Minimamente invasiva muscolo incorporamento (MIME) - una nuova tecnica sperimentale per facilitare la miogenesi donatore-cellulo-mediata

L'obiettivo generale di questa tecnica è quello di impiantare un piccolo segmento di tessuto muscolare del donatore in un muscolo ospite, al fine di promuovere la miogenesi mediata dalle cellule del donatore. Questo metodo può aiutare a rispondere a domande chiave nel campo della biologia muscolare rigenerativa, ad esempio, il tessuto muscolare raccolto post-mortem può promuovere la miogenesi mediata da cellule del donatore in un muscolo ospite. Il vantaggio principale di questa tecnica è che è minimamente invasiva.

Le implicazioni di questa tecnica si estendono alla terapia per le distrofie muscolari non letali perché una combinazione di inclusione muscolare, esercizio fisico e immunoterapia potrebbe essere in grado di ringiovanire il potenziale rigenerativo di alcuni muscoli colpiti. In qualità di fisioterapista e ingegnere biomedico, credo che la natura minimamente invasiva della procedura MIME sia fondamentale perché fornisce una fonte di cellule miogeniche, insieme a un'impalcatura tissutale naturale senza interrompere eccessivamente la struttura e la funzione muscolare dell'ospite. A dimostrare la procedura sarà la signorina Morium Begam, un'assistente di ricerca nel mio laboratorio.

Per iniziare, sopprimere topi C57 neri a sei donatori di età compresa tra 12 e 16 settimane come descritto nel protocollo di testo. Usa un paio di forbici chirurgiche per aprire la pelle sulla superficie anteriore della zampa posteriore. Dopo aver trovato il muscolo TA, rimuovilo per visualizzare il muscolo EDL situato dietro il muscolo TA.

Fai scorrere la punta di un paio di pinze dietro il muscolo e tira delicatamente per vedere se le dita dei piedi si estendono, confermando che il muscolo è l'EDL. Dopo aver identificato il muscolo EDL, utilizzare segmenti di seta 4-0 lunghi circa 10 centimetri per legare le suture guida sui tendini distali e prossimali. Fai due doppi nodi nelle suture dei tendini prossimali e distali del muscolo.

Taglia il tendine EDL distale e rifletti il muscolo. Quindi, taglia il tendine prossimale per rilasciare il muscolo. Posizionare i muscoli EDL raccolti in una capsula di Petri riempita con soluzione di ringer per topi.

Anestetizzare il topo ospite maschio NSG-GFP di 8-10 settimane, secondo il protocollo di testo. Applicare vaselina sugli occhi per prevenire la secchezza. Per preparare la pelle, applicare la crema depilatoria sulla faccia anteriore della zampa posteriore sinistra e lasciarla in posa per due minuti.

Utilizzando le salviette imbevute di PBS, rimuovere la crema depilatoria insieme al pelo. Per pulire la pelle, alternare il peeling con tre salviette di soluzione di iodio povidone ed etanolo al 70%. Per creare un tratto di ago nel muscolo TA ospite, far passare un ago chirurgico attraverso il centro del muscolo, lungo l'asse lungo del muscolo.

Assicurati di passare l'ago in direzione cefalo-caudale, lungo la lunghezza del muscolo TA e attraverso il centro del ventre muscolare. Dopo l'inserimento dell'ago, far passare le suture guida da un'estremità del tessuto donatore, attraverso il lume dell'ago chirurgico in direzione caudo-cefalica. Ritrarre l'ago dal muscolo ospite in direzione caudo-cefalica, per guidare il tessuto donatore attraverso il tratto dell'ago.

Posizionare correttamente il tessuto muscolare EDL del donatore all'interno del muscolo TA ospite, utilizzare le suture guida alle estremità caudale e cefalica del muscolo donatore. Dopo l'inclusione del tessuto donatore, tagliare le suture guida ed effettuare eventuali regolazioni con una pinza a punta fine. Infine, sigillare le ferite dell'ago nel tessuto muscolare chiudendo l'ammaccatura della ferita con una pinza e applicando l'adesivo per tessuti veterinari con la punta di un ago chirurgico calibro 27.

Dopo MIME, iniettare da 50 a 60 microlitri di cloruro di bario all'1,2% nel muscolo TA ospite in tre siti lungo la lunghezza del muscolo, un terzo prossimale, medio e distale del ventre muscolare. Dopo l'iniezione, pulire la zampa del topo ospite con etanolo e proteggere la pelle applicando un sottile strato di vaselina. Metti il topo in una gabbia di recupero solitaria senza lettiera.

Un termoforo in gel isotermico deve essere posizionato sotto la metà della gabbia per fornire supporto termico al mouse ospite, pur consentendo al mouse di spostarsi verso la metà non riscaldata. Al termine del recupero, rimetti il mouse nella sua gabbia originale. Usa un paio di forbici chirurgiche per aprire la pelle sulla superficie anteriore della gamba.

Dopo aver individuato il muscolo TA, tagliare il suo tendine distale e riflettere il muscolo. Tagliare il tendine del muscolo prossimale per rilasciare il muscolo TA. Raccogli sia i muscoli sinistro o trattato che quello destro o di controllo.

Pesare i muscoli raccolti posizionandoli su carta e bilancia. Per la crioprotezione, immergere brevemente i muscoli nell'olio minerale e poi asciugare l'olio in eccesso. Per spezzare congelare i muscoli, posizionarli su un foglio di alluminio e immergerli rapidamente in un pallone doppio riempito di azoto liquido.

Trasferire i campioni congelati in fiale criogeniche etichettate. L'inclusione precisa del tessuto del donatore all'interno del muscolo ospite è fondamentale per il successo del MIME. Dopo tre giorni, il muscolo EDL del donatore rimane impiantato nel muscolo TA ospite con segni di aghi ancora visibili sul muscolo ospite.

Inoltre, le sezioni trasversali dei muscoli donatori non mostrano fluorescenza verde. Considerando che la sezione trasversale dei muscoli ospiti lo fa. Nelle sezioni trasversali dei muscoli impiantati, c'è un chiaro confine tra le fibre muscolari della buccia positive GFP e le fibre muscolari del donatore GFP negative.

14 giorni dopo il trattamento, tutte le fibre muscolari e i muscoli non trattati sono GFP positivi. Ma non nei muscoli dell'ospite trattati. Molte di queste fibre negative GFP hanno dimostrato di essere vitali con l'etichettatura della desmina rossa.

Ciò dimostra che la MIME porta alla miogenesi derivata da cellule donatrici. Ci sono fibre muscolari chimeriche presenti nel muscolo TA. Rilevati dalla loro fluorescenza da bassa a moderata, probabilmente derivanti dalla fusione delle cellule miogeniche dell'ospite e del donatore.

La loro presenza su tutto il diametro del muscolo ospite suggerisce che le cellule miogeniche del donatore possono migrare per diverse centinaia di micron all'interno del muscolo. Una volta padroneggiata, questa tecnica può essere eseguita in 15-20 minuti, se eseguita correttamente. Dopo aver visto questo video, dovresti avere una buona comprensione di come utilizzare la tecnica MIME per incorporare un segmento di muscolo donatore in un muscolo ospite, al fine di facilitare la miogenesi mediata da cellule donatrici.

La tecnica MIME ci apre la strada per studiare se il muscolo umano cadaverico può promuovere o meno la miogenesi mediata da cellule del donatore in un topo ospite. Aiuta anche a valutare se la stimolazione elettrica neuromuscolare è in grado di migliorare la miogenesi mediata da cellule del donatore. Questo metodo può essere applicato anche ad altri sistemi, come la generazione di modelli animali di malattie umane mediante l'inserimento di un muscolo umano bioptico in animali ospiti e per verificare se i mimetici del tessuto muscolare contenenti cellule miogeniche possono promuovere la miogenesi.