Isolamento della popolazione Side di Myc-indotta delle cellule T leucemia linfoblastica acuta in Zebrafish

L'obiettivo generale di questa procedura è isolare le cellule della popolazione laterale da un modello di pesce zebra di leucemia linfoblastica acuta a cellule T indotta da myc. Il saggio della popolazione laterale è stato utilizzato per identificare popolazioni di cellule staminali e progenitrici in numerosi tessuti normali e tumorali. Tuttavia, non è ancora stato applicato a nessun modello di cancro nel pesce zebra.

Il vantaggio principale di questa tecnica è che consente l'isolamento prospettico di una popolazione di cellule nel linfoma T acuto dei pesci zebra che potrebbe essere arricchita per attività di cellule staminali tumorali. Sebbene il metodo qui descritto abbia ampie applicazioni nella ricerca sulleucemia nei pesci zebra, potrebbe essere applicabile anche ad altri tipi cellulari maligni e non maligni nei pesci zebra. Gli individui alle prime armi con questo metodo potrebbero incontrare difficoltà poiché il metodo è sensibile a variazioni minime.

Sebbene il metodo possa sembrare semplice, è necessaria un'ottimizzazione per ogni tipo di cellula testato. Preparare 20 millilitri di FBS al 10 percento inattivato termicamente in PBS 0,9x. Aggiungere un millilitro della soluzione FBS/PBS a una provetta contenente un sale sodico di eparina con 300 unità dell'anticoagulante.

Quindi, utilizzando un microscopio epifluorescente, selezionare i pesci in cui le cellule tumorali hanno invaso il 50 percento del corpo, oppure i pesci che mostrano difficoltà nell'alimentarsi o nel nuotare. Eutanasia il pesce trasferendolo in una soluzione di uno-due milligrammi per millilitro di tricaina in acqua per pesci. Osservare il movimento delle branchie e il battito cardiaco per confermare l'eu-tanasia.

Dopo aver rimosso la testa del pesce, iniettare con una pipetta 100 microlitri di soluzione di eparina nella cavità corporea per rimuovere l'eccesso di globuli rossi. Aspirare tutto il liquido che fuoriesce e trasferirlo, mediante pipetta, in una provetta microcentrifuga da 1,5 millilitri. Successivamente, utilizzando punte di pipetta fresche, lavare la cavità corporea altre due volte o fino a quando la soluzione di lavaggio non contiene più sangue, e scartare il liquido raccolto da tutti i lavaggi.

Per raccogliere le cellule leucemiche, iniettare 100 microlitri di soluzione FBS/PBS nella cavità corporea prelavata. Sotto un microscopio stereoscopico, applicare una leggera pressione sul corpo del pesce con la punta di una pipetta per espellere le cellule tumorali. Raccogliere il liquido rilasciato in una provetta microcentrifuga da 1,5 millilitri.

Ripetere l'isolamento fino a quando la maggior parte delle cellule tumorali non è stata raccolta. Raccogliere tutte le cellule nello stesso tubo microcentrifugo da 1,5 millilitri e mantenere la sospensione ottenuta a temperatura ambiente. Successivamente, mescolare le cellule tumorali isolate pipettando delicatamente per dissociare gli aggregati cellulari.

Filtrare la sospensione cellulare attraverso un filtro a maglia da 40 micrometri. Lavare il filtro da una a due volte con 100 microlitri di FBS/PBS. Dopo la filtrazione, mantenere le cellule a temperatura ambiente.

Infine, in un nuovo tubo, mescolare due microlitri della sospensione cellulare con 18 microlitri di soluzione sterile di Blu di Trypan allo 0,04 percento. Caricare 10 microlitri della sospensione ottenuta su un emocitometro e contare le cellule tumorali fluorescenti vitali. È importante raccogliere un campione puro di cellule di ALL-T.

La concentrazione di Hoechst 33342 utilizzata in questo caso si basa sul numero di cellule tumorali vitali raccolte. Detriti cellulari aggiuntivi o cellule non tumorali potrebbero interferire con il saggio. Prima della colorazione cellulare, diluire il colorante Hoechst in acqua priva di nucleasi per ottenere una soluzione lavorativa di un milligrammo per millilitro.

Conservare la soluzione preparata coperta con carta d'alluminio a quattro gradi Celsius. Successivamente, sciogliere 49,1 milligrammi di verapamil in un millilitro di DMSO per ottenere una soluzione dell'inibitore da 100 micromolari. Preparare quindi il campione aggiungendo FBS/PBS, 2,5 microlitri di DMSO, 15 microlitri di colorante Hoechst da un milligrammo per millilitro e 106 cellule tumorali in un tubo fax fino a un volume finale di un millilitro.

Per preparare il controllo, aggiungere FBS/PBS, 2,5 microlitri di verapamil 100 milioni molar, 15 microlitri di colorante Hoechst 1 milligrammo per millilitro e aggiungere 10 alla sesta di cellule tumorali con un volume finale di un millilitro. Incubare il campione e il controllo in un bagno termico a 28 gradi Celsius al buio per 120 minuti. Al termine dell'incubazione, porre immediatamente le cellule sul ghiaccio e mantenerle al buio.

Centrifugare le cellule a 300 ×g a quattro gradi Celsius per sei minuti. Quindi, rimuovere il soprannatante e lavare le cellule con un millilitro di FBS/PBS. Centrifugare nuovamente le cellule a 300 ×g a quattro gradi Celsius per sei minuti.

Dopo la formazione del pellet, rimuovere il sopranatante e risospendere le cellule in un millilitro di FBS/PBS. Mantenere i campioni a quattro gradi Celsius fino al sorting cellulare. Quindici minuti prima del sorting cellulare, aggiungere due microlitri di soluzione stock di ioduro di propidio a un milligrammo per millilitro per ogni millilitro di sospensione cellulare.

Quindi, vortexare accuratamente i campioni. Analizzare le sospensioni cellulari di T-ALL del pesce zebra colorate mediante un ordinatore cellulare a fluorescenza attivata. Eccitare i campioni con un laser UV per l'analisi del colorante Hoechst e con un laser a 488 nanometri per la rilevazione delle cellule T-ALL positive per ioduro di propidio o GFP.

Il numero di cellule, la concentrazione del colorante, la temperatura di incubazione e la durata dell'incubazione potrebbero necessitare di ottimizzazione per ciascun tipo cellulare utilizzato. Inoltre, modifiche a ciascuna di queste condizioni possono alterare drasticamente i risultati del saggio. Per identificare la popolazione laterale tra le cellule di T-ALL isolate da zebrafish, innanzitutto si escludono i detriti cellulari e gli aggregati cellulari.

L'assunzione di ioduro di propidio e l'espressione di GFP in una singola popolazione cellulare vengono quindi analizzate per identificare le cellule tumorali vitali. Per visualizzare la popolazione laterale, vengono quindi confrontate le emissioni blu e rosse del colorante Hoechst. La popolazione laterale appare come una coda tenue di cellule che si estende dal lato sinistro della popolazione cellulare principale verso l'asse della fluorescenza blu.

Qui vengono presentati i risultati dell'analisi della popolazione laterale eseguita su due campioni diversi di cellule tumorali. Una popolazione laterale è stata identificata in entrambi i campioni. Tuttavia, campioni tumorali diversi contenevano numeri variabili di cellule della popolazione laterale.

Indipendentemente dal campione tumorale analizzato, il trattamento del campione con un inibitore dell'efflusso come il verapamil ha portato alla scomparsa del segnale osservato per le cellule precedentemente identificate, confermando ulteriormente il fenotipo della popolazione laterale. Una volta padroneggiata, la tecnica della popolazione laterale su un T-ALL del pesce zebra può essere eseguita in meno di quattro ore, se effettuata correttamente e come presentato in questo studio. Durante il tentativo di questa procedura, è importante ricordare i passaggi che sono stati ottimizzati per il T-ALL del pesce zebra, come la temperatura e il tempo di incubazione, la concentrazione del colorante e l'inibitore dell'efflusso.

Questi potrebbero dover essere modificati per diversi sistemi sperimentali. Dopo aver seguito questa procedura, altri metodi, come l'isolamento dell'RNA o saggi di trapianto in vivo, possono essere eseguiti con cellule della popolazione laterale ordinate per indagare sulla funzionalità e sulla regolazione genica delle cellule della popolazione laterale. Dopo aver visto questo video, si dovrebbe avere una buona comprensione di come isolare la popolazione laterale di cellule dalla leucemia linfoblastica acuta a cellule T del pesce zebra.