Consegna sistemica di MicroRNA usando ricombinanti Virus Adeno-associato sierotipo 9 per trattare malattie neuromuscolari in roditori
10 agosto 2018
Qui descriviamo la consegna del microRNA usando un virus ricombinante adeno-associato sierotipo 9 in un modello murino di una malattia neuromuscolare. Una singola somministrazione periferica nei topi ha provocato la sovraespressione di miRNA sostenuta nel muscolo e motoneuroni, offrendo l'opportunità di studio miRNA funzione e potenziale terapeutico in vivo.
L'obiettivo generale di questo metodo è quello di selezionare e fornire un microRNA utilizzando un vettore virale adeno-associato ricombinante. Quindi somministrarlo al muscolo scheletrico e ai motoneuroni dei topi e per valutare la loro efficacia nel migliorare i fenotipi della malattia. Questo metodo può aiutare a rispondere all'importante domanda se una strategia di silenziamento basata su microRNA possa essere impiegata per trattare le condizioni neuromuscolari.
Il vantaggio principale di questa tecnica è l'uso del virus del sierotipo 9 adeno-associato per fornire un microRNA attraverso la circolazione sistemica al midollo spinale e al muscolo scheletrico dei topi, per silenziare direttamente un gene bersaglio della malattia. Dividere lo stock di plasmidi AAV-microRNA in aliquote da 100 a 200 microlitri contenenti una carica virale da dieci a cento trilioni di genomi per millilitro. Quindi, caricare un'aliquota in una siringa e inserire un ago da 27 a 30 gauge.
Ora, utilizzando un sistema di ritenuta per mouse standard, fissare un mouse con la coda esposta. Quindi, pulire la coda con alcool al 70% e posizionare un tampone caldo sotto la coda per circa 30 secondi per aumentare la vasodilatazione. Ora, nella parte distale della coda, inserisci l'ago nella vena caudale con lo smusso rivolto verso l'alto e con un angolo poco profondo, circa 15 gradi.
Quindi, iniettare il virus e attendere qualche secondo prima di rimuovere l'ago. Dopo aver rimosso l'ago, applicare una pressione moderata con due dita per fermare l'emorragia. Quindi, riporta l'animale nella sua gabbia di casa.
Durante l'iniezione della vena caudale, non è raro vedere un lampo di sangue nel mozzo dell'ago. Durante l'iniezione, non dovrebbe esserci resistenza. Se la coda inizia a sbiancare e gonfiarsi, rimuovere l'ago e riprovare prossimalmente alla posizione di ingresso precedente.
Per questi test i topi devono avere più di quattro settimane ed essere sicuri di raccogliere una misura di base prima del trattamento. La sala prove deve essere silenziosa e buia senza disturbi. Porta i topi nella stanza almeno 30 minuti prima di eseguire qualsiasi test.
Non disturbare gli animali durante questo periodo di acclimatazione. Inizia con il test del filo sospeso. Prendi il mouse per la coda e posizionalo al centro della griglia metallica.
Quindi, solleva la griglia da 15 a 20 pollici e capovolgi lentamente lo schermo per dare al mouse il tempo di regolare la presa. Una volta che la griglia è completamente invertita, avvia il timer e registra il tempo di caduta. Lasciare che il mouse si agganci per 60 secondi, se cade prima, quindi riportarlo sulla griglia e ripetere la procedura.
Se il mouse si blocca per 60 secondi, registra 60 secondi per il punteggio e riporta il mouse nella sua gabbia. Consenti a ciascun mouse tre tentativi di mano 60 secondi. In caso contrario, segna il tempo di sospensione più lungo.
Dopo l'eutanasia, il topo preleva il midollo spinale e poi raccoglie il muscolo scheletrico del quadricipite. Per congelare a scatto i tessuti raccolti, riempire a metà una ciotola di acciaio inossidabile con 2-metilbutano e immergere il quarto inferiore della ciotola in azoto liquido. Attendere due minuti prima di procedere.
Dopo alcuni minuti, trasferire il campione nel 2-metilbutano. Quando il campione diventa bianco, trasferirlo immediatamente in un contenitore incorporato nel ghiaccio secco. Successivamente, conservare il campione a 80 gradi Celsius.
Per l'analisi biochimica e la quantificazione dei microRNA, posizionare il tessuto raccolto in un crioviale e congelarlo in azoto liquido. Quindi, conservalo a 80 gradi Celsius. Ai topi SBMA sono stati iniettati cento trilioni di genomi di AAV microR-298 a cinque settimane di età.
I topi SBMA trasportano il transgene del recettore degli androgeni umano con un tratto di poliglutammina espanso in modo anomalo. Entro dieci settimane, normalmente sviluppano segni di malattia neuromuscolare. Il midollo spinale lombare e il muscolo quadricipite sono stati prelevati in diversi punti temporali dopo il trattamento per l'analisi.
La RT-PCR quantitativa ha mostrato che l'espressione della micro-R298 ha raggiunto il picco nel muscolo scheletrico dopo otto settimane e che l'espressione ha raggiunto il picco nel midollo spinale a 12 settimane. Dieci settimane dopo l'iniezione, la GFP è stata rilevata in entrambi i tessuti. E l'espressione della GFP è co-localizzata con il marcatore del motoneurone colina acetiltransferasi.
In un esperimento di follow-up, ai topi è stato iniettato casualmente il virus, o veicolo, a sette settimane di età e sono stati poi pesati e analizzati comportamentali settimanalmente, fino a 40 settimane di età. Dieci settimane dopo l'iniezione, i topi trattati hanno iniziato ad aumentare di peso e hanno iniziato a mostrare un miglioramento delle prestazioni motorie. La PCR quantitativa in tempo reale ha rivelato che il trattamento riduce i livelli di trascrizione AR nei tessuti interessati.
Dopo aver visto questo video, dovresti avere una buona comprensione di come somministrare un microRNA utilizzando un vettore virale ricombinante associato ad adeno attraverso l'iniezione di coda vana. E come eseguire saggi comportamentali che possono aiutare a valutare l'efficienza del microRNA consegnato nel migliorare l'atrofia e la debolezza degli arti inferiori nei topi. L'implicazione di questa tecnica si estende agli approcci di terapia genica, perché una terapia genica sicura ed efficace richiede il trasferimento mirato di tessuti specifici del transgene terapeutico.
Abbiamo avuto l'idea di questo metodo quando ci siamo resi conto che la malattia causata da meccanismi tossici di guadagno di funzione, come l'SBMA, trarrebbe beneficio dalla sovraespressione di microRNA presenti in natura che mirano specificamente alla riparazione a tre primi del trascritto della malattia.
Panoramica
Questo articolo presenta un metodo per somministrare un microRNA (miRNA) utilizzando un vettore virale adeno-associato ricombinante (rAAV) al fine di bersagliare il muscolo scheletrico e i motoneuroni in un modello murino di atrofia muscolare spinobulbare (SBMA). L'approccio mira a valutare l'efficacia del silenziamento genico mediato da miRNA nel migliorare i fenotipi della malattia neuromuscolare, con implicazioni per la terapia genica nelle patologie caratterizzate da un effetto tossico di guadagno di funzione.
Componenti Chiave dello Studio
Area della Scienza
- Terapia genica
- Ricerca sulle malattie neuromuscolari
- Neuroscienze molecolari
Sfondo
- L'interferenza dell'RNA attraverso le vie endogene dei miRNA regola l'espressione genica a livello post-trascrizionale.
- La regolazione genica mediata da miRNA rappresenta una strategia terapeutica promettente per i disturbi neurologici causati da mutazioni con acquisizione di funzione tossica.
- La somministrazione efficiente di miRNA terapeutici ai tessuti bersaglio rimane una sfida significativa.
- La SMAB è una malattia neuromuscolare causata dall'espansione di poliglutamine nel gene del recettore degli androgeni (AR).
Scopo dello studio
- Verificare se la sovraespressione di un miRNA appena identificato che bersaglia il recettore degli androgeni (miR-298) possa migliorare i fenotipi della malattia nei topi con SBMA.
- Valutare l'efficienza della somministrazione sistemica del miR-298 mediante vettori rAAV9.
- Valutare l'impatto del miR-298 sui livelli di trascritto del recettore degli androgeni e sulla funzione neuromuscolare.
Metodi Utilizzati
- Preparazione di vettori rAAV9 che codificano per miR-298, aliquotati per iniezione.
- Somministrazione sistemica mediante iniezione nella vena della coda in topi con SBMA utilizzando un ago da 27 a 30 gauge.
- Valutazione comportamentale mediante il test del filo sospeso per analizzare la funzione motoria.
- Prelevamento di tessuti (midollo spinale e muscolo quadricipite) per analisi biochimica e quantificazione di miRNA mediante RT-PCR quantitativa.
- Immunofluorescenza per rilevare l'espressione di GFP e la co-localizzazione con marcatori dei motoneuroni.
Risultati principali
- L'iniezione endovenosa della coda con rAAV9-miR-298 ha determinato un'overespressione sostenuta e diffusa di miR-298 nel muscolo scheletrico e nei motoneuroni.
- L'espressione di miR-298 ha raggiunto il picco nel muscolo scheletrico a 8 settimane e nel midollo spinale a 12 settimane dall'iniezione.
- Il reporter GFP ha confermato un'efficace trasduzione e una co-localizzazione con i marcatori dei motoneuroni.
- I topi con SBMA trattati hanno mostrato un miglioramento nell'aumento di peso e nelle prestazioni motorie rispetto ai controlli.
- La RT-PCR quantitativa ha dimostrato una riduzione dei livelli di trascritto di AR nei tessuti colpiti dopo il trattamento.
Conclusioni
- La somministrazione sistemica di miR-298 mediante rAAV9 è efficace nel bersagliare il muscolo scheletrico e i motoneuroni nei topi con SBMA.
- L'overespressione di miR-298 migliora i fenotipi neuromuscolari e riduce i livelli del trascritto patogeno di AR.
- Questo approccio dimostra il potenziale delle strategie di silenziamento genico basate su miRNA per il trattamento delle malattie neuromuscolari causate da mutazioni con acquisizione di funzione tossica.
Domande frequenti
Rilevanza Industriale del Progetto
La somministrazione sistemica di miRNA mediante vettori rAAV9 consente un silenziamento genico mirato nei tessuti neuromuscolari, affrontando una sfida fondamentale nella terapia basata sull'interferenza dell'RNA per disturbi caratterizzati da un effetto tossico di acquisizione di funzione. Questo approccio favorisce una previsione affidabile dell'interazione con il bersaglio e della misurazione degli esiti funzionali, influenzando direttamente le decisioni nelle fasi iniziali della scoperta e del percorso traslazionale. La capacità del metodo di ottenere una modulazione sostenuta e specifica per tessuto dei geni coinvolti nella malattia lo posiziona come una piattaforma riutilizzabile per l'innovazione nella terapia genica applicata a patologie neuromuscolari.
Applicazioni Strategiche nella Ricerca e Sviluppo in Biopharma
Scoperta Precoce e Validazione del Target
- Permette l'analisi diretta della funzione dei geni associati a malattie mediante silenziamento mediato da miRNA in vivo.
- Supporta la riduzione del rischio biologico dimostrando l'interazione con il bersaglio in tessuti rilevanti.
- Facilita una valutazione predittiva affidabile nei test delle ipotesi terapeutiche per i disturbi neuromuscolari.
Sviluppo di screening e saggi
- Prepara modelli animali validati per saggi comportamentali e molecolari successivi.
- Standardizza la somministrazione e la quantificazione di agenti di silenziamento genico tra diversi gruppi.
- Consente la misurazione riproducibile della funzione motoria e della riduzione dei trascritti come parametri quantitativi.
Ricerca Translazionale e Preclinica
- Si allinea a modelli rilevanti per la malattia nello sviluppo traslazionale di biomarcatori.
- Garantisce continuità dalla scoperta meccanicistica alla valutazione dell'efficacia preclinica.
- Supporta l'avanzamento basato sulla valutazione del rischio collegando endpoint molecolari e funzionali.
Integrazione di Pipeline e Flusso di Lavoro
Questo metodo di somministrazione sistemica di miRNA collega la fase iniziale della scoperta, la validazione del bersaglio e la valutazione dell'efficacia preclinica nei modelli di malattie neuromuscolari.
- Biologia della scoperta: Dimostra il test delle ipotesi in vivo e la chiarificazione dei percorsi per bersagli con guadagno di funzione tossico.
- Screening: Stabilisce la prontezza e la riproducibilità del saggio per endpoint comportamentali e molecolari.
- Analisi: Fornisce letture quantitative di RT-PCR e comportamentali per il confronto tra diverse condizioni.
- Ricerca traslazionale: Collega l'efficacia del silenziamento genico al miglioramento funzionale in sistemi pertinenti alla malattia.
- Riutilizzo aziendale: Offre una piattaforma scalabile per valutare ulteriori candidati miRNA o bersagli della malattia.
Impatto Operativo ed Aziendale
- Valore scientifico: Aumenta la fiducia predittiva e riduce l'ambiguità meccanicistica nelle strategie di terapia genica.
- Valore operativo: Fornisce una modulazione genica standardizzata, scalabile e riproducibile in vivo.
- Valore strategico: Guida le decisioni di avanzamento o interruzione del progetto e migliora l'efficienza del capitale collegando gli esiti molecolari a quelli fenotipici.
- Impatto sul portafoglio: Permette una priorizzazione dei candidati alla terapia genica per indicazioni neuromuscolari adeguata al livello di rischio.
Considerazioni sull'implementazione
- Richiede competenze nella preparazione di vettori virali e nelle tecniche di somministrazione in vivo.
- Necessita dell'accesso a infrastrutture per saggi molecolari e comportamentali quantitativi.
- Richiede una standardizzazione tra team per le procedure di iniezione, raccolta dei tessuti e analisi.
- Potrebbe essere necessaria un'adattamento per diverse sequenze di miRNA o modelli di malattia.
- I limiti pratici includono il dosaggio del vettore, la specificità tissutale e il monitoraggio dell'espressione a lungo termine.
