Il trapianto di tumori del cervello pediatrico di Zebrafish in ospedali immunitario-competenti per uno studio a lungo termine del comportamento della cellula tumorale e della risposta ai farmaci

L'obiettivo generale di questa procedura è quello di consentire una valutazione a lungo termine del comportamento delle cellule tumorali, come l'invasione e la disseminazione, e testare potenziali terapie in un ospite animale immunocompetente. Questo metodo può aiutare a rispondere a domande chiave nel campo del cancro cerebrale pediatrico, tra cui la longevità di una risposta ai farmaci e i meccanismi che guidano l'invasione e la diffusione. Il vantaggio principale di questa tecnica è che riduce al minimo la tossicità per l'ospite, il che consente l'attecchimento duraturo delle cellule tumorali e quindi studi a lungo termine sulla biologia del cancro al cervello.

Le implicazioni di questa tecnica si estendono alla terapia del cancro al cervello perché il carico tumorale può essere valutato direttamente in vivo dopo il trattamento farmacologico. In generale, gli individui che non conoscono questo metodo avranno difficoltà se la sospensione delle cellule tumorali è troppo concentrata o troppo diluita, rendendo difficile iniettare quantità costanti nel quarto ventricolo. Per iniziare, prepara una soluzione da 50 millilitri di agarosio all'1,2% sciolto in acqua d'uovo.

Far bollire la soluzione fino a quando l'agarosio non si scioglie, quindi integrarla aggiungendo 05 milligrammi per litro di blu di metilene. Versare 25 millilitri della soluzione finale in una capsula di Petri da 10 centimetri e lasciarla solidificare. Mettere i restanti 25 millilitri di soluzione di agarosio in un bagnomaria a 42 gradi Celsius.

Quindi posizionare un becher di due pollici di diametro al centro della superficie solidificata e versare i restanti 25 millilitri di agarosio all'1,2% sullo strato precedente. Mantenere la piastra di iniezione a 28 gradi Celsius per almeno 30 minuti prima dell'iniezione o a quattro gradi Celsius per la conservazione a lungo termine. Realizza gli aghi usando un estrattore per aghi per estrarre capillari di 10 centimetri con una dimensione esterna di 1,2 millimetri e una dimensione interna di 0,9 millimetri.

Posizionare con cautela l'ago su un vetrino da microscopio avvolto in una pellicola di plastica di paraffina. Quindi usa una lama di rasoio per tagliare l'estremità dell'ago con un angolo di 45 gradi per creare un ago con un'apertura sulla punta. Dopo l'eutanasia di un pesce portatore di tumore al cervello e la dissezione del tumore secondo il protocollo di testo, utilizzare manualmente un P1000 per interrompere la massa tumorale fino a quando non si sviluppa una soluzione uniforme e torbida.

Utilizzare una pipetta o un colino cellulare da 40 micron per rimuovere il particolato di grandi dimensioni. Quindi centrifugare la sospensione a 290 volte g a temperatura ambiente per cinque minuti e rimuovere il surnatante. Risospendere il pellet di cellule tumorali in 100 microlitri di PBS sterile e trasferirlo in una provetta da microcentrifuga da 1,5 millilitri.

Utilizzare 250 microlitri di PBS per diluire cinque microlitri della sospensione cellulare. Quindi utilizzare un emocitometro per contare il numero di cellule. Centrifugare la sospensione a 290 volte g per tre minuti.

Dopo aver rimosso il surnatante, utilizzare PBS sterile per risospendere il pellet per ottenere la concentrazione cellulare desiderata. Conservare la sospensione tumorale su un blocco termico a 28 gradi Celsius durante la procedura di trapianto. Utilizzando una pipetta di trasferimento, trasferire da 10 a 20 embrioni anestetizzati alla periferia della piastra di iniezione.

Gli embrioni dovrebbero cadere lateralmente, con i ventricoli chiaramente visibili e accessibili. Utilizzare una sonda angolata per regolare gli embrioni secondo necessità e posizionarli lontano dal bordo esterno della piastra di iniezione. Quindi utilizzare una punta di caricamento del gel per caricare uno o due microlitri della sospensione di cellule tumorali nell'ago per iniezione e inserire l'ago nel manipolatore.

Quindi, abbassare manualmente il manipolatore, tenendo l'ago a un angolo di 45 gradi. Regolare le manopole del micromanipolatore nelle direzioni x, y e z fino a quando l'ago non si trova appena sopra e a circa cinque millimetri a destra della testa dell'embrione. Utilizzando uno stereomicroscopio, regolare lentamente il micromanipolatore in direzione x fino a quando l'ago non perfora il quarto ventricolo dell'embrione.

Non permettere all'ago di perforare il cuore o il tuorlo. Per iniezioni coerenti, gli embrioni devono essere anestetizzati, il tumore deve essere adeguatamente dissociato in una sospensione cellulare e l'ago deve perforare il quarto ventricolo ma non estendersi oltre il cuore. Premere il pedale del microiniettore per iniettare la sospensione delle cellule tumorali.

Al termine dell'iniezione, utilizzare acqua fresca d'uovo per sciacquare delicatamente gli embrioni iniettati dalla piastra di iniezione e metterli in una capsula di Petri. Ora, ispeziona gli embrioni iniettati sotto uno stereomicroscopio fluorescente in una stanza buia. Verificare che la pressione di iniezione, l'angolo, le dimensioni dell'ago e la viscosità della sospensione cellulare portino le cellule tumorali a riempire dal 25 al 50% dello spazio ventricolare.

Rimetti gli embrioni nell'incubatrice a 28 gradi Celsius durante la notte. Il giorno successivo, valutare la sopravvivenza dell'embrione esaminando le caratteristiche morfologiche e fisiologiche, come il normale sviluppo del cuore e del cervello, come descritto in precedenza. Utilizzare una pipetta di trasferimento per aggiungere il 4% di metilcellulosa al centro di una capsula di Petri e aggiungere gli embrioni anestetizzati alla goccia di metilcellulosa.

Utilizzare una sonda angolata per orientare gli embrioni e, al microscopio a fluorescenza, eseguire lo screening per verificare una dimensione di attecchimento costante. Per il mantenimento dei tumori, una volta che gli embrioni raggiungono gli otto giorni dopo la fecondazione, mettere gli embrioni trapiantati in vasche per crescere. Immagine ed eseguire ulteriori studi secondo il protocollo di testo.

In questo esperimento, le cellule tumorali ectodermiche neurali primitive del sistema nervoso centrale sono state trapiantate nel mutante mitfa zebrafish privo di melanofori. Già 24 ore dopo il trapianto, le cellule tumorali possono essere viste invadere il tessuto cerebrale circostante. Gli innesti tumorali continuano a crescere nel ventricolo e nel tessuto cerebrale circostante nel corso della prossima settimana e la fluorescenza può essere osservata anche nella regione dei reni.

Le cellule tumorali continuano a proliferare e invadere, quindi entro 28 giorni dalla fecondazione, una massa tumorale può essere vista in tutto il cervello del pesce zebra. In questa figura è mostrato un gruppo rappresentativo di zebrafish trapiantato con cellule tumorali cerebrali marcate con mCherry. L'attecchimento delle cellule tumorali si ottiene in genere nell'80-90% dei pesci zebra e i trapianti tumorali persistono nell'età adulta.

In questo esperimento, un CNS-PNET di zebrafish marcato con mCherry guidato da NRAS dal tectum ottico e un CNS-PNET marcato con GFP dal cervelletto sono stati raccolti mediante dissociazione dell'intero tumore, trasformati in una sospensione a singola cellula, quindi miscelati in un rapporto uno a uno prima del trapianto. Questo embrione rappresentativo che è stato immaginato quattro giorni dopo il trapianto dimostra che le cellule tumorali del tectum ottico, in rosso, migrano più estesamente nel cervello ospite rispetto al tumore cerebellare. Una volta padroneggiati, circa 300 embrioni possono essere iniettati in tre o quattro ore.

Dopo questa procedura, è possibile eseguire metodi aggiuntivi, come l'imaging di animali vivi e la somministrazione di farmaci, per rispondere a ulteriori domande relative alla biologia delle cellule tumorali, alla risposta ai farmaci e alla chemioresistenza. Dopo il suo sviluppo, questa tecnica ha aperto la strada ai ricercatori nel campo della modellazione del cancro del pesce zebra per esplorare nuovi inibitori per il trattamento dei tumori cerebrali pediatrici.