La tecnica del frazionatore ottico per stimare i numeri di cella in un modello di ratto della terapia elettroconvulsiva
July 9th, 2017
Qui presentiamo un metodo stereologico, il frazionatore ottico, usato per quantificare la formazione di nuovi neuroni e la loro sopravvivenza nell'ippocampo del ratto dopo la stimolazione elettro-convulsiva. Quando viene correttamente implementata, la sensibilità e l'efficienza dei metodi stereologici garantiscono accurati stimi con una precisione fissa e predeterminata.
L'obiettivo generale di questo studio stereologico che utilizza il frazionatore ottico è quello di ottenere informazioni quantitative, come il numero totale di cellule in una specifica area del cervello, utilizzando metodi basati su principi imparziali. Questo metodo può aiutare a rispondere a domande chiave nel campo dell'analisi quantitativa, come la stima del numero totale di celle in una struttura completa di interesse. Uno dei principali vantaggi di questa tecnica è che fornisce stime accurate con una precisione fissa e predeterminata.
A dimostrare questa procedura è Esther Kjaer Needham, coautrice dell'articolo. Inizia con un cervello di ratto fisso e congelato. Usando un bisturi, separa gli emisferi destro e sinistro lungo la linea mediana del cervello e poi scegli l'uno o l'altro emisfero a caso nel primo cervello.
Successivamente si sposta sistematicamente tra l'emisfero destro e quello sinistro. Quindi utilizzare il mezzo di montaggio per montare l'emisfero scelto su un disco campione con un asse lungo perpendicolare al disco. Quando l'emisfero è montato sul disco, posizionare un tubo attorno all'emisfero e riempirlo con Tissue-Tek per coprire completamente l'emisfero.
Quindi, posizionare i contenitori multipiatto numerati nel criostato per il pre-raffreddamento. Quindi montare il disco del campione nel criostato e tagliare l'intero ippocampo iniziando in modo casuale in sezioni spesse 80 micron sul piano coronale. Durante il taglio, posizionare tutte le sezioni campionate consecutivamente nei contenitori freddi per multipiatti per garantire che le sezioni siano mantenute in ordine di taglio.
Quando l'intero ippocampo è stato sezionato, coprire completamente le sezioni con crioprotettore e mantenere i contenitori a meno 20 gradi Celsius fino a nuovo utilizzo. Quando sono pronte per iniziare l'immunocolorazione, lasciare che le sezioni raggiungano la temperatura ambiente. Quindi utilizzare un pennello per trasferire ogni quinta sezione da una serie di sezioni ippocampali a reti di colorazione a 25 pozzetti poste in piastre di Petri riempite con PBS.
Dovrebbero esserci da otto a 12 sezioni per ippocampo per la colorazione. Trasferire le reti coloranti contenenti le sezioni in piatti di vetro corrispondenti contenenti PBS e lavare le sezioni due volte per 10 minuti in PBS. Quindi incubare in perossido di idrogeno al 3% per 20 minuti.
Dopo il lavaggio, spostare le sezioni in tre soluzioni di acido cloridrico. Quindi neutralizzare in tetraborato di sodio 0,1 a temperatura ambiente per 20 minuti. Dopo tre incubazioni di 10 minuti e la sostituzione del tampone di lavaggio, trasferire le sezioni nella soluzione bloccante per un'ora a temperatura ambiente.
Quindi incubare le sezioni in topo anti-BrdU diluito da uno a 100 in soluzione bloccante per 48 ore a quattro gradi Celsius. Dopo l'incubazione degli anticorpi primari, lavare tre volte per 10 minuti ciascuna nel tampone di lavaggio. Quindi incubare per 48 ore in perossidasi di rafano diluita da uno a 10 in tampone di lavaggio.
48 ore dopo, trasferire le sezioni su PBS per 10 minuti e ripetere per un totale di cinque lavaggi. Dopo il lavaggio, trasferire le sezioni nella soluzione DAB per sette minuti. Quindi trasferire in una soluzione DAB contenente perossido di idrogeno allo 0,02% per 10 minuti.
Dopo una serie di lavaggi, montare le sezioni in ordine numerico sui vetrini del microscopio. Lasciare asciugare per circa 30 minuti. Quindi asciugare i campioni all'aria mettendoli in un rack per vetrini.
Successivamente, reidratare i campioni per 10 minuti in una capsula per la colorazione dei vetrini contenente acqua distillata. Quindi trasferire i vetrini allo 0,02% di violetta cresyl e acqua distillata per 15 minuti. Dopo aver ripetuto la colorazione con cresil violetto, reidratare le sezioni attraverso una serie di etanolo.
Quindi eliminare le sezioni in xilene due volte per 15 minuti ogni volta. Infine, aggiungere il mezzo di montaggio ad asciugatura rapida e coprire i vetrini. Dopo 24 ore i vetrini possono essere utilizzati per la microscopia.
Iniziare controllando lo spessore del tessuto posizionando prima i vetrini sul tavolino motorizzato del microscopio e poi aprendo il software di stereologia. Delinea l'area di interesse utilizzando un obiettivo a basso ingrandimento prima di passare a un obiettivo a immersione in olio 100x. Scegliete quindi un punto specifico in un fotogramma di conteggio, ad esempio un'area adiacente a un angolo, e individuate la parte superiore della sezione spostandovi lungo il piano focale fino a quando una parte della sezione non appare a fuoco.
Registra la posizione Z come zero. Quindi, sposta il piano focale verso il basso attraverso il tessuto fino a quando l'ultimo livello Z di tessuto è a fuoco, quindi segna questa posizione. Lo spessore locale del tessuto è definito da zero a questo punto finale e può essere letto sull'asse Z.
Registrare lo spessore del tessuto. Lo spessore del tessuto viene misurato in diversi punti all'interno della regione di interesse. L'altezza del dissettore e delle zone di guardia, le dimensioni del telaio di conteggio, la lunghezza del passo e l'ingrandimento finale sono determinati in uno studio pilota.
Ora puoi iniziare a contare i neuroni Brd-U positivi, di solito a un ingrandimento finale da 2000 a 3000x utilizzando un obiettivo a olio 60x o 100x e un'apertura numerica elevata. Identifica i neuroni BrdU-positivi in ogni frame di conteggio, ma non contare quelli che toccano la linea di esclusione rossa. Conta quei neuroni BrdU-positivi che toccano la linea di inclusione verde e quelli che rientrano nel limite del frame di conteggio.
Contare i neuroni Brd-U positivi solo quando la caratteristica di interesse è chiaramente riconosciuta all'interno dell'altezza del dissettore. I neuroni semi-visibili mostrati qui non vengono contati. Questa immagine mostra il numero totale di neuroni BrdU-positivi nello strato di cellule granulari dell'ippocampo e nella zona subgranulare dell'ippocampo di ratto.
Le barre orizzontali rappresentano i valori medi. Dopo la stimolazione elettroconvulsivante si verifica un aumento immediato del 260% nella formazione di nuovi neuroni BrdU-positivi rispetto ai controlli trattati. In questo pool di neuroni di nuova generazione c'è il 40% di attrito dal primo giorno ai tre mesi, con quasi il 50% dei neuroni di nuova formazione che sopravvivono 12 mesi dopo il trattamento.
Dopo aver visto questo video dovresti avere una buona comprensione di come ottenere una stima del numero totale di cellule in una regione del cervello utilizzando metodi stereologici.
Panoramica
Questo studio presenta un metodo stereologico, l'optical fractionator, per quantificare la formazione di nuovi neuroni e la sopravvivenza nell'ippocampo del ratto dopo la stimolazione elettroconvulsiva. Il metodo garantisce stime accurate con una precisione predeterminata.
Componenti chiave dello studio
Area della scienza
- Neuroscienza
- Stereologia
- Neurogenesi
Contesto
- L'optical fractionator è una tecnica stereologica utilizzata per il conteggio delle cellule.
- Fornisce stime imparziali delle popolazioni cellulari in specifiche regioni cerebrali.
- Comprendere la neurogenesi è cruciale per ottenere informazioni sulla plasticità e la ripresa del cervello.
- La stimolazione elettroconvulsiva è nota per influenzare la neurogenesi nell'ippocampo.
Obiettivo dello studio
- Quantificare il numero totale di nuovi neuroni formati nell'ippocampo del ratto.
- Valutare il tasso di sopravvivenza di questi neuroni nel tempo.
- Dimostrare l'efficacia del metodo dell'optical fractionator.
Metodi utilizzati
- Preparazione del tessuto cerebrale del ratto utilizzando un criostato.
- Immunocolorazione per BrdU per identificare i neuroni di nuova formazione.
- Conteggio stereologico dei neuroni BrdU-positivi mediante microscopia.
- Analisi statistica dei tassi di sopravvivenza dei neuroni dopo il trattamento.
Risultati principali
- La stimolazione elettroconvulsiva ha portato a un aumento del 260% nella formazione di nuovi neuroni.
- È stata osservata un'attrizione del 40% dei neuroni di nuova formazione entro i primi tre mesi.
- Quasi il 50% dei neuroni di nuova formazione è sopravvissuto 12 mesi dopo il trattamento.
- L'optical fractionator ha fornito stime precise delle popolazioni cellulari.
Conclusioni
- L'optical fractionator è un metodo efficace per quantificare la neurogenesi.
- La stimolazione elettroconvulsiva aumenta significativamente la formazione di nuovi neuroni.
- Comprendere la sopravvivenza dei neuroni è vitale per le strategie terapeutiche nelle malattie neurodegenerative.
Domande frequenti
Executive Industry Relevance
Quantitative cell population estimation is critical for validating neurogenesis targets and de-risking mechanistic hypotheses in CNS drug discovery. The optical fractionator technique enables unbiased, reproducible measurement of neuron production and survival, supporting predictive confidence in early-stage neurobiology programs. This capability strengthens translational continuity from discovery through preclinical assessment in neuropsychiatric and neurodegenerative research portfolios.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Enables rigorous quantification of neurogenesis for target validation in CNS models.
- Supports mechanistic de-risking by providing unbiased cell number estimates.
- Facilitates hypothesis-driven interrogation of neurogenic pathways post-intervention.
- Improves predictive confidence for advancing neuroplasticity targets.
Screening & Assay Development
- Establishes validated, quantitative readouts for neuron formation and survival.
- Standardizes cell counting workflows for reproducibility across studies.
- Prepares robust biological systems for downstream compound screening.
- Enables scalable assessment of neurogenic effects in preclinical models.
Translational & Preclinical Research
- Aligns quantitative outputs with disease-relevant neurogenesis endpoints.
- Supports continuity from discovery to preclinical validation of neurogenic interventions.
- Enables risk-adjusted advancement decisions based on neuron survival metrics.
- Provides translationally relevant data for biomarker and efficacy studies.
Pipeline & Workflow Integration
The optical fractionator method integrates into the discovery-to-preclinical continuum by delivering unbiased, quantitative neuron counts that inform target validation, screening, and translational research decisions.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing and pathway clarification by quantifying neurogenesis post-intervention.
- Screening: Delivers reproducible, quantitative cell counts for assay readiness and compound evaluation.
- Analytics: Provides statistical outputs and precision thresholds for comparing experimental conditions.
- Translational Research: Bridges discovery findings to preclinical models with disease-relevant neurogenesis data.
- Enterprise Reuse: Offers a standardized, reusable workflow for unbiased cell quantification across CNS programs.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence and reduces mechanistic ambiguity in neurogenesis studies.
- Operational Value: Delivers standardized, reproducible, and scalable cell counting workflows.
- Strategic Value: Enables informed go/no-go decisions and capital-efficient portfolio management.
- Portfolio Impact: Supports risk-adjusted prioritization and advancement of neurogenic targets.
Implementation Considerations
- Requires expertise in stereology and neuroanatomical tissue handling.
- Needs access to advanced microscopy and stereology software infrastructure.
- Demands cross-team standardization of sampling and counting protocols.
- Must be adapted for different brain regions or disease models as needed.
- Precision and accuracy depend on rigorous adherence to unbiased sampling principles.
