Name: Consegna sistemica di MicroRNA usando ricombinanti Virus Adeno-associato sierotipo 9 per trattare malattie neuromuscolari in roditori (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-08-10T12:30:00.000+00:00
Duration: 6 min 51 s
Description: Impara la consegna sistemica di microRNA usando virus adeno-associato sierotipo 9 per trattare malattie neuromuscolari nei roditori. Questo metodo dimostra l'efficacia della terapia genica mirata.

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Gli autori non dichiarano alcun conflitto di interessi. Ringraziamo SignaGen Laboratories (Rockvile, MD, USA) per la produzione di virus AAV9. Questa ricerca è stata sostenuta dal programma di ricerca intramurale di NINDS, NIH. Philip R. Lee è stato sostenuto dalla divisione di ricerca intramurale di NICHD. Carlo Rinaldi è stato sostenuto da una borsa di studio dall'Association Française contre les Myopathies (AFM).

Tutte le procedure sono state effettuate in conformità della istituti nazionali di salute Guida per la cura e l'uso di animali da laboratorio (8th ed., National Academies Press, Revisione 2011) e sono state approvate dal Comitato cura animale NINDS.
1. selezione di strategia e miRNA design AAV9-miRNA
<ol><li>Utilizzare miRWalk predittiva database per selezionare candidati miRNA che interagiscono con mRNA regione 3' UTR del gene target. 15 Nota: Limitare la lunghezza minima seme della sequenza di miRNA a almeno 7 nucleotidi. Selezionare altri programmi di previsione stabilito miRNA (miRanda, miRDB, Targetscan) per l'analisi comparativa. Basandosi su questi criteri di selezione, qui, miR-185, miR-298, miR-873 e miR-877 sono stati selezionati per ulteriore valutazione.</li>
	<li>Recuperare la sequenza del quieto selezionato da miRBase (http://www.mirbase.org/).</li>
	<li>Clonare il pri-mir (60-70 nts) e sua nts di 250-300 che fiancheggiano la sequenza genomic su entrambi i lati, o una sequenza fittizia, nell'AAV appropriato cis vettoriale. Nota: La sequenza di accompagnamento è necessaria per l'espressione corretta pri-mir e microRNA matura elaborazione. Selezionare un vettore di cis rAAV dual-promotore con una cassetta di espressione costituita ad esempio da un promotore del fattore-1 alfa (EIF1α) umana allungamento seguita dal miRNA selezionato o sequenza finto e il promotore di citomegalovirus (CMV) seguita dalla codifica di cDNA il tag fluorescente GFP. Il promotore EIFα è stato scelto perché garantisce espressione stabile e omogenea, con il minimo rischio di mettere a tacere. Promotori di specifiche o condizionali di tessuto possono essere utilizzati, a seconda delle specifiche applicazioni.</li>
	<li>Preparare, purificare e titolare l'AAV, seguenti protocolli pubblicati. 16 Nota: Qui, clonazione del pri-mir nell'AAV vettoriale e produzione virale sono state effettuate da un produttore esterno.</li>
</ol>2. coda vena iniezione del plasmide AAV-miRNA
Nota: Questo passaggio deve regolazione secondo il gene dell'obiettivo e l'età e il peso dei topi. Utilizzare le linee guida istituzionali e cura degli animali e uso Committee (IACUC) per determinare il range di dosaggio, il volume e la migliore via di somministrazione basato su età e peso dei topi. Livelli di espressione GFP fluorescenza segnale e miRNA nei tessuti bersaglio sono tenuti a picco a partire 2 settimane dopo l'iniezione. Il seguente protocollo si riferisce a di topo maschio nell'età adulta iniziale. AAV deve essere gestita come un rischio biologico sotto le linee guida di biosicurezza livello 1.
<ol><li>Dividere Stock in plasmide AAV-miRNA in aliquote di 100-200 µ l contenente un carico virale di 1010-1011 genomi virali / mL (vg/mL) con soluzione salina sterile tamponata al fosfato (PBS). Dispositivi di protezione individuale biohazard laboratorio dovrebbero essere utilizzato per gestire la soluzione AAV. Nota: Una volta un'aliquota è scongelata si possono depositare a 4 ° C fino a due settimane. Stock virali possono essere memorizzati in congelatore a-80 ° C.</li>
	<li>Trattenere il mouse in dispositivi disponibili in commercio come tubo di plastica o conico film di materia plastica di dimensioni adeguate.</li>
	<li>Pulire la superficie della coda con salviettine imbevute di alcool di 70%.</li>
	<li>Tenere un pad caldo (28-30 ° C) sotto la coda per aumentare la vasodilatazione per 30 s. in alternativa, caldo gli animali utilizzando una lampada di calore rosso (ad una distanza di 2-3 piedi) o immergendo la coda in acqua calda.</li>
	<li>
A partire dalla porzione distale della coda, inserire l'ago (27-30 G) caricato con l'aliquota virale, smussatura, 15° dalla coda, nella vena. Prima dell'iniezione, assicurarsi che l'ago è inserito correttamente.
	<ol>
<li>Se si avverte resistenza durante l'iniezione, o gonfiore appare sotto pelle, interrompere la procedura. Rimuovere l'ago e re-inserire l'ago sopra il precedente sito di iniezione. Nota: In alternativa, ciò aspirando delicatamente l'ago e osservando il sangue. Aspirazione rigido possibile comprimere la vena caudale. Se la vena blanches durante l'iniezione, l'ago è inserito correttamente.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Una volta completata l'iniezione, attendere alcuni secondi prima di sollevare l'ago.</li>
	<li>Osservare il sito di iniezione per spurgo. Applicare una pressione moderata utilizzando due dita al sito fino a quando l'emorragia si ferma.</li>
	<li>Restituire l'animale alla sua gabbia.</li>
</ol>3. comportamentale saggi
Nota: Tutti gli esperimenti sono stati condotti alla cieca da parte di terzi con occultamento di trattamenti fialette codificato in modo univoco. Ordine dei trattamenti è stato randomizzato. Quando si esegue il test descritto di seguito, condizioni sperimentali (tipo di camera) e l'ora del giorno dovrebbero essere controllate per ridurre le variazioni. Questo test dovrebbe essere eseguito su topi più di quattro settimane per ottenere risultati affidabili. Mouse ha subito la valutazione del comportamento una volta prima dell'iniezione virale a 5 settimane di età per ottenere la previsione di prestazioni normali. Dopo l'iniezione virale, i topi sono stati valutati una volta a settimana a partire 48 h dopo l'iniezione, fino a 40 settimane di età.
<ol><li>Portare il mouse iniettato con AAV per una camera tranquilla e scura che è priva di rumore o altre disturbi almeno 30 min prima di iniziare i test. Durante questo periodo di acclimatazione di non disturbare gli animali.</li>
	<li>Acclimatare il mouse nella nuova camera per 30 min e quindi avviare i seguenti saggi comportamentali (punti 3.3 e 3.4). Garantire una distanza di 10 min tra ciascun test comportamentali.</li>
	<li>
Prova del filo appeso Nota: Questo test controlla la forza muscolare e disfunzione del motore.<ol>
<li>Utilizzare un foglio di imbottitura per agire come un cuscino. Sollevare il mouse dalla sua coda e posizionarlo al centro della griglia griglia. Alza il rack 15-20 pollici sopra la superficie e capovolgere lentamente lo schermo per permettere all'animale di regolare la presa sullo schermo.</li>
		<li>Una volta che il rack è completamente invertito, avviare il timer e registrare il tempo di cadere. Nota: I topi si bloccherà con quattro arti su una griglia. Se il filo è troppo basso i topi non possono appendere. Se topi cadono fuori dalla griglia prima di 60 s, metterli indietro sulla griglia, azzerare il timer e ripetere questa procedura fino a due ulteriori tentativi. Registrare le migliori prestazioni.</li>
		<li>Quando il tempo limite di 60 s è raggiunto, restituire l'animale alla gabbia.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Analisi di stampa del piede Nota: Il foglio assorbente deve essere una stretta pista circa 70 cm di lunghezza e 5 cm di larghezza, con pareti alte 5 cm.<ol>
<li>Impugnare il mouse delicatamente da un lato e applicare inchiostro rosso per le zampe anteriori e inchiostro blu per le zampe posteriori con un pennello.</li>
		<li>Posizionare il foglio assorbente sul pavimento di una pista stretta.</li>
		<li>Consentire il mouse per camminare o correre sopra un foglio assorbente in linea retta in pista da un capo a altro.</li>
		<li>Ripetere il processo due volte con il mouse utilizzando un foglio assorbente fresco.</li>
		<li>Misurare la distanza tra due passaggi consecutivi in avanzamento. Non includere prima e durano pochi orme dove l'animale è appena iniziando e finendo la sua corsa.</li>
	</ol>
</li>
</ol>4. l'eutanasia e tessuto raccolto
<ol><li>Utilizzare una camera di eutanasia o una campana di vetro. Se si utilizza una campana di vetro, eseguire la procedura sotto cappa aspirante.</li>
	<li>Ammollo in cotone con isoflurano e posizionarlo sotto la campana di vetro. Utilizzare un separatore fisico per tenere l'animale dal contatto fisico con il materiale di anestesia. Metti l'animale nel recipiente subito dopo questo passaggio. Nota: La campana di vetro non dovrebbe essere pre-caricata con isoflurano per evitare la possibilità di ipossiemia negli animali.</li>
	<li>Continuare l'esposizione isoflurano fino a 30 s dopo l'arresto della respirazione.</li>
	<li>Subito dopo aver tolto il mouse dal vaso, eutanasia di dislocazione cervicale. Nota: Questo passaggio dovrebbe avvenire più rapidamente possibile per evitare la degradazione del tessuto.</li>
	<li>
Raccolto il midollo spinale prima e quindi il muscolo quadricipite.
	<ol>
<li>Per raccogliere il midollo spinale, esporre la parte posteriore del mouse e difficoltà quattro membra sul lato di un tavolo di dissezione.</li>
		<li>Lavare il sito di dissezione con etanolo al 70%.</li>
		<li>Eseguire dislocazione cervicale utilizzando una forbice tagliente.</li>
		<li>Fare un'incisione nella pelle in linea mediana. Rimuovere la pelle dal taglio o attenta lacerazione della pelle sul piano trasversale, seguita tirando la pelle in alto e sopra la testa. Rimuovere la testina di taglio con le forbici sotto le scapole e presso la regione di C1-2 della colonna (che si trova adiacente alla base del cranio).<ol>
<li>Tagliare la muscolatura della parete addominale sul lato ventrale e continuare lateralmente, una direzione alla volta, fino a raggiungere la colonna vertebrale.</li>
		</ol>
</li>
		<li>Utilizzando una vertebra di Rimuovi forbici taglienti a partire dal midollo spinale cervicale. Rimuovere le parti laterali delle vertebre tagliando attraverso gli archi vertebrali su entrambi i lati.</li>
		<li>Dopo aver rimosso le vertebre intere rilasciare il midollo spinale.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Snap congelare i tessuti raccolti in pre-refrigerato 2-metilbutano utilizzando il seguente metodo:
	<ol>
<li>La metà riempire una ciotola in acciaio inox con 2-metilbutano e immergere il quartiere di fondo della ciotola in un contenitore riempito con azoto liquido.</li>
		<li>Pre-chill 2-metilbutano in azoto liquido per 1-2 min.</li>
		<li>Posizionare il muscolo scheletrico con forcipe in 2-metilbutano fino a quando diventa bianco. Trasferire immediatamente il tessuto per ghiaccio secco e poi conservarlo a-80 ° C.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Per immunostaining del midollo spinale, incorporare il tessuto in blocchetti di paraffina a temperatura ambiente prima di snap congelamento come descritto. 17
</li>
	<li>Per l'analisi biochimica e la quantificazione di miRNA,1 posizionare il tessuto raccolto in un cryovial e congelato in azoto liquido. Conservare i campioni a-80 ° C.</li>
</ol>

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</ol>

Gli autori non hanno nulla a rivelare.

Qui dimostriamo una metodologia altamente efficiente e accessibile per selezionare e consegnare tramite iniezione coda un miRNA utilizzando rAAV9 come un vettore virale per target del muscolo scheletrico e motoneuroni nei topi. 14 rispetto ad altre strategie di RNAi, Mirna sono meno tossici e meno immunogeno. 18 inoltre, le loro piccole dimensioni li rendono ben adatto alla capacità limitata confezione di vettori virali. 2 gli algoritmi di calcolo e strumenti di previsione permettono l'identificazione del presunto miRNA-mRNA bersaglio. Una volta identificati, devono essere verificati gli effetti di miRNA sull'espressione del gene bersaglio. Un approccio comune è quello di iperesprimono un determinato miRNA in vitro e rilevare i livelli di espressione della proteina bersaglio mediante analisi western. 14 , 19
Vari studi hanno utilizzato strategie virali e non virali per la consegna di Mirna. 13 qui abbiamo usato virus adeno-associato (AAV) come uno strumento di consegna del gene. Rispetto ad altri vettori virali, AAV suscita bassa immunogenicità, permette il trasferimento genico a lungo termine, e ha un vasto spettro di tropismo nel dividere e cellule di divisione. 18 questo metodo di consegna può anche eludere la necessità di modificazione chimica che può influire sulla funzionalità e specificità della molecola del RNA. Ci sono diversi sierotipi di AAV, che sono principalmente determinati dalla composizione delle proteine del capside. Questi sierotipi diversi nel loro tropismo e trasducono diversi tipi di cellule. È necessario selezionare il sierotipo corretto quando si considera il tessuto bersaglio. Abbiamo scelto rAAV9, grazie alla sua efficienza di trasduzione alta nel sistema nervoso centrale e del muscolo scheletrico dopo somministrazione periferica19,20. Questo approccio ha mostrato una maggiore efficacia di trasduzione in animali neonatali rispetto ad animali adulti, probabilmente a causa di differenze nella composizione della matrice extracellulare, neurone-a-glia rapporto e maturità della barriera emato-encefalica. 21 , 22
Un passo importante in questo protocollo è il design del vettore di espressione. Rispetto ai vettori di sialophosphoprotein, che risentono della bassa espressione del gene secondo confrontato con il primo gene accanto il promotore, il vettore di promotore dual consente una configurazione back to back producendo così alta espressione dei miRNA ed EGFP, che permette la localizzazione del quieto nel tessuto del mouse dall'immunofluorescenza.
L'iniezione endovenosa di AAV9 ha provocato ad alta efficienza e trasduzione omogenea nei tessuti bersaglio, muscolo scheletrico e motoneuroni. Questa via di iniezione consente la dose somministrata di raggiungere la circolazione sistemica e attraversare la barriera del cervello, che è importante per le terapie del sistema nervoso centrale di targeting. Inoltre, è un metodo non invasivo per la consegna al SNC. Espressione di miR-298 aumentato nel midollo spinale e nel muscolo dopo 2-4 settimane con una singola iniezione periferica a 5 settimane dell'età. Quando utilizzando vettori AAV singolo filamento del genoma, la sintesi de novo del secondo filo del DNA può rappresentare per la trasduzione in ritardo. 23
Livelli di miR-298 umana erano inosservabili in topi trattati 20 settimane dopo una singola somministrazione, suggerendo che per malattie croniche, iniezioni multiple possono essere necessarie per raggiungere un beneficio terapeutico. Tuttavia, miRNA degradazione nel tempo può essere limitante quando una permanente somministrazione ripetuta è necessaria. Inoltre, immunità adattativa a vettori AAV può formare un altro ostacolo a una consegna di successo del gene. 24 così generazione di vettori AAV che sono immunologicamente inerte è cruciale per somministrazione ripetuta e il raggiungimento di effetti a lungo termine con questo promettente sistema di consegna. 25
Una limitazione sull'uso di miRNA come strategia terapeutica è il rischio di effetti fuori bersaglio. Mirna possono interagire attraverso incomplementary appaiamento con altre trascrizioni del gene, che comporta un rischio di sicurezza con questo approccio. Migliorata la progettazione delle sequenze di RNAi, compreso l'uso di Mirna non canonico, ad esempio mirtrons, che ignorare il complesso di micro-processore e vasti studi di sicurezza e la tollerabilità a lungo termine sono fondamentali prima di tradurre la strategia in una cassetta di sicurezza e terapia efficace. 26 , 27 , 28
Il metodo qui descritto è stato originariamente sviluppato per la sovraespressione di miRNA, ma può essere utilizzato anche per la terapia di inibizione di miRNA utilizzando recentemente.

I miRNA sono RNA non codificanti, 21-23 nucleotidi di lunghezza, che svolgono un ruolo importante nella regolazione dell'espressione genica e il controllo delle diverse vie metaboliche e cellulari. 1 espressione genica è regolata principalmente inducendo la degradazione di mRNA o di silenziamento genico post-trascrizionale. 2 MiRNAs sono solitamente complementari per la regione 3' non tradotta (UTR) di geni, codificanti sebbene vincolante al 5' UTR e codificanti del bersaglio che mRNA inoltre è stato descritto. 3
Come si espande l'attuale comprensione del ruolo dei miRNA nella patogenesi delle malattie umane, modulazione farmacologica dei singoli miRNA o famiglie di miRNA sta diventando sempre più una valida opzione terapeutica. Rispetto ad altre strategie di inibizione di RNA, i miRNA hanno molti vantaggi: Mirna sono meno tossici e meno immunogeno e può essere facilmente consegnati nelle cellule a causa delle loro piccole dimensioni. 4 , 5 , 6 Mirna in genere hanno molti obiettivi all'interno di reti cellulari, quindi potenziali effetti fuori bersaglio e problemi di sicurezza devono essere prese in considerazione, insieme efficiente consegna ai tessuti dell'obiettivo.
Malattie neuromuscolari sono acquistate o ereditato condizioni che colpiscono il muscolo e motoneuroni. Il targeting di farmaci nel muscolo scheletrico è un settore emergente della ricerca, dove la sfida principale è di raggiungere la distribuzione capillare all'interno della finestra terapeutica. 7 motoneuroni sono più difficili da impostare come destinazione, soprattutto perché accesso droga ne vieti la barriera ematoencefalica.
Modelli di mouse e di cultura cellulare di atrofia muscolare spinale e bulbare (SBMA) sono stati utilizzati in questo studio. SBMA è una malattia neuromuscolare causata da un guadagno tossico del meccanismo di funzione, nelle quali sono coinvolti sia il muscolo che il motoneuroni. 8 , 9 SBMA (malattia di Kennedy; OMIM #313200) è una malattia legata al X, caratterizzata da debolezza muscolare e atrofia, causato da espansione di ripetizione di CAG del gene AR, che codifica per un tratto di polyglutamine estesa nella proteina AR . 10 nessun trattamento modificante la malattia è attualmente disponibile per questo disordine. Il modello di topo transgenico utilizzato in questo studio ricapitola le caratteristiche della malattia, tra cui la specificità di genere, patologia del neurone di motore e l'atrofia muscolare progressiva. 11
In questo studio, i nostri sforzi concentrati sull'identificazione di un miRNA che direttamente dei downregulates espressione del transgene AR mutante e sulla progettazione di una modalità sicura ed efficiente di consegna del quieto al midollo spinale e del muscolo scheletrico del nostro modello murino di malattia.
Qui abbiamo identificato un miRNA relativamente atipico, miRNA-298 (numero di accessione MIMAT0004901),12 di ridurre direttamente l'espressione AR mutante in modelli SBMA. Al fine di realizzare la consegna di miR-298 ai tessuti dell'obiettivo, abbiamo usato una strategia virale, con ricombinanti virus adeno-associato sierotipo 9 (rAAV9). rAAV9 è in grado di attraversare la barriera ematoencefalica e mediare l'espressione genica a lungo termine in cellule di divisione, compresi i neuroni. 13 una singola somministrazione sistemica di AAV9-miR-298 provocato l'espressione sostenuta del quieto, trasduzione efficiente del muscolo e motoneuroni, giù-regolamento dell'espressione di AR e miglioramento del fenotipo malattia in topi SBMA. 14 questa metodologia può essere utilizzata per fornire miRNA o recentemente sovraespressione in vivo.

<table><tbody><tr><td>Reagente per lisi QIAzol</td><td>Qiagen</td><td>79306</td><td>Lisi di tessuti adiposi e standard prima dell'isolamento dell'RNA</td></tr><tr><td>miRNeasy Mini Kit</td><td>Qiagen</td><td>217004</td><td>Purificazione di miRNA e RNA totale</td></tr><tr><td>TaqMan MicroRNA Kit di trascrizione inversa</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>4366596</td><td>Un kit altamente specifico che quantifica solo i miRNA maturi</td></tr><tr><td>snoRNA202 Primer</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>1232</td><td>Taqman miRNA control assay in topo</td></tr><tr><td>miR-298 Primer</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>2190</td><td>Taqman miRNA-298 assay in topo</td></tr><tr><td>Anticorpo anti-GFP</td><td>abcam</td><td>ab290</td><td>Coniglio policlonale a GFP - ChIP Grade</td></tr><tr><td>Tampone d'inchiostro rosso</td><td>Dovecraft Essentials Tampone</td><td></td><td></td></tr><tr><td>d'inchiostro blu</td><td>Dovecraft Essentials</td><td></td><td></td></tr><tr><td>AAV9-GFP vettore</td><td>SignaGen Laboratories</td><td>SL100840</td><td>Costruzione, imballaggio e purificazione di plasmidi AAV su larga scala</td></tr><tr><td>mmu-miR-298-5p</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>MC12525</td><td>mirVana miRNA imita</td></tr><tr><td>AAV9-EF1a-has-mir-298-GFP</td><td>Vector Biosystems Inc</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

consegna sistemica di microrna usando ricombinanti virus adeno-associato sierotipo 9 per trattare malattie neuromuscolari in roditori

Systemic Delivery of MicroRNA Using Recombinant Adeno-associated Virus Serotype 9 to Treat Neuromuscular Diseases in Rodents

Interferenza del RNA via la via di miRNA endogeni regola l'espressione genica mediante il controllo della sintesi proteica attraverso silenziamento genico post-trascrizionale. Negli ultimi anni, regolazione genica mediata da miRNA ha indicato il potenziale per il trattamento di disturbi neurologici causati da un guadagno tossico del meccanismo di funzione. Tuttavia, consegna efficiente ai tessuti dell'obiettivo ha limitato la sua applicazione. Qui abbiamo usato un modello di topo transgenico per l'atrofia muscolare spinale e bulbare (SBMA), una malattia neuromuscolare causato da espansione di polyglutamine nel recettore degli androgeni (AR), per testare il silenziamento genico di una nuova identificati AR-targeting miRNA, miR-298. Abbiamo sovraespresso miR-298 utilizzando un vettore di sierotipo 9 ricombinante virus adeno-associato (rAAV) per facilitare la trasduzione di cellule di divisione. Una singola iniezione di vena caudale nei topi SBMA indotta sostenuta e diffusa la sovraespressione di miR-298 in muscolo scheletrico e motoneuroni e provocato il miglioramento del fenotipo neuromuscolare nei topi.

Un carico virale di 1011 vg di AAV9-miR-298 è stato iniettato attraverso una singola iniezione di vena caudale in topi SBMA 5 settimane di età. Questi topi trasportano il transgene AR umano con il tratto di polyglutamine anormalmente ampliata in AR (AR97Q) e sviluppano segni di malattia neuromuscolare di 10 settimane di età (perdita di peso, gobba e atrofia muscolare). 11 muscolo quadricipite e lombare del midollo spinale sono state raccolte a 2, 4, 8 e 12 settimane dopo la somministrazione per la quantificazione di miRNA, analisi biochimica e immunohistochemistry (Figura 1). Somministrazione del trattamento e le successive analisi sono state eseguite dagli investigatori accecati.
analisi di qRT-PCR ha mostrato l'espressione di miR-298 nel muscolo scheletrico e il midollo spinale in due settimane e quattro settimane dopo il trattamento, rispettivamente, con livelli di espressione di picco a 8 settimane nel muscolo scheletrico e 12 settimane nel midollo spinale dopo l'iniezione (Figura 2 ). Usando un microscopio (Axiovert 100 M), segnale di fluorescenza verde è stato rilevato nel tessuto muscolare e in motoneuroni spinali di co-localizzazione di GFP e il motoneurone marcatore colina acetiltransferasi (chiacchierata) 10 settimane dopo il trattamento, quando i topi iniziano a mostrare manifestazioni di malattia (Figura 2).
Utilizzando lo stesso regime di dose, una coorte di topi SBMA è stata randomizzata per ricevere entrambi miR-298 o deridere a 7 settimane dell'età tramite iniezione della vena della coda per le analisi biochimiche e caratterizzazione funzionale. Iniezione è stata seguita da peso settimanale e valutazione del comportamento a 40 settimane di età. analisi qRT-PCR ha mostrato che miR-298 trattamento riduce i livelli del mutante AR nei tessuti affetti (Figura 3) e peso corporeo è aumentato e migliorato le prestazioni del motore (Figura 4) a partire da 10 settimane dopo l'iniezione.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/55724/55724fig1.jpg"> Figura 1: schema di disegno di studio. Per aumentare i livelli di espressione di miR-298 in vivo, abbiamo iniettato nei topi SBMA con (A) il vettore AAV dual promotore plasmide che esprimono GFP e miR-298 o derisione. (B) topi sono stati iniettati tramite una singola iniezione di coda-vana a 7 settimane di età (fase pre-sintomatica). Muscolo quadricipite e del midollo spinale sono stati raccolti da un gruppo di topi SBMA in diversi momenti per analisi di distribuzione tissutale (verde). Un gruppo di topi SBMA è stato trattato e sacrificato a 16 settimane di età per le analisi biochimiche (rosse). Peso e analisi comportamentale sono state effettuate settimanalmente fino a 40 settimane di età per la caratterizzazione funzionale (blu). <a href="https://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/55724/55724fig1large.jpg" target="_blank">Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/55724/55724fig2.jpg"> Figura 2: AAV9-miR-298 consegna in topi. Utilizzando il metodo descritto qui, i topi hanno ricevuto o AAV9-miR-298-GFP o AAV9-mock-GFP mediante iniezione endovenosa. Totale miRNA è stato raccolto da midollo spinale lombare e muscolo quadricipite alle 2, 4,8 e 12 settimane dopo l'iniezione. qRT-PCR è stata eseguita per stimare il livello di espressione del muscolo quadricipite miR-298 in (A) (n = 5) (B) nel midollo spinale lombare (n = 5, P < 0.01). Tutti i dati sono segnalati come mezzi ± errore standard medio. La trasduzione diffusa del vettore AAV in tessuti raccolti a 10 settimane dopo il trattamento è stato confermato da localizzazione di macchiatura per GFP nel muscolo quadricipite (C) (ingrandimento originale, 10 X. Barra della scala = 100 µm) e (D) motoneuroni nel midollo spinale lombare (ingrandimento originale, 40 X. Barra della scala = 10 µm. GFP (green), ChAT (rosso) e DAPI (blu). La figura è stata modificata da doi: 10.1038/mt.2016.13. 14 <a href="https://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/55724/55724fig2large.jpg" target="_blank">Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/55724/55724fig3.jpg"> Figura 3: MiRNA-298 sovra-espressione dei downregulates mutante AR nel muscolo del quadriceps e del midollo spinale nei topi. qRT-PCR è stata eseguita per stimare i livelli di espressione di mRNA di AR nel midollo spinale lombare (A) e (B) muscolo quadricipite trattati con AAV9-miR-298-GFP o AAV9-mock-GFP. Livelli della trascrizione sono stati normalizzati al snoRNA202 (n = 5 per ogni trattamento). * P < 0,05, * * P < 0.01. Tutti i dati sono segnalati come mezzi ± errori standard. La figura è stata modificata da doi: 10.1038/mt.2016.13. 14
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/55724/55724fig4.jpg"> Figura 4: over-espressione di MiR-298 migliora la funzione motoria e riduce la perdita di peso. Valutazione del comportamento è stata eseguita una volta alla settimana (w), tra settimana da 5 a 40. Peso corporeo (a sinistra) e sospensione prestazioni wire (a destra) dei topi (n = 15 per gruppo). Tutti i dati sono segnalati come mezzi ± errori standard. La figura è stata modificata da doi: 10.1038/mt.2016.13. 14

Qui descriviamo la consegna del microRNA usando un virus ricombinante adeno-associato sierotipo 9 in un modello murino di una malattia neuromuscolare. Una singola somministrazione periferica nei topi ha provocato la sovraespressione di miRNA sostenuta nel muscolo e motoneuroni, offrendo l'opportunità di studio miRNA funzione e potenziale terapeutico in vivo.

Consegna sistemica di MicroRNA usando ricombinanti Virus Adeno-associato sierotipo 9 per trattare malattie neuromuscolari in roditori

RNA interference via the endogenous miRNA pathway regulates gene expression by controlling protein synthesis through post-transcriptional gene silencing. ...

L'obiettivo generale di questo metodo è selezionare e somministrare un microRNA utilizzando un vettore virale adeno-associato ricombinante. Successivamente, consegnarlo al muscolo scheletrico e ai motoneuroni di topi, e valutarne l'efficacia nel migliorare i fenotipi della malattia. Questo metodo può contribuire a rispondere alla domanda fondamentale se una strategia basata sul silenziamento mediante microRNA possa essere impiegata per trattare condizioni neuromuscolari.Il principale vantaggio di questa tecnica consiste nell'utilizzo del virus adeno-associato di sierotipo 9 per somministrare un microRNA attraverso la circolazione sistemica al midollo spinale e ai muscoli scheletrici dei topi, al fine di silenziare direttamente un gene responsabile della malattia. Dividere la soluzione plasmidica AAV-microRNA in aliquote da 100 a 200 microlitri contenenti un carico virale compreso tra dieci e cento trilioni di genomi per millilitro. Successivamente, caricare un'aliquota in una siringa e applicare un ago da 27 a 30 gauge.Ora, utilizzando un contenitore standard per topi, fissare un topo in modo che la coda sia esposta. Quindi, pulire la coda con alcol al 70% e posizionare una borsa calda sotto la coda per circa 30 secondi per favorire la vasodilatazione. Successivamente, nella porzione distale della coda, inserire l'ago nella vena della coda con il bisellino rivolto verso l'alto e con un angolo poco pronunciato, di circa 15 gradi.Quindi, iniettare il virus e attendere alcuni secondi prima di rimuovere l'ago. Dopo aver rimosso l'ago, applicare una pressione moderata con due dita per arrestare eventuali sanguinamenti. Successivamente, restituire l'animale alla sua gabbia di mantenimento.Durante l'iniezione nella vena della coda, non è raro osservare un lampo di sangue nel connettore dell'ago. Durante l'iniezione, non dovrebbe esserci resistenza. Se la coda inizia a diventare pallida e a gonfiarsi, rimuovere l'ago e riprovare in prossimità del punto di inserimento precedente.Per questi test, i topi devono avere un'età superiore a quattro settimane e occorre raccogliere una misura di base prima del trattamento. La stanza in cui si svolgono i test deve essere tranquilla, buia e priva di disturbi. Portare i topi nella stanza almeno 30 minuti prima di eseguire qualsiasi test.Non disturbare gli animali durante questo periodo di acclimatizzazione. Iniziare con il test del filo sospeso. Prendere il topo per la coda e posizionarlo al centro della griglia di filo metallico.Quindi, sollevare la griglia da 15 a 20 pollici e capovolgere lentamente lo schermo per dare al topo il tempo di aggiustare la presa. Una volta che la griglia è completamente capovolta, avviare il cronometro e registrare il tempo di caduta. Consentire al topo di restare appeso per 60 secondi; se cade prima, riposizionarlo sulla griglia e ripetere la procedura.Se il topo rimane appeso per un intero minuto, registrare 60 secondi come punteggio e riportare il topo nella sua gabbia. Consentire a ciascun topo tre tentativi di rimanere appeso per 60 secondi. In caso contrario, registrare il tempo di sospensione più lungo.Dopo l'eutanasia del topo, prelevare il midollo spinale e quindi il muscolo scheletrico del quadriceps. Per congelare rapidamente i tessuti prelevati, riempire per metà una ciotola in acciaio inossidabile con 2-metilbutano e immergere il quarto inferiore della ciotola in azoto liquido. Attendere due minuti prima di procedere.Dopo alcuni minuti, trasferire il campione nel 2-metilbutano. Quando il campione diventa bianco, trasferirlo immediatamente in un contenitore immerso nel ghiaccio secco. Successivamente, conservare il campione a 80 gradi Celsius.Per l'analisi biochimica e la quantificazione dei microRNA, posizionare il tessuto raccolto in una provetta criogenica e congelarlo in azoto liquido. Successivamente, conservarlo a -80 gradi Celsius. I topi con SMAB sono stati iniettati con cento trilioni di genomi di AAV microR-298 all'età di cinque settimane.I topi SBMA portano un transgene del recettore degli androgeni umano con un tratto di poliglutammina anormalmente espanso. Entro le dieci settimane, sviluppano normalmente segni di malattia neuromuscolare. Il midollo spinale lombare e il muscolo quadricipite sono stati prelevati in diversi punti temporali dopo il trattamento per l'analisi.La RT-PCR quantitativa ha mostrato che l'espressione di micro-R298 ha raggiunto il massimo nel muscolo scheletrico dopo otto settimane e che l'espressione ha raggiunto il picco nel midollo spinale a 12 settimane. Dieci settimane dopo l'iniezione, la GFP è stata rilevata in entrambi i tessuti. Inoltre, l'espressione della GFP co-localizzava con il marcatore dei motoneuroni colina acetiltransferasi.In un esperimento di follow-up, i topi sono stati iniettati casualmente con il virus o con il veicolo all'età di sette settimane e successivamente sono stati pesati e sottoposti a test comportamentali settimanalmente, fino all'età di 40 settimane. Dieci settimane dopo l'iniezione, i topi trattati hanno iniziato ad aumentare di peso e a mostrare un miglioramento delle prestazioni motorie. La PCR quantitativa in tempo reale ha rivelato che il trattamento riduce i livelli di trascritto di AR nei tessuti colpiti.Dopo aver visto questo video, si dovrebbe avere una buona comprensione di come somministrare un microRNA utilizzando un vettore virale adeno-associato ricombinante mediante iniezione nella vena della coda. E di come eseguire saggi comportamentali che possono aiutare a valutare l'efficacia del microRNA somministrato nel migliorare l'atrofia e la debolezza degli arti inferiori nei topi. Le implicazioni di questa tecnica si estendono alle strategie di terapia genica, poiché una terapia genica sicura ed efficace richiede il trasferimento specifico del transgene terapeutico nei tessuti bersaglio.L'idea per questo metodo è nata quando abbiamo capito che le malattie causate da meccanismi di tossicità legati all'acquisto di funzione, come la SBMA, avrebbero potuto trarre beneficio dall'iperespressione di microRNA naturalmente presenti, specificamente mirati alla riparazione della regione tre-prime del trascritto della malattia.

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Consegna sistemica di MicroRNA usando ricombinanti Virus Adeno-associato sierotipo 9 per trattare malattie neuromuscolari in roditori

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