Analisi di supercomplexes della catena di trasporto elettronico mitocondriale con elettroforesi nativa, analisi in-gel e elettroelution

L'obiettivo generale dell'elettroforesi nativa in combinazione con saggi in-gel, immunoblotting ed elettroeluizione nativa è quello di preservare e analizzare l'assemblaggio dei supercomplessi mitocondriali. Questo metodo può aiutare a rispondere a come i complessi proteici della catena di trasporto degli elettroni mitocondriali si assemblano in supercomplessi a seconda di molti fattori, tra cui le esigenze bioenergetiche e le condizioni fisiologiche e patologiche. Il vantaggio principale di questa tecnica è che, se eseguita correttamente, l'integrità fisiologica e la funzionalità dei supercomplessi mitocondriali vengono preservate durante il lungo processo di isolamento.

Questo metodo può essere applicato anche per studiare la dinamica dell'assemblaggio dei supercomplessi e per analizzare i complessi proteici nella membrana plasmatica, così come in altre membrane intracellulari. Quando ci si prepara per i saggi in gel, è assolutamente fondamentale che tutte le parti utilizzate per l'elettroforesi nativa non siano contaminate da detergenti, in quanto contribuiranno alla disintegrazione dei supercomplessi mitocondriali. Taglia una o più corsie da un gel nativo trasparente e trasferiscile in un contenitore etichettato.

Per eseguire il test del complesso-1, combinare 10 millilitri di tampone per il saggio con 25 milligrammi di nitro blu tetrazolio e 100 microlitri di 10 milligrammi per millilitro di NADH. Aggiungilo alla corsia di gel nativa chiara asportata o all'area di interesse. Seguire lo sviluppo delle bande blu dopo una leggera agitazione su un bilanciere per almeno tre minuti.

Quindi, fissare il gel in 10-20 millilitri di soluzione di acido acetico o lavare con Tris pH 7,4 da cinque millimolari per fermare la reazione. Scatta fotografie per la documentazione. Per eseguire il test del complesso-5, ottenere un gel, una corsia o un'area di interesse da un gel nativo blu o nativo chiaro.

Incubare il campione per due ore agitando delicatamente in 10-20 millilitri di tampone di analisi, più o meno cinque microgrammi per millilitro di oligomicina a temperatura ambiente. Dopo l'incubazione, sostituire il tampone con 14 millilitri di tampone di saggio fresco. Quindi aggiungere, nell'ordine, 190 microlitri di solfato di magnesio molare, 27,28 milligrammi di nitrato di piombo, 60 milligrammi di ATP e 75 microlitri di oligomicina.

Incubare con una leggera agitazione e osservare la presenza di un precipitato bianco poiché le bande sui gel trattati con oligomicina daranno bande non dipendenti dal complesso 5. Fissare il gel in un fissativo a base di metanolo perché le soluzioni acide dissolveranno il precipitato di piombo. Fotografare i risultati e seguire con il trasferimento proteico e l'immunoblotting, come descritto nel protocollo di testo.

Il giorno dell'elettroeluizione, posizionare una fritta sul fondo di ogni tubo di vetro da utilizzare. Se necessario, posizionare il tubo di vetro nel tampone di eluizione e spingere la fritta dall'interno verso il fondo del tubo. Spingere il tubo di vetro con la fritta nel modulo dell'Electro-Eluter.

Inumidire l'anello di tenuta con il tampone di eluizione e far scorrere il tubo di vetro in posizione. Assicurarsi che la parte superiore dei tubi di vetro sia a filo con l'anello di tenuta. Chiudere gli anelli di tenuta vuoti con i tappi.

Quindi, posizionare un cappuccio della membrana bagnato nella parte inferiore dell'adattatore in silicone e riempire l'adattatore con il tampone di eluizione. Pipettare lentamente il tampone e l'adattatore su e giù per rimuovere eventuali bolle d'aria attorno alla membrana di dialisi. Far scorrere l'adattatore riempito di tampone sul fondo del tubo di vetro.

Quindi, rimuovere tutte le bolle che appaiono sulla fritta all'interno del tubo di vetro. Riempire ogni provetta di vetro con il tampone di eluizione. Posizionare le bande asportate del BN-PAGE nei tubi di vetro.

Tagliare i pezzi grandi in pezzi più piccoli. Assicurarsi che l'altezza di riempimento all'interno del tubo di vetro sia di circa un centimetro. Quindi, posizionare l'intero modulo nel serbatoio.

Aggiungere circa 600 millilitri di tampone di eluizione a freddo al serbatoio. Assicurarsi che i cappucci dell'adattatore in silicone siano immersi nel tampone. Posizionare una barra di agitazione sul fondo del serbatoio prima di eluire le proteine per quattro ore a 350 volt in una cella frigorifera.

Al termine dell'eluizione, rimuovere il modulo Electro-Eluter dal serbatoio di accumulo e posizionarlo in un lavandino o in una ciotola. Se è stato utilizzato un tappo, rimuoverlo per svuotare la camera tampone superiore. Rimuovere il tampone da ogni tubo di vetro e gettarlo.

Assicurarsi che l'adattatore in silicone rimanga in posizione e che il liquido sotto la fritta non venga disturbato o scosso. Quindi, rimuovere con cautela l'adattatore in silicone, insieme al cappuccio della membrana dal fondo del tubo di vetro. Pipettare il contenuto del tappo in silicone in una microprovetta.

Con altri 200 microlitri di tampone di eluizione, sciacquare il tappo in silicone e aggiungere alla microprovetta. Ripetere questo processo per tutti i tubi di vetro. Conservare i cappucci delle membrane riutilizzabili inserendoli in un tampone di eluizione contenente 0,5 milligrammi per millilitro di azoturo di sodio e conservarli in frigorifero.

I supercomplessi dei mitocondri cardiaci sono visualizzati qui mediante saggi in-gel. Le corsie del gel nativo chiaro sono utilizzate per i saggi in-gel per il complesso-1 e il complesso-5. La specificità del segnale può essere valutata utilizzando inibitori, come l'oligomicina per l'ATP-sintasi.

I saggi in-gel forniscono informazioni sulle dimensioni di un complesso proteico, con attività del complesso-1 o del complesso-5, ma non sulla loro composizione. Il gel nativo blu mostra bande di complessi proteici che possono essere asportati per l'elettroeluizione. Dopo l'elettroeluizione, l'eluato viene utilizzato per ulteriori analisi, come saggi in gel, colorazione con argento delle proteine eluite mediante elettroforesi nativa o denaturante e Western blotting.

Una volta padroneggiata, questa tecnica può essere eseguita entro tre giorni se eseguita correttamente. Questi tre giorni includono l'isolamento dei mitocondri, l'esecuzione di una maxi elettroforesi nativa blu notturna e l'immunoblotting. Dopo aver visto questo video dovresti avere una buona comprensione di come isolare e identificare i supercomplessi mitocondriali utilizzando l'elettroforesi nativa, i saggi in-gel e l'elettroeluizione.

Durante il tentativo di questa procedura, è importante ricordare che i supercomplessi mitocondriali sono fragili. Il congelamento e lo scongelamento dei campioni devono essere ridotti al minimo. L'elettroforesi e l'elettroeluizione native devono essere eseguite su ghiaccio o in cella frigorifera.

Le implicazioni di queste tecniche vanno oltre la definizione della composizione fisica di ciascun supercomplesso. Poiché i supercomplessi vengono catturati nella loro forma nativa, è possibile eseguire saggi funzionali. Dopo il suo sviluppo, questa tecnica ha aperto la strada ai ricercatori nel campo della biologia mitocondriale per rivalutare la comprensione dell'attività di trasporto degli elettroni mitocondriali e delle sue conseguenze per i pazienti con malattie mitocondriali.

Seguendo questa procedura, è possibile eseguire altri metodi come l'HPLC, la spettroscopia di massa, la microscopia elettronica o il patch clamping per rispondere a ulteriori domande come la composizione molecolare, la struttura o le proprietà elettrofisiologiche dei complessi proteici isolati.