Vector.</a> Cell Rep. 12 (6), 1056-1068 (2015).</li>
<li>Wu, Z., Yang, H., Colosi, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effect+of+genome+size+on+AAV+vector+packaging%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Ther%22%5BJournal%5D)">Effect of genome size on AAV vector packaging.</a> Mol Ther. 18 (1), 80-86 (2010).</li>
<li>Shu, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+of+Adeno-Associated+Viral+Vectors+That+Target+Neonatal+and+Adult+Mammalian+Inner+Ear+Cell+Subtypes%5BTitle%5D)+AND+%22Hum+Gene+Ther%22%5BJournal%5D)">Identification of Adeno-Associated Viral Vectors That Target Neonatal and Adult Mammalian Inner Ear Cell Subtypes.</a> Hum Gene Ther. , (2016).</li>
<li>Kao, S. Y., Soares, V. Y., Kristiansen, A. G., Stankovic, K. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Activation+of+TRAIL-DR5+pathway+promotes+sensorineural+degeneration+in+the+inner+ear%5BTitle%5D)+AND+%22Aging+Cell%22%5BJournal%5D)">Activation of TRAIL-DR5 pathway promotes sensorineural degeneration in the inner ear.</a> Aging Cell. 15 (2), 301-308 (2016).</li>
</ol>

Gli autori non hanno niente da rivelare.

I ricercatori devono perfezionare la tecnica di dissezione prima di effettuare esperimenti che implicano esplosioni cochleari. Le cellule dei capelli sono comunemente danneggiate durante le dissezione eseguite presto nella curva di apprendimento e un momento particolarmente problematico per la loro integrità è la rimozione della membrana tectoria, che richiede mani costanti, strumenti e esperienze adeguate. Per risparmiare tempo e risorse, è necessario eseguire un controllo visivo sotto il microscopio di dissezione e si...

Perdita uditiva sensoriale (SNHL) riflette danni all&#39;orecchio interno o al percorso uditivo ascendente. Mentre la perdita dell&#39;udito è il disordine sensoriale più comune nell&#39;uomo 1 , non esistono ancora terapie curative 2 . Sebbene gli impianti cerebrali cocleari o uditivi possono ristabilire un certo grado di udito ai pazienti con SNHL grave o profonda, l&#39;udienza fornita da questi dispositivi è ancora molto diversa da quella uditiva &quot;naturale&quot;, specialmente durante i tentativi di comprendere il rumore del suono o di ascoltare la musica. Mentre la degenerazione delle cellule di capelli è da tempo considerata la principale conseguenza degli eventi uditivi traumatici ( es. Esposizione a rumori elevati), vi è una crescente evidenza che le sinapsi che trasmettono informazioni dalle cellule dei capelli al nervo uditivo sono almeno altrettanto vulnerabili al trauma acustico 3 , 4 , 5 </sup<html> &gt; , 6 . Poiché le soglie audiometriche umane, l&#39;attuale standard oro per la valutazione della funzione uditiva, non prevedono danni cellulari specifici nell&#39;orecchio interno, sono necessari strumenti più raffinati per rilevare la degenerazione cellulare quanto prima e per avviare un trattamento adeguato 7 . I trattamenti farmaceutici promettenti per la perdita dell&#39;udito sono spesso testati in culture cellulari omogenee in vitro , ma tali sistemi non modellano in modo preciso il microambiente cocleare. Le cellule cochleari sono noti per secernere fattori trofici che influenzano altri tipi di cellule all&#39;interno della coclea 8 , 9 , un processo cruciale in vivo che si perde quando l&#39;organo di Corti 10 , 11 o Neuroni Ganglionici Spirali (SGNs) 12 viene coltivato in isolamento o quando Vengono analizzati i marcatori molecolariTuttavia, studi in vivo che possono essere necessari per la convalida dei dati in vitro per stabilire nuovi trattamenti personalizzati per la perdita dell&#39;udito nel perseguimento della &quot;medicina di precisione&quot; richiedono risorse e tempi significativi. Quanto sforzo è necessario per perfezionare e realizzare iniezioni a membrana di orecchio medio o rotondo con test uditivi e la successiva dissezione di cochleari integrali. L&#39;efficace screening dei composti promettenti nelle colture ex vivo organotipiche noti come esplosioni cochleari fornisce un&#39;alternativa economica e affidabile 14 , 15 , 16 , 17 . Questo articolo descrive un protocollo per generare, mantenere e valutare gli esplosivi cocleari trattati. Le applicazioni specifiche per questo modello vengono enfatizzate, tra cui l&#39;utilizzo nell&#39;ambito dello screeningDi composti potenzialmente terapeutici e la valutazione comparativa dei vettori virali per la terapia genica. Un approccio esplosivo ex vivo consente ai ricercatori di visualizzare gli effetti di un dato trattamento su diverse popolazioni cellulari in situ , facilitando l&#39;identificazione dei meccanismi specifici di tipo cellulare e la successiva affinamento di terapie mirate. Nel complesso, questa tecnica fornisce un modello per studiare la coclea ex vivo , preservando la conversazione vitale tra i diversi tipi di cellule che coesistono all&#39;interno della coclea.

<table><tbody><tr><td>Ampicillina, sale sodico</td><td>Invitrogen</td><td>11593-027</td><td></td></tr><tr><td>anticorpo anti-CtBP2, anticorpo di topo (IgG1)</td><td>BD Transduction Laboratories</td><td>612044</td><td></td></tr><tr><td>anticorpo anti-Myo7A, coniglio</td><td>Proteus Biosciences</td><td>25-6790</td><td></td></tr><tr><td>anticorpo anti-NF-H, pollo</td><td>EMD Millipore</td><td>AB5539</td><td></td></tr><tr><td>anticorpo anti-PSD95, topo (IgG2a)</td> <td>Anticorpi Inc.</td><td>Anticorpo anti-TuJ1 75-028</td><td></td></tr>, adesivo per cellule e tessuti <tr><td></td><td>BioLegend</td><td>801202</td><td></td></tr><tr><td>Cell-Tak, 5 mg</td> di provette per centrifuga <td>Corning</td><td>354241</td><td></td></tr><tr><td>CELLSTAR da 15 mL, fondo conico, graduazione, piatto sterile</td> per colture cellulari <td>Greiner Bio-One</td><td>188161</td><td></td></tr><tr><td>CELLSTAR, 100 x 20 mm</td><td>Greiner Bio-One</td><td>664160</td><td></td></tr><tr><td>Piatto per colture cellulari CELLSTAR, 35 x 10 mm, 4 anelli interni</td><td>Greiner Bio-One</td><td>627170</td><td></td></tr><tr><td>Piatto per colture cellulari CELLSTAR, 60 x 15 mm</td><td>Greiner Bio-One</td><td>628160</td><td></td></tr><tr><td>Provette per centrifuga CELLSTAR 50 mL, fondo conico, graduazione, sterile</td><td>Greiner Bio-One</td><td>227261</td><td></td></tr><tr><td>smalto per unghie trasparente</td><td>Microscopia elettronica</td><td>Sciences 72180</td><td></td></tr><tr><td>Piatti con fondo in vetro da parete trasparente (vetro 40 mm), PELCO&reg;, manicotto/20, 50 x 7 mm</td><td>Ted Pella Inc.</td><td>14027-20</td><td></td></tr><tr><td>Vetrini, Rotondo, Vetro, Diametro 10 mm, Spessore #1, 0,13 - 0,16 mm</td><td>Ted Pella Inc.</td><td></td><td></td>260368</tr><tr><td>DAPI (4',6-Diamidino-2-Fenilindolo, Dicloridrato)</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>D1306</td><td></td></tr><tr><td>Acqua distillata, 500 mL</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>15230-162&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Dulbecco's Modified Eagle's Medium (DMEM), alto glucosio, piruvato, senza glutammina, 500 mL</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>10313-039</td><td></td></tr><tr><td>Dumont #4 Forcipe</td><td>Fine Science Tools</td><td>11241-30</td><td></td></tr><tr><td>Dumont #55 Forcipe (Dumostar)</td><td>Fine Science Tools</td><td>11295-51</td><td></td></tr><tr><td>Alcool etilico (EtOH), puro, 200 proof, anidro, &ge; 99,5%</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>459836-1L</td><td></td></tr><tr><td>Siero fetale bovino (FBS), qualificato, regioni approvate dall'USDA, 500 ml</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>10437-028&nbsp;</td><td>Aliquotare in provette da 50 mL e conservare a -20&deg; C congelatore</td></tr><tr><td>capra anti-pollo-647 anticorpo secondario</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>A-21469</td><td></td></tr><tr><td>capra anti-topo (IgG)-568 anticorpo secondario</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>A-11004</td><td></td></tr><tr><td>capra anti-topo (IgG1) -568 anticorpo secondario</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>A-21124</td><td></td></tr><tr><td>capra anti-topo (IgG2a) -488 anticorpo secondario</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>A-21131</td><td></td></tr><tr><td>capra anti-coniglio-488 anticorpo secondario</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>R37116</td><td></td></tr><tr><td>H2O, sterile, EmbryoMax Ultra Pure Water, 500 mL</td><td>EMD Millipore</td><td>TMS-006-B</td><td></td></tr><tr><td>Hank's Balanced Salt Solution (HBSS), calcio, magnesio, senza fenolo, 500 mL</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>14025-092</td><td></td></tr><tr><td>Vassoio strumenti con coperchio Coltello</td> Micro (dissezione) <td>Mountainside Medical</td><td>TechMed4255</td><td></td>in acciaio inossidabile</tr><tr><td>- angolato di 30 gradi</td><td>Fine Science Tools</td><td>10056-12</td><td></td></tr><tr><td>Vetrini per microscopio, VistaVision, codice colore, 75 x 25 mm (3 x 1"), spessore 1 mm, bianco, confezione da 72</td><td>VWR</td><td>16004-382</td><td></td></tr><tr><td>N-2 Supplement (100X), 5 mL</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>17502-048</td><td></td></tr><tr><td>NaHCO3, Bicarbonato di sodio soluzione al 7,5%, 100 mL</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>25080-094</td><td></td></tr><tr><td>NaOH, soluzione di idrossido di sodio, 1 L Thermo</td><td>Fisher Scientific</td><td>SS266-1</td><td></td></tr><tr><td>Siero normale per cavalli (NHS)</td><td>Invitrogen</td><td>16050130</td><td></td></tr><tr><td>Forbici operatorie</td><td>Roboz Surgical Instruments Co.</td><td>RS-6806</td><td></td></tr><tr><td>Paraformaldeide (PFA), grado di reagente, cristallino</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P6148</td><td>Prima dell'uso: Stabilire procedure operative standard basate sui protocolli disponibili online</td></tr><tr><td>PBS, pH 7,4, 500 mL</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>10010-023&nbsp;</td><td>Autoclave prima dell'uso</td></tr><tr><td>Falloidina, Alexa Fluor 568&nbsp;</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>A12380</td><td></td></tr><tr><td>Tampone di preparazione, non sterile&nbsp;</td><td>Medline</td><td>05136CS</td><td></td></tr><tr><td>Provette per microcentrifuga Safe-Lock, polipropilene, 0,5 mL</td><td>Autoclave Eppendorf</td><td>022363719</td><td>prima dell'uso</td></tr><tr><td>Provette per microcentrifuga Safe-Lock, polipropilene, 1,5 mL</td><td>Autoclave Eppendorf</td><td>022363204</td><td>prima dell'uso</td></tr><tr><td>Lame per bisturi - #15</td><td>Fine Science Tools</td><td>10015-00</td><td></td></tr><tr><td>Manico per bisturi - #4</td><td>Fine Science Tools</td><td>10004-13</td><td></td></tr><tr><td>Stereomicroscopio Stemi 2000-C</td><td>Zeiss</td><td>000000-1106-133</td><td></td></tr><tr><td>Microscopio confocale TCS SP5</td><td>Leica</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>Triton-X (tensioattivo non ionico)</td><td>Integra</td><td>T756.30.30</td><td></td></tr><tr><td>Mezzo di montaggio antisbiadimento VectaShield per fluorescenza</td><td>Vector Laboratories, Inc.</td>Borsa <td>con cerniera H-1000</td><td></td></tr><tr><td>, richiudibile, 4 x 6'' - 2 mm di spessore</td><td>Zipline</td><td>0609132541599</td><td></td></tr></tbody></table>

neonatal murine cochlear explant technique come un<em&gt; in vitro</em&gt; strumento di screening nella ricerca acustica

Neonatal Murine Cochlear Explant Technique as an In Vitro Screening Tool in Hearing Research

Mentre negli ultimi decenni sono stati notevoli progressi nella ricerca uditiva, non esiste ancora cura per la perdita di udito sensoriale (SNHL), una condizione che tipicamente comporta danni o perdite delle delicate strutture meccanosensoriali dell&#39;orecchio interno. Nel corso degli ultimi anni sono emersi sofisticati esami in vitro e ex vivo, che hanno permesso lo screening di un numero crescente di composti potenzialmente terapeutici, minimizzando le risorse e accelerando gli sforzi per sviluppare cure per SNHL. Sebbene colture omogenee di alcuni tipi di cellule continuino a svolgere un ruolo importante nella ricerca attuale, molti scienziati ora si affidano a culture organotipiche più complesse di orecchie interne murine, noti anche come esplorazioni cochleari. La conservazione delle strutture cellulari organizzate all&#39;interno dell&#39;orecchio interno facilita la valutazione in situ di vari componenti dell&#39;infrastruttura coclea, comprese le cellule dei capelli interni ed esterni, i neuroni dei gangli spirali, i neurE supportare le cellule. Qui presentiamo la preparazione, la cultura, il trattamento e l&#39;immunostaining di esplosioni cochleari murine neonatali. L&#39;attenta preparazione di questi esplosivi facilita l&#39;individuazione di meccanismi che contribuiscono alla SNHL e costituisce uno strumento prezioso per la comunità di ricerca uditiva.

Mentre molti protocolli si concentrano sull&#39;organo di Corti explants, questa tecnica tenta di preservare l&#39;anatomia dell&#39;intero turno cochleare, inclusi gli SGN. Questo dà ai ricercatori l&#39;opportunità di analizzare gli effetti di un dato trattamento sulle neuriti e sulla somata di SGN oltre all&#39;organo di Corti. Effettuare una dissezione che conserva parte del modiolus, come descritto qui, è più tecnicamente impegnativo che esplodere l&#39;organo di Corti da solo. Tutt...

L&#39;obiettivo di questo protocollo è quello di dimostrare la preparazione, la cultura, il trattamento e l&#39;immunostaining di esplosivi cochleari murine neonatali. La tecnica può essere utilizzata come uno strumento di screening in vitro nella ricerca uditiva.

Neonatal Murine Cochlear Explant Technique come un<em&gt; In vitro</em&gt; Strumento di screening nella ricerca acustica

While there have been remarkable advances in hearing research over the past few decades, there is still no cure for Sensorineural Hearing Loss (SNHL), a ...

L'obiettivo generale di questa procedura è la preparazione, coltura, trattamento e immunomarcatura di espianti cocleari murini neonatali da utilizzare come strumento di screening in vitro nella ricerca sull'udito. Questo metodo può contribuire a rispondere a domande fondamentali nel campo della ricerca sull'udito, come permettere lo studio simultaneo di cellule ciliate cocleari, sinapsi, neuriti e neuroni in un modello ex vivo e fornire informazioni sui meccanismi d'azione di molecole nuove per la coclea, inclusi fattori presenti nelle secrezioni umane. Il principale vantaggio di questa tecnica è che il processo di screening di composti terapeutici candidati può essere accelerato prima del loro test in vivo.Iniziare con una testa di neonato appena raccolta, contenuta in etanolo al 70% nel coperchio di una piastra di Petri. Utilizzare una lama di bisturi per effettuare un taglio superficiale nella pelle dall'estremità anteriore a quella posteriore del cranio. Quindi tagliare entrambi i condotti uditivi esterni e ripiegare la pelle anteriormente per esporre l'intero cranio.Successivamente, aprire il cranio lungo la sutura sagittale muovendo delicatamente la lama del bisturi dall'alto verso il basso, in direzione antero-posteriore, per evitare la compressione della coclea. Rimuovere e scartare il muso effettuando un taglio verticale immediatamente posteriore alle orbite. La parte posteriore del cranio dovrebbe ancora contenere il cervello e la coclea.Quindi utilizzare 4 pinzette per dissezionare in modo ottuso ed eliminare il proencefalo, il cervelletto e il tronco encefalico. Posizionare le due metà del cranio in una piastra di Petri di plastica da 60 millimetri riempita con HBSS freddo. Quindi utilizzare 4 pinzette per esporre completamente la coclea, che è adiacente all'arteria stapediale circostante, e separare in modo ottuso l'organo dall'osso temporale.Trasferire il coclea in una piastra di Petri da 50 millimetri con fondo in vetro trasparente contenente HBSS e posizionare la piastra sotto il microscopio. Mettere la piastra di Petri in plastica da 60 millimetri con l'altra metà del cranio sul ghiaccio. Successivamente, utilizzare 4 pinzette per dissezionare con attenzione la capsula otica del coclea.Ora, utilizzare un microbisturi o due pinzette da 55 forze per separare con attenzione il legamento spirale, aderente all'organo del Corti, dal resto della coclea e dal medialis. Questa operazione può essere eseguita afferrando il legamento spirale nella sua parte più basale e svolgendolo delicatamente mentre ci si sposta in direzione apicale. Dopo aver rimosso il legamento spirale, posizionare il campione in modo da ottenere una vista sagittale longitudinale della coclea.Quindi tagliare la coclea in due o tre sezioni utilizzando il microbisturi, classificando queste sezioni come giri apicale e basale. Rimuovere il tessuto superiore per il frammento più apicale e quello inferiore per il frammento più basale, fino allo strato effettivo di cellule ciliate e neuriti, in modo da permettere all'espianto cocleare di adagiarsi orizzontalmente sulla piastra di Petri. Successivamente, utilizzare la pinzetta per afferrare delicatamente e staccare la membrana tettoria, un sottile strato traslucido immediatamente superiore all'organo del Corti.Il passaggio tecnicamente più complesso è probabilmente la rimozione della sottile membrana tettoria traslucida, poiché si rischia facilmente di danneggiare le cellule ciliate sottostanti. Partendo dai margini del tessuto, si preservano le cellule ciliate lungo tutta la lunghezza dell'espianto, ad eccezione del bordo estremo in cui è iniziata la rimozione della membrana tettoria. Infine, rimuovere la membrana di Reissner immediatamente superiore ai neuroni del ganglio spirale toccandola con la pinzetta su entrambi i lati e staccandola. Il campione cocleare è ora pronto per la coltura, dopo aver rimosso eventuali aree danneggiate ai margini. Iniziare la procedura di coltura bagnando la punta di una pipetta da un millilitro con circa 120 microlitri di DMEM per evitare che l'espianto aderisca all'interno della punta. Utilizzare quindi la punta pre-umidificata per pipettare un massimo di 70 microlitri dalla piastra di Petri con fondo in vetro e posizionare il campione insieme al liquido su uno dei quattro inserti presenti nella piastra di Petri a quattro pozzetti.Verificare al microscopio che l'espianto sia nella corretta orientazione. Assicurarsi che la zona di cellule ciliate da cui è stata rimossa la membrana tettoriale sia rivolta verso l'alto e che la membrana basilare insieme alla parte basale tagliata della medialis sia rivolta verso il basso e aderisca al frammento di coprivetrino. Se al controllo il campione risulta orientato al contrario, come mostrato qui, aggiungere HBSS dalla punta della pipetta e riposizionare il frammento finché non sarà correttamente orientato.Una volta che l'espianto è correttamente orientato, aspirare l'eccesso di HBSS e attendere 15 secondi. Successivamente, pipettare 60 microlitri di mezzo di coltura caldo direttamente sul campione, avendo cura di non toccare il campione con la pipetta. Riposizionare i coperchi interno ed esterno della piastra di Petri e incubare tutta la notte a 37 gradi Celsius.Il giorno successivo, trasferire l'espianto cocleare contenuto nelle piastre di Petri dall'incubatore all'armadietto a flusso laminare. Aspirare il vecchio mezzo di coltura privo di FBS dall'inserito. Aggiungere 60 microlitri per pozzetto del mezzo di trattamento preparato e riscaldato.Riposizionare la piastra di Petri nell'incubatore fino alla colorazione delle colture dopo un massimo di sette giorni. Come mostrato in questa immagine confocale, questa tecnica preserva l'anatomia dell'intero giro cocleare, inclusi i neuroni del ganglio spirale o SGN, permettendo l'analisi degli effetti del trattamento sui neuriti e sui somi dei SGN oltre all'organo del Corti. Come mostrato qui, questi espianti possono essere utilizzati per confrontare simultaneamente l'effetto del trattamento sui giri apicale e basale dopo colorazione immunofluorescente.I recettori uditivi sono mostrati in verde e le strutture neuronali appaiono in rosso. Le sinapsi integre possono essere valutate mediante etichettatura delle proteine pre-sinaptiche mostrate in rosso e delle proteine post-sinaptiche mostrate in verde, insieme alla colorazione delle strutture neuronali in blu. Questa figura mostra immagini rappresentative di espianti cocleari apicali e basali dopo sette giorni di coltura, con 3% FBS a sinistra o 1% FBS a destra.Le cellule incubate in FBS al 3% iniziano a migrare tra il quarto e il quinto giorno, come indicato dalle frecce grigio chiaro per le cellule ciliate e dalle frecce rosse per i neuriti. Gli espianti in FBS all'1% mantengono l'integrit&agrave; organizzativa fino al settimo giorno. Durante il tentativo di questa procedura, &egrave; importante ricordare di verificare visivamente l'integrit&agrave; strutturale e l'orientamento del tessuto cocleare prima di aggiungere il mezzo di coltura finale e le sostanze di interesse.Seguendo questa procedura, è possibile eseguire una ricostruzione tridimensionale per confermare la localizzazione specifica per tipo cellulare delle cellule che esprimono GFP all'interno del medialis.

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Questa procedura descrive un metodo per l'isolamento e la cultura dell'organo murino di Corti con o senza il limbus spirale e dei neuroni del ganglio spirale. Abbiamo anche dimostrare un metodo per l'espressione di un gene esogeno giornalista nell'organo di Corti espianto di elettroporazione.

Cultura primaria e elettroporazione plasmidi dell&#39;Organo murini di Corti.

L'orecchio interno è un topo placode derivato il cui organo sensoriale per lo sviluppo del programma è elaborato durante la gestazione. Definiamo...

Gene Transfer per l&#39;orecchio del mouse Sviluppo Inner<em&gt; In Vivo</em&gt; Elettroporazione

Immagini dal vivo della coclea embrionale dei mammiferi è impegnativo, perché i processi di sviluppo a portata di mano operano su un gradiente temporale nell'arco di dieci giorni. Qui vi presentiamo un metodo per la coltura e quindi l'imaging embrionale dei tessuti espianto cocleare preso da un topo reporter fluorescente in cinque giorni.

A lungo termine Time Lapse Imaging del mouse cocleari Espianti

Presentiamo un metodo che descrive l'isolamento e la coltura di espianti cocleari dall'orecchio interno di topo embrionale.  Dimostriamo anche un metodo per il trasferimento genico in espianti cocleari tramite elettroporazione a onda quadra. La coltura di espianti in vitro abbinata alla tecnica di trasferimento genico consente ai ricercatori di studiare gli effetti dell'alterazione dell'espressione genica durante lo sviluppo.

Cultura della embrionali di topo cocleari espianti e Gene Transfer con elettroporazione

Esistono vari metodi per introdurre agenti ototossici nelle coclee dei modelli animali. Viene presentato un protocollo chirurgico per la somministrazione di agenti ototossici alla nicchia della finestra rotonda. La procedura è affidabile, crea lesioni intra-cocleari mirate ed evita danni meccanici alla microarchitettura. È possibile l'esame dell'autoriparazione/rigenerazione cocleare.

L&#39;approccio del mouse Round-finestra per ototossico Delivery Agent: Una rapida e tecnica affidabile per indurre la degenerazione delle cellule Cochlear

In questo studio, descriviamo l'approccio del canale semicircolare posteriore come un metodo affidabile per la consegna del gene dell'orecchio interno in topi neonatali. Indichiamo che consegna del gene attraverso il canale semicircolare posteriore è in grado di irrorare l'intero orecchio interno.

Approccio del canale semicircolare posteriore per consegna del Gene dell'orecchio interno in Mouse neonatale

Modelli animali di impianti cocleari possono far progredire le conoscenze delle basi tecnologiche di trattare la perdita permanente dell'udito neuro-sensoriale con stimolazione elettrica. Questo studio presenta un protocollo chirurgico per assordante acuta e l'impianto cocleare di un array di elettrodi in topi come pure la valutazione funzionale con risposta uditiva del tronco cerebrale.

Chirurgia di impianto cocleare e registrazioni di risposta elettricamente evocate uditive del tronco cerebrale in topi C57BL/6

Questo articolo presenta un metodo di preparazione della superficie cocleare modificato che richiede la decalcificazione e l'uso di un adesivo per cellule e tessuti per aderire i pezzi di epitemi cocleari a 10 mm rotondi schede di copertura per l'immunostochimica nelle cocleee di topo adulto.

Preparazione della superficie cocleare nel topo adulto

Il pulcino è un organismo modello economico, accessibile e ampiamente disponibile per una varietà di studi. Qui, una serie di protocolli è dettagliata per comprendere i meccanismi molecolari alla base dello sviluppo e della rigenerazione dell'orecchio interno aviario.

Metodi Ovo ed Ex Ovo per studiare lo sviluppo dell'orecchio interno aviario

Il protocollo attuale aggiorna i protocolli precedenti e incorpora approcci relativamente semplici per la coltura di espianti cocleari di alta qualità. Ciò fornisce un'acquisizione dati affidabile e immagini ad alta risoluzione in cellule vive e fisse. Questo protocollo supporta la tendenza in corso nello studio delle cellule dell'orecchio interno.

Espianti cocleari neonatali interi come modello in vitro

In questo articolo, presentiamo un protocollo dettagliato per l'isolamento e la coltura di cellule ciliate cocleari primarie dai topi. Inizialmente, l'organo di Corti è stato sezionato da coclee murine neonatali (di 3-5 giorni) al microscopio. Successivamente, le cellule sono state digerite enzimaticamente in una sospensione unicellulare e identificate utilizzando l'immunofluorescenza dopo diversi giorni in coltura.

Isolamento e coltura di cellule ciliate cocleari primarie da topi neonatali

Impara la tecnica degli esplanti cocleari neonatali murini per la ricerca sull'udito. Questo metodo consente lo screening in vitro di composti terapeutici candidati prima dei test in vivo.

Neonatal Murine Cochlear Explant Technique come un

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