Analisi di supercomplexes della catena di trasporto elettronico mitocondriale con elettroforesi nativa, analisi in-gel e elettroelution

L'obiettivo generale dell'elettroforesi nativa in combinazione con saggi in gel, immunoblotting ed elettroelusione nativa è preservare e analizzare l'assemblaggio dei supercomplessi mitocondriali. Questo metodo può aiutare a comprendere in che modo i complessi proteici della catena di trasporto degli elettroni mitocondriale si assemblano in supercomplessi in base a numerosi fattori, tra cui le esigenze bioenergetiche e le condizioni fisiologiche e patologiche. Il principale vantaggio di questa tecnica è che, se eseguita correttamente, l'integrità fisiologica e la funzionalità dei supercomplessi mitocondriali vengono preservate durante l'intero processo di isolamento, che risulta piuttosto lungo.

Questo metodo può essere applicato anche per studiare la dinamica dell'assemblaggio dei supercomplessi e per analizzare i complessi proteici nella membrana plasmatica, così come in altre membrane intracellulari. Durante la preparazione per i saggi in gel, è assolutamente fondamentale che tutti i componenti utilizzati per l'elettroforesi nativa non siano contaminati da detergenti, poiché questi causerebbero la disintegrazione dei supercomplessi mitocondriali. Tagliare una o più corsie da un gel nativo trasparente e trasferirle in un contenitore etichettato.

Per eseguire il saggio del complesso-1, mescolare 10 millilitri di tampone per il saggio con 25 milligrammi di tetrazolio blu nitro e 100 microlitri di NADH al 10 milligrammi per millilitro. Aggiungere questa soluzione alla striscia o area di interesse del gel nativo trasparente escisso. Seguire lo sviluppo delle bande blu dopo un'agitazione delicata su un agitatore per almeno tre minuti.

Quindi, fissare il gel in 10-20 millilitri di soluzione di acido acetico oppure lavarlo in Tris 5 millimolare a pH 7,4 per arrestare la reazione. Scattare fotografie per la documentazione. Per eseguire il saggio del complesso 5, ottenere un gel, una corsia o un'area di interesse da un gel blue native o clear native.

Incubare il campione per due ore con agitazione delicata in 10-20 millilitri di tampone per saggio, con o senza cinque microgrammi per millilitro di oligomicina, a temperatura ambiente. Al termine dell'incubazione, sostituire il tampone con 14 millilitri di tampone per saggio fresco. Quindi aggiungere, nell'ordine, 190 microlitri di solfato di magnesio uno molare, 27,28 milligrammi di nitrato di piombo, 60 milligrammi di ATP e 75 microlitri di oligomicina.

Incubare con agitazione delicata e osservare la formazione di un precipitato bianco, poiché le bande nei gel trattati con oligomicina mostreranno bande indipendenti dal complesso 5. Fissare il gel con un fissativo a base di metanolo, poiché soluzioni acide scioglierebbero il precipitato di piombo. Fotografare i risultati e procedere con il trasferimento proteico e l'immunoblotting, come descritto nel protocollo del testo.

Nel giorno dell'elettroeluzione, posizionare un fritto sul fondo di ogni provetta di vetro da utilizzare. Se necessario, immergere la provetta nel tampone di eluzione e spingere il fritto dall'interno verso il fondo della provetta. Inserire la provetta con il fritto nel modulo dell'Elettro-Elutore.

Inumidire il manicotto con il tampone di eluizione e inserire il tubo di vetro al suo posto. Assicurarsi che le estremità superiori dei tubi di vetro siano allineate con il manicotto. Chiudere i manicotti vuoti con dei tappi.

Successivamente, posizionare un cappuccio di membrana bagnata nella parte inferiore dell'adattatore in silicone e riempire l'adattatore con il buffer di eluizione. Pipettare lentamente su e giù il buffer e l'adattatore per rimuovere eventuali bolle d'aria attorno alla membrana di dialisi. Far scorrere l'adattatore riempito di buffer nella parte inferiore del tubo di vetro.

Quindi, rimuovere tutte le bolle che compaiono sul frit all'interno del tubo di vetro. Riempire ogni tubo di vetro con il buffer di eluizione. Inserire le bande escisse della BN-PAGE nei tubi di vetro.

Tagliare i pezzi più grandi in pezzi più piccoli. Assicurarsi che l'altezza del materiale all'interno del tubo di vetro sia di circa un centimetro. Successivamente, inserire l'intero modulo nel serbatoio.

Aggiungere circa 600 millilitri di tampone di eluizione freddo nel serbatoio. Assicurarsi che i tappi adattatori in silicone siano immersi nel tampone. Posizionare una barretta magnetica sul fondo del serbatoio prima di eluire le proteine per quattro ore a 350 volt in una stanza fredda.

Al termine dell'eluzione, rimuovere il modulo Electro-Eluter dalla vasca del tampone e posizionarlo in un lavello o in una ciotola. Se è stato utilizzato un tappo, rimuoverlo per far defluire la camera superiore del tampone. Rimuovere il tampone da ciascun tubo di vetro e smaltirlo.

Assicurarsi che l'adattatore in silicone rimanga al proprio posto e che il liquido sotto il fritto non venga disturbato o agitato. Successivamente, rimuovere con attenzione l'adattatore in silicone, insieme al tappo della membrana, dalla parte inferiore del tubo di vetro. Pipettare il contenuto del tappo in silicone in una microprovetta.

Con altri 200 microlitri di tampone di eluizione, risciacquare il tappo in silicone e aggiungerli al microtubo. Ripetere questa procedura per tutti i tubi di vetro. Conservare i tappi a membrana riutilizzabili ponendoli in tampone di eluizione contenente 0,5 milligrammi per millilitro di azoturo di sodio e conservarli in frigorifero.

I supercomplessi provenienti dai mitocondri cardiaci sono visualizzati qui mediante saggi in gel. Le corsie del gel nativo trasparente vengono utilizzate per saggi in gel per il complesso 1 e il complesso 5. La specificità del segnale può essere valutata utilizzando inibitori, come l'oligomicina per l'ATP-sintasi.

I saggi in gel forniscono informazioni riguardo alle dimensioni di un complesso proteico, con attività del complesso-1 o del complesso-5, ma non sulla loro composizione. La corsa elettroforetica in gel nativo blu mostra bande di complessi proteici che possono essere escisse per l'elettroeluzione. Dopo l'elettroeluzione, l'eluito viene utilizzato per ulteriori analisi, come saggi in gel, colorazione argentica delle proteine eluite mediante elettroforesi nativa o denaturante, e immunoblotting.

Una volta padroneggiata, questa tecnica può essere completata entro tre giorni se eseguita correttamente. Questi tre giorni includono l'isolamento dei mitocondri, l'esecuzione di un'elettroforesi nativa blu maxi overnight e l'immunoblotting. Dopo aver visto questo video, si dovrebbe avere una buona comprensione di come isolare e identificare i supercomplessi mitocondriali utilizzando l'elettroforesi nativa, saggi in gel ed elettroeluzione.

Nel tentativo di eseguire questa procedura, è importante ricordare che i supercomplessi mitocondriali sono fragili. Il congelamento e lo scongelamento dei campioni devono essere ridotti al minimo. L'elettroforesi nativa e l'elettroelusione devono essere eseguite su ghiaccio o in ambiente refrigerato.

Le implicazioni di queste tecniche vanno oltre la definizione della composizione fisica di ciascun supercomplesso. Poiché i supercomplessi vengono catturati nella loro forma nativa, è possibile eseguire saggi funzionali. Dopo il suo sviluppo, questa tecnica ha permesso ai ricercatori nel campo della biologia mitocondriale di rivalutare la comprensione dell'attività del trasporto di elettroni mitocondriale e delle sue conseguenze per i pazienti affetti da malattie mitocondriali.

Seguendo questa procedura, altri metodi come HPLC, spettroscopia di massa, microscopia elettronica o patch clamping possono essere eseguiti per rispondere ad ulteriori domande riguardo alla composizione molecolare, alla struttura o alle proprietà elettrofisiologiche dei complessi proteici isolati.