La tecnica del frazionatore ottico per stimare i numeri di cella in un modello di ratto della terapia elettroconvulsiva

L'obiettivo generale di questo studio stereologico che utilizza il frazionatore ottico è ottenere informazioni quantitative, come il numero totale di cellule in una specifica area cerebrale, mediante metodi basati su principi privi di bias. Questo metodo può contribuire a rispondere a domande fondamentali nel campo dell'analisi quantitativa, come la stima del numero totale di cellule in una struttura d'interesse completa. Uno dei principali vantaggi di questa tecnica è che fornisce stime accurate con una precisione fissa e predeterminata.

La procedura è dimostrata da Esther Kjaer Needham, coautrice dell'articolo. Iniziare con un cervello di ratto fisso e congelato. Utilizzando un bisturi, separare gli emisferi destro e sinistro lungo la linea mediana del cervello, quindi scegliere casualmente uno dei due emisferi nel primo cervello.

Successivamente, passare sistematicamente da un emisfero all'altro, destro e sinistro. Quindi utilizzare un mezzo di montaggio per fissare l'emisfero scelto su un disco campione, con l'asse maggiore perpendicolare al disco. Una volta posizionato l'emisfero sul disco, posizionare un tubo attorno all'emisfero e riempirlo con Tissue-Tek fino a coprire completamente l'emisfero.

Successivamente, posizionare i contenitori multi-pozzetto numerati nel criostato per il pre-raffreddamento. Quindi montare il disco del campione nel criostato e tagliare l'intero ippocampo, iniziando in modo casuale, in sezioni spesse 80 micron nel piano coronale. Durante il taglio, posizionare tutte le sezioni campionate consecutivamente nei contenitori multi-pozzetto refrigerati per garantire che le sezioni siano mantenute nell'ordine di taglio.

Una volta completato il sezionamento di tutto l'ippocampo, coprire completamente i tagli con crioprotettore e mantenere i contenitori a meno 20 gradi Celsius fino all'uso successivo. Quando si è pronti per iniziare la marcatura immunoistochimica, portare i tagli a temperatura ambiente. Successivamente, utilizzare un pennello per trasferire ogni quinto taglio da una serie di sezioni dell'ippocampo su retine da colorazione da 25 pozzetti posizionate in piastre di Petri riempite con PBS.

Dovrebbero esserci da otto a dodici sezioni per ippocampo da colorare. Trasferire le reti di colorazione contenenti le sezioni in piatti di vetro corrispondenti contenenti PBS e lavare le sezioni due volte per 10 minuti in PBS. Successivamente, incubare in perossido di idrogeno al 3% per 20 minuti.

Dopo il lavaggio, trasferire i preparati a tre soluzioni di acido cloridrico. Neutralizzare quindi in tetraborato di sodio 0,1 M a temperatura ambiente per 20 minuti. Dopo tre incubazioni di 10 minuti ciascuna con cambio del buffer di lavaggio ad ogni passaggio, trasferire i preparati in soluzione di blocco per un'ora a temperatura ambiente.

Quindi incubare le sezioni in anticorpo anti-BrdU di topo diluito 1:100 in soluzione di blocco per 48 ore a quattro gradi Celsius. Dopo l'incubazione con l'anticorpo primario, lavare tre volte per 10 minuti ciascuno in tampone di lavaggio. Quindi incubare per 48 ore in perossidasi di rafano diluita 1:10 in tampone di lavaggio.

48 ore dopo trasferire le sezioni in PBS per 10 minuti e ripetere per un totale di cinque lavaggi. Dopo il lavaggio, trasferire le sezioni in soluzione di DAB per sette minuti. Successivamente trasferire in soluzione di DAB contenente perossido di idrogeno allo 0,02% per 10 minuti.

Dopo una serie di lavaggi, montare i campioni in ordine numerico su vetrini per microscopio. Lasciare asciugare per circa 30 minuti. Successivamente, far asciugare all'aria i campioni posizionandoli su un portavetrini.

Successivamente, reidratare i campioni per 10 minuti in una vaschetta per colorazione contenente acqua distillata. Trasferire quindi i vetrini in una soluzione di violetto di cresile allo 0,02% in acqua distillata per 15 minuti. Dopo aver ripetuto la colorazione con il violetto di cresile, reidratare le sezioni mediante una serie alcolica.

Quindi, sgrassare i preparati con xilene due volte, per 15 minuti ogni volta. Infine, aggiungere un mezzo di montaggio a essiccazione rapida e applicare il coprioggetti sui vetrini. Dopo 24 ore, i vetrini possono essere utilizzati per l'analisi microscopica.

Cominciare verificando lo spessore del tessuto posizionando prima i vetrini sullo stadio motorizzato del microscopio e quindi aprendo il software di stereologia. Delimitare l'area di interesse utilizzando un obiettivo a basso ingrandimento prima di passare a un obiettivo ad immersione in olio da 100x. Successivamente, scegliere un punto specifico all'interno di un campo di conteggio, ad esempio un'area adiacente a un angolo, e individuare la superficie superiore della sezione spostandosi lungo il piano focale finché una caratteristica della sezione diventa a fuoco.

Registrare la posizione Z come zero. Successivamente, spostare il piano focale verso il basso attraverso il tessuto fino a quando l'ultimo livello Z del tessuto è a fuoco, quindi segnare questa posizione. Lo spessore locale del tessuto è definito da zero fino a questo punto finale ed è possibile leggerlo sull'asse Z.

Registrare lo spessore del tessuto. Lo spessore del tessuto viene misurato in diversi punti all'interno della regione di interesse. L'altezza del dissecatore e delle zone di guardia, le dimensioni del campo di conteggio, la lunghezza del passo e l'ingrandimento finale vengono determinate in uno studio pilota.

Ora è possibile iniziare a contare i neuroni positivi per Brd-U, solitamente con un ingrandimento finale compreso tra 2000 e 3000x, utilizzando un obiettivo a immersione in olio da 60x o 100x e un'alta apertura numerica. Identificare i neuroni positivi per BrdU in ogni campo di conteggio, ma non contare quelli che toccano la linea rossa di esclusione. Contare i neuroni positivi per BrdU che toccano la linea verde di inclusione e quelli che rientrano entro i limiti del campo di conteggio.

Contare solo i neuroni positivi per Brd-U quando la caratteristica di interesse è chiaramente riconoscibile all'interno dell'altezza del dissecatore. I neuroni semi-visibili mostrati qui non vengono conteggiati. Questa immagine mostra il numero totale di neuroni positivi per BrdU nello strato delle cellule granulari e nella zona subgranulare dell'ippocampo del ratto.

I barre orizzontali rappresentano i valori medi. Dopo la stimolazione elettroconvulsiva si osserva un aumento immediato del 260% nella formazione di nuovi neuroni positivi per BrdU rispetto ai controlli trattati. In questo gruppo di neuroni appena generati si verifica una riduzione del 40% dal primo giorno fino a tre mesi, con quasi il 50% dei neuroni appena formati che sopravvive a 12 mesi dal trattamento.

Dopo aver visto questo video, dovresti avere una buona comprensione di come ottenere una stima del numero totale di cellule in una regione cerebrale utilizzando metodi stereologici.