Minimamente invasiva muscolo incorporamento (MIME) - una nuova tecnica sperimentale per facilitare la miogenesi donatore-cellulo-mediata

L'obiettivo generale di questa tecnica è impiantare un piccolo segmento di tessuto muscolare donatore in un muscolo ospite, al fine di promuovere la miogenesi mediata da cellule donatrici. Questo metodo può contribuire a rispondere a domande fondamentali nel campo della biologia muscolare rigenerativa, ad esempio se un tessuto muscolare prelevato post-mortem possa promuovere la miogenesi mediata da cellule donatrici in un muscolo ospite. Il principale vantaggio di questa tecnica è che essa è minimamente invasiva.

Le implicazioni di questa tecnica si estendono alla terapia delle distrofie muscolari non letali, poiché una combinazione di innesto muscolare, esercizio fisico e immunoterapia potrebbe essere in grado di rigenerare il potenziale rigenerativo di determinati muscoli colpiti. In quanto fisioterapista e ingegnere biomedico, ritengo che la natura minimamente invasiva della procedura MIME sia fondamentale perché fornisce una fonte di cellule miogeniche, insieme a un impalcatura tissutale naturale, senza alterare eccessivamente la struttura e la funzione del muscolo ospite. La procedura sarà dimostrata dalla signorina Morium Begam, assistente di ricerca nel mio laboratorio.

Per iniziare, sopprimere umanamente topi donatori C57 black six di età compresa tra 12 e 16 settimane come descritto nel protocollo testuale. Utilizzare un paio di forbici chirurgiche per aprire la pelle sulla superficie anteriore della zampa posteriore. Dopo aver individuato il muscolo TA, rimuoverlo per visualizzare il muscolo EDL situato dietro il muscolo TA.

Fare scivolare la punta di una pinzetta dietro il muscolo e tirare delicatamente per verificare se le dita dei piedi si estendono, confermando così che il muscolo è il EDL. Dopo aver identificato il muscolo EDL, utilizzare segmenti di seta 4-0 lunghi circa 10 centimetri per fissare suture guida ai tendini distale e prossimale. Fare due nodi doppi nelle suture dei tendini prossimale e distale del muscolo.

Tagliare il tendine distale del muscolo EDL e riflettere il muscolo. Successivamente, tagliare il tendine prossimale per rimuovere il muscolo. Posizionare i muscoli EDL raccolti in una piastra di Petri contenente soluzione ringer per topo.

Anestetizzare il topo ospite maschio NSG-GFP di otto-dieci settimane, seguendo il protocollo indicato nel testo. Applicare vaselina sugli occhi per prevenire l'essiccamento. Per preparare la cute, applicare una crema depilatoria sulla faccia anteriore della zampa posteriore sinistra e lasciarla agire per due minuti.

Utilizzando salviette imbevute di PBS, rimuovere la crema depilatoria insieme al pelo. Per pulire la pelle, alternare la detersione con tre salviette imbevute di soluzione di povidone-iodio e alcol al 70%. Per creare un tratto di ago nel muscolo TA dell'ospite, passare un ago chirurgico attraverso il centro del muscolo, lungo l'asse longitudinale del muscolo.

Assicurarsi di inserire l'ago in direzione cefalo-caudale, lungo la lunghezza del muscolo tibiale anteriore e attraverso il centro del ventre muscolare. Dopo l'inserimento dell'ago, passare le suture guida da un'estremità del tessuto donatore attraverso la cavità dell'ago chirurgico in direzione caudo-cefalica. Ritirare l'ago dal muscolo ricevente in direzione caudo-cefalica, per guidare il tessuto donatore attraverso il tratto lasciato dall'ago.

Posizionare correttamente il tessuto muscolare EDL del donatore all'interno del muscolo TA dell'ospite, utilizzando i punti guida alle estremità caudale e cefalica del muscolo donatore. Dopo l'inserimento del tessuto donatore, recidere i punti guida ed effettuare eventuali aggiustamenti con pinzette a punta fine. Infine, sigillare le ferite da ago nel tessuto muscolare chiudendo l'incisione con le pinzette e applicando un adesivo tissutale veterinario con la punta di un ago chirurgico da 27 gauge.

Dopo la MIME, iniettare da 50 a 60 microlitri di cloruro di bario al 1,2% nel muscolo TA dell'ospite in tre punti lungo la lunghezza del muscolo: terzo prossimale, medio e distale della massa muscolare. Dopo l'iniezione, pulire la zampa del topo ospite con etanolo e proteggere la pelle applicando uno strato sottile di vaselina. Posizionare il topo in una gabbia di recupero singola senza lettiera.

Un tappetino riscaldante isotermico deve essere posizionato sotto metà della gabbia per fornire supporto termico al topo ospite, consentendo comunque all'animale di spostarsi nella metà non riscaldata. Dopo un completo recupero, restituire il topo alla sua gabbia originale. Utilizzare un paio di forbici chirurgiche per aprire la pelle sulla superficie anteriore della zampa.

Dopo aver individuato il muscolo TA, recidere il tendine distale e riflettere il muscolo. Recidere il tendine muscolare prossimale per liberare il muscolo TA. Raccogliere entrambi i muscoli TA, quello sinistro o trattato e quello destro o di controllo.

Pesare i muscoli raccolti posizionandoli su carta da pesata e su una bilancia. Per la crioprotezione, immergere brevemente i muscoli nell'olio minerale e quindi asciugare l'eccesso di olio. Per congelare rapidamente i muscoli, posizionarli sulla carta d'alluminio e immergerli rapidamente in un matraccio doppio riempito di azoto liquido.

Trasferire i campioni congelati in provette criogeniche etichettate. L'inclusione precisa del tessuto donatore all'interno del muscolo ospite è fondamentale per il successo del MIME. Dopo tre giorni, il muscolo EDL donatore rimane impiantato nel muscolo TA ospite, con i segni dell'ago ancora visibili sul muscolo ospite.

Inoltre, le sezioni trasversali dei muscoli donatori non mostrano fluorescenza verde, mentre quelle dei muscoli ospiti sì. Nelle sezioni trasversali dei muscoli impiantati, è presente un confine chiaro tra le fibre muscolari dell'ospite positive per la GFP e le fibre muscolari donatrici negative per la GFP.

14 giorni dopo il trattamento, tutte le fibre muscolari e i muscoli non trattati sono positivi per GFP. Ma non nei muscoli ospiti trattati. Molte di queste fibre negative per GFP risultano vitali, come mostrato dall'etichettatura rossa della desmina.

Ciò dimostra che il MIME induce la miogenesi derivata dalle cellule donatrici. Sono presenti fibre muscolari chimeriche nel muscolo TA, rilevate in base alla loro fluorescenza da bassa a moderata, probabilmente derivante dalla fusione di cellule miogeniche dell'ospite e del donatore.

La loro presenza lungo l'intero diametro del muscolo ospite suggerisce che le cellule miogeniche donatrici possono migrare per diverse centinaia di micron all'interno del muscolo. Una volta padroneggiata, questa tecnica può essere eseguita in 15-20 minuti, se effettuata correttamente. Dopo aver visto questo video, si dovrebbe avere una buona comprensione di come utilizzare la tecnica MIME per inserire un segmento di muscolo donatore in un muscolo ospite, al fine di facilitare la miogenesi mediata da cellule donatrici.

La tecnica MIME ci permette di studiare se il muscolo umano cadaverico possa promuovere la miogenesi mediata da cellule donatrici in un topo ospite. Aiuta inoltre a valutare se la stimolazione elettrica neuromuscolare sia in grado di potenziare la miogenesi mediata da cellule donatrici. Questo metodo può essere applicato anche ad altri sistemi, come la generazione di modelli animali di malattie umane attraverso l'inserimento di muscolo umano ottenuto con biopsia in animali ospiti, e per verificare se i mimetici del tessuto muscolare contenenti cellule miogeniche possano promuovere la miogenesi.