Isolamento della popolazione Side di Myc-indotta delle cellule T leucemia linfoblastica acuta in Zebrafish

L'obiettivo generale di questa procedura è isolare le cellule della popolazione laterale da un modello di zebrafish di leucemia linfoblastica acuta a cellule T indotta da myc. Il saggio della popolazione laterale è stato utilizzato per identificare popolazioni di cellule staminali e progenitrici in molti tessuti normali e tumorali. Ma non è ancora stato applicato a nessun modello di cancro del pesce zebra.

Il vantaggio principale di questa tecnica è che consente l'isolamento prospettico di una popolazione di cellule nella T-ALL del pesce zebra che può essere arricchita per l'attività delle cellule staminali tumorali. Sebbene il metodo che descriviamo qui abbia ampie applicazioni nella ricerca sulla leucemia del pesce zebra, può essere applicabile anche ad altri tipi di cellule maligne e non maligne del pesce zebra. Gli individui che non conoscono questo metodo possono avere difficoltà perché il metodo è sensibile ai cambiamenti sottili.

Anche se il metodo sembra semplice, l'ottimizzazione è necessaria per ogni tipo di cellula testata. Preparare 20 millilitri di FBS inattivato a caldo al 10% in 0,9x PBS. Aggiungere un millilitro della soluzione FBS/PBS a una fiala di sale sodico di eparina contenente 300 unità di anticoagulante.

Quindi, utilizzando un microscopio a epifluorescenza, selezionare i pesci in cui le cellule tumorali hanno invaso il 50% del corpo o i pesci che sono stati identificati come aventi difficoltà a mangiare o nuotare. Sopprimere il pesce trasferendolo in una soluzione di uno o due milligrammi per millilitro di tricaina in acqua di pesce. Osserva l'animale per il movimento delle branchie e il battito cardiaco per confermare l'eutanasia.

Dopo aver rimosso la testa del pesce, iniettare con una pipetta 100 microlitri di soluzione di eparina nella cavità del corpo per rimuovere i globuli rossi in eccesso. Aspirare tutto il liquido che fuoriesce e pipettarlo in una provetta da microcentrifuga da 1,5 millilitri. Quindi, utilizzando puntali di pipette nuovi, lavare la cavità corporea altre due volte o fino a quando la soluzione di lavaggio non contiene sangue ed eliminare il liquido raccolto da tutti i lavaggi.

Per raccogliere le cellule leucemiche, iniettare 100 microlitri di soluzione FBS/PBS nella cavità corporea prelavata. Sotto un microscopio da dissezione, applicare una leggera pressione sul corpo del pesce con la punta di una pipetta per espellere le cellule tumorali. Raccogliere il liquido rilasciato in una provetta da microcentrifuga da 1,5 millilitri.

Ripetere l'isolamento fino a quando la maggior parte delle cellule tumorali non viene raccolta. Raccogliere tutte le cellule nella stessa provetta da microcentrifuga da 1,5 millilitri e mantenere la sospensione ottenuta a temperatura ambiente. Quindi, mescolare le cellule tumorali isolate pipettandole delicatamente per dissociare i grumi cellulari.

Filtrare la sospensione cellulare attraverso un filtro a maglie di 40 micrometri. E lavare il filtro una o due volte con 100 microlitri di FBS/PBS. Una volta filtrate, mantenere le celle a temperatura ambiente.

Infine, in una nuova provetta, mescolare due microlitri della sospensione cellulare con 18 microlitri di soluzione sterile di Trypan Blue allo 0,04%. Caricare 10 microlitri della sospensione ottenuta su un emocitometro e contare le cellule tumorali fluorescenti vitali. È importante raccogliere un campione pulito di cellule T-ALL.

La concentrazione di Hoechst tre tre tre quattro due qui utilizzata si basa sul numero di cellule tumorali vive raccolte. Ulteriori detriti cellulari o cellule non tumorali possono interferire con il test. Prima della colorazione cellulare, diluire il colorante Hoechst in acqua priva di nucleasi per ottenere una soluzione di lavoro di un milligrammo per millilitro.

Conservare la soluzione preparata coperta con un foglio di alluminio a quattro gradi Celsius. Quindi, sciogliere 49,1 milligrammi di verapamil in un millilitro di DMSO per ottenere una soluzione inibitrice da 100 micromolari. Successivamente, preparare il campione aggiungendo FBS/PBS, 2,5 microlitri di DMSO, 15 microlitri di un milligrammo per millilitro di colorante Hoechst e 10 alle sei cellule tumorali in un tubo fax con un volume finale di un millilitro.

Per preparare il controllo, aggiungendo FBS/PBS, 2,5 microlitri di verapamil molare da 100 milioni di molari, 15 microlitri di un milligrammo per millilitro di colorante Hoechst, aggiungere 10 alle sei cellule tumorali con un volume finale di un millilitro. Incubare il campione e il controllo in un bagno d'acqua a 28 gradi Celsius al buio per 120 minuti. Dopo l'incubazione, posizionare immediatamente le cellule sul ghiaccio e tenerle al buio.

Centrifugare le celle a 300 volte G quattro gradi Celsius per sei minuti. Quindi, rimuovere il supernativo e lavare le cellule con un millilitro di FBS/PBS. Far girare le celle a 300 volte G quattro gradi Celsius per sei minuti ancora una volta.

Una volta pellettate le cellule, rimuovere il supernativo e risospendere le cellule in un millilitro di FBS/PBS. Conservare i campioni a quattro gradi Celsius fino allo smistamento delle cellule. 15 minuti prima della selezione cellulare, aggiungere due microlitri di un milligrammo per millilitro di soluzione madre di iodio propidio per ogni millilitro di sospensione cellulare.

Quindi, agitare bene i campioni. Analizzare le sospensioni cellulari T-ALL colorate di zebrafish utilizzando un selezionatore cellulare attivato a fluorescenza. Eccita i campioni con un laser UV per l'analisi dei coloranti Hoechst e un laser a 488 nanometri per la rilevazione di cellule T-ALL positive allo ioduro di propidio o GFP.

Il numero di cellule, la concentrazione del colorante, la temperatura di incubazione e la lunghezza di incubazione potrebbero dover essere ottimizzati per ogni diverso tipo di cellula utilizzata. E le modifiche a ciascuna di queste condizioni possono alterare drasticamente i risultati del test. Per identificare la popolazione laterale tra le cellule T-ALL isolate da zebrafish, sono esclusi prima i detriti cellulari e i grumi cellulari.

L'assunzione di ioduro di propidio e l'espressione di GFP in una singola popolazione cellulare vengono quindi analizzate per identificare le cellule tumorali vive. Per visualizzare la popolazione laterale, vengono quindi confrontate le emissioni blu e rosse del colorante Hoechst. La popolazione laterale appare come una coda fioca di cellule che si estende dal lato sinistro della popolazione cellulare principale verso l'asse di fluorescenza blu.

Qui vengono presentati i risultati dell'analisi della popolazione laterale effettuata per due diversi campioni di cellule tumorali. In entrambi gli esemplari è stata identificata una popolazione laterale. Tuttavia, diversi campioni tumorali contenevano un numero variabile di cellule della popolazione laterale.

Indipendentemente dal campione tumorale analizzato, il trattamento del campione con un inibitore dell'efflusso di verapamil ha determinato la scomparsa del segnale osservato per le cellule precedentemente identificate, confermando ulteriormente il fenotipo della popolazione laterale. Una volta padroneggiata, la tecnica di popolazione laterale su un T-ALL di pesce zebra può essere eseguita in meno di quattro ore se eseguita correttamente e come abbiamo presentato qui. Durante il tentativo di questa procedura, è importante ricordare i passaggi che sono stati ottimizzati per la T-ALL del pesce zebra, come la temperatura e il tempo di incubazione, la concentrazione del colorante e l'inibitore dell'efflusso.

Potrebbe essere necessario modificarli per diversi sistemi sperimentali. Seguendo questa procedura, altri metodi, come l'isolamento dell'RNA o i saggi di trapianto in vivo, possono essere eseguiti con cellule di popolazione laterale selezionate per affrontare questioni riguardanti la funzionalità e la regolazione genica delle cellule della popolazione laterale. Dopo aver visto questo video, dovresti avere una buona comprensione di come isolare la popolazione laterale di cellule dalla leucemia linfoblastica acuta a cellule T di pesce zebra.