Name: Analisi di supercomplexes della catena di trasporto elettronico mitocondriale con elettroforesi nativa, analisi in-gel e elettroelution (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-06-01T13:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 37 s
Description: Impara l'elettroforesi nativa per analizzare i supercomplessi della catena di trasporto elettronico mitocondriale. Questo metodo preserva l'integrità fisiologica dei complessi durante l'isolamento, consentendo studi funzionali dettagliati.

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Questo lavoro è stato sostenuto da sovvenzioni dell&#39;American Heart Association&#39;s Founder&#39;s Affiliate [12GRNT12060233] e del Forte Centri di Ricerca per l&#39;infanzia presso l&#39;Università di Rochester.

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<li>Strauss, M., Hofhaus, G., Schroder, R. R., Kuhlbrandt, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dimer+ribbons+of+ATP+synthase+shape+the+inner+mitochondrial+membrane%5BTitle%5D)+AND+%22EMBO+J%22%5BJournal%5D)">Dimer ribbons of ATP synthase shape the inner mitochondrial membrane.</a> EMBO J. 27 (7), 1154-1160 (2008).</li>
<li>Beutner, G., Eliseev, R. A., Porter, G. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Initiation+of+electron+transport+chain+activity+in+the+embryonic+heart+coincides+with+the+activation+of+mitochondrial+complex+1+and+the+formation+of+supercomplexes%5BTitle%5D)+AND+%22PloS+one%22%5BJournal%5D)">Initiation of electron transport chain activity in the embryonic heart coincides with the activation of mitochondrial complex 1 and the formation of supercomplexes.</a> PloS one. 9 (11), e113330(2014).</li>
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<li>Wittig, I., Karas, M., Schagger, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High+resolution+clear+native+electrophoresis+for+in-gel+functional+assays+and+fluorescence+studies+of+membrane+protein+complexes%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Cell+Proteomics%22%5BJournal%5D)">High resolution clear native electrophoresis for in-gel functional assays and fluorescence studies of membrane protein complexes.</a> Mol Cell Proteomics. 6 (7), 1215-1225 (2007).</li>
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<li>Wittig, I., Schagger, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Supramolecular+organization+of+ATP+synthase+and+respiratory+chain+in+mitochondrial+membranes%5BTitle%5D)+AND+%22Biochim+Biophys+Acta%22%5BJournal%5D)">Supramolecular organization of ATP synthase and respiratory chain in mitochondrial membranes.</a> Biochim Biophys Acta. 1787 (6), 672-680 (2009).</li>
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<li>Alavian, K. N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+uncoupling+channel+within+the+c-subunit+ring+of+the+F1FO+ATP+synthase+is+the+mitochondrial+permeability+transition+pore%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Nat+Acad+Sci+USA%22%5BJournal%5D)">An uncoupling channel within the c-subunit ring of the F1FO ATP synthase is the mitochondrial permeability transition pore.</a> Proc Nat Acad Sci USA. 111 (29), 10580-10585 (2014).</li>
<li>Chance, B., Williams, G. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Respiratory+enzymes+in+oxidative+phosphorylation.+IV.+The+respiratory+chain%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biol+Chem%22%5BJournal%5D)">Respiratory enzymes in oxidative phosphorylation. IV. The respiratory chain.</a> J Biol Chem. 217 (1), 429-438 (1955).</li>
<li>Zickermann, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Structural+biology.+Mechanistic+insight+from+the+crystal+structure+of+mitochondrial+complex+I%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Structural biology. Mechanistic insight from the crystal structure of mitochondrial complex I.</a> Science. 347 (6217), 44-49 (2015).</li>
<li>Zhu, J., Vinothkumar, K. R., Hirst, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Structure+of+mammalian+respiratory+complex+I%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Structure of mammalian respiratory complex I.</a> Nature. 536 (7616), 354-358 (2016).</li>
</ol>

Gli autori non hanno niente da rivelare.

Un ETC funzionale è necessario per la generazione di ATP mitocondriale. I complessi dell&#39;ETC sono in grado di formare due tipi di supercomplex: i respirasomi (Cx-I, -III e -IV) 1 ei sintasi (Cx-V) 2 . L&#39;assemblaggio di ogni complesso è richiesto per un ETC intatto, mentre l&#39;organizzazione dell&#39;ETC in supercomplexes è pensata per aumentare l&#39;efficienza complessiva ETC 5 , 22 . Come questi comples...

L&#39;energia mitocondriale sotto forma di ATP non è solo essenziale per la sopravvivenza cellulare, ma anche per la regolazione della morte cellulare. La generazione di ATP da fosforilazione ossidativa richiede una catena funzionale di trasporto di elettroni (ETC; Cx-I-IV) e mitocondriale ATP sintasi (Cx-V). Recenti studi hanno dimostrato che questi grandi complessi proteici sono organizzati in supercomplex, chiamati respirasomi e sintasi 1 , 2 . È impegnativo analizzare l&#39;assemblaggio, la dinamica e la regolazione delle attività di questi complessi e supercomplexi massicci. Mentre le misurazioni del consumo di ossigeno prese con un esame di elettrodi di ossigeno e di enzimi condotti utilizzando uno spettrofotometro possono fornire preziose informazioni sull&#39;attività complessa del ETC, questi dosaggi non possono fornire informazioni riguardanti la presenza, la dimensione e la composizione subunità del complesso proteico o dei supercomplexi coinvolti. Tuttavia, lo sviluppo di nativi azzurri e chiari (BN e CN) PAGE 3 ha creato un potente strumento per rivelare importanti informazioni sulla composizione complessiva e sull&#39;assemblaggio / smontaggio e sulla regolazione dinamica dell&#39;organizzazione supramolecolare di questi complessi respiratori vitali in condizioni fisiologiche e patologiche 4 . L&#39;assemblaggio di questi complessi in supercomplex di ordine superiore sembra regolare la struttura mitocondriale e la funzione 5 . Ad esempio, il complesso respiratorio aumenta l&#39;efficienza del trasferimento di elettroni e la generazione della forza motrice protonica attraverso la membrana interna mitocondriale 5 . Inoltre, l&#39;assemblaggio di sintasi non solo aumenta l&#39;efficienza della produzione di ATP e il trasferimento di equivalenti energetici nel citoplasma 2 , ma anche forma la membrana interna mitocondriale nella crista tubolare 6 ,/ Sup&gt; 7 . Studi di assemblaggio supercomplex durante lo sviluppo cardiaco in embrioni di topi mostrano che la generazione di supercomplex contenenti Cx-I nel cuore inizia a circa il giorno embrionale 13.5 8 . Altri hanno dimostrato che la quantità di supercomplex contenenti Cx-I diminuisce nel cuore a causa dell&#39;invecchiamento o delle lesioni di reazioni di ischemia / reperfusione 9 , 10 o possono svolgere un ruolo nella progressione delle malattie neurodegenerative 11 . Questo protocollo descrive metodi per PAGE nativo di gel che può essere utilizzato per indagare l&#39;assemblaggio e l&#39;attività dei complessi ETC e dei supercomplex. Il peso molecolare approssimativo dei supercomplex mitocondriali può essere valutato separando i complessi proteici in gel di poliacrilammide CN o BN. CN PAGE consente anche la visualizzazione dell&#39;attività enzimatica di tutti i complessi mitocondriali direttamente nel gel (in-gel assay;IGA) 12 . Questo lavoro dimostra l&#39;attività dei respirasomi evidenziando la capacità di Cx-I di ossidare NADH attraverso l&#39;IGA e la presenza di sintassi derivanti dall&#39;attività di idrolisi ATP di Cx-V da parte di IGA. I complessi multipli e i supercomplex contenenti Cx-I e Cx-V possono anche essere dimostrati trasferendo le proteine ​​sulle membrane di nitrocellulosa e eseguendo immunoblotting. Il vantaggio di questo approccio è che BN o CN PAGE in genere separano i complessi proteici in base alla loro dimensione e composizione fisiologica; Il trasferimento a una membrana conserva questo modello di bande. L&#39;analisi dei complessi proteici in una BN o in CN PAGE può essere effettuata anche utilizzando la 2D-PAGE (vedere Fiala et al. 13 per una dimostrazione) o mediante centrifugazione di densità di saccarosio 14 , 15 . Per analizzare ulteriormente una banda specifica, è possibile escoggersi dalla BN PAGE e le proteine ​​di questo complesso proteico possono essere purificateD elettrolientandoli in condizioni naturali. L&#39;elettroelution nativo può essere eseguito entro poche ore, che potrebbe fare una differenza significativa alla diffusione passiva (come usato nel riferimento 16) di proteine ​​da un gel nel buffer circostante. In sintesi, questi metodi descrivono diversi approcci che consentono l&#39;ulteriore caratterizzazione di supercomplex di peso molecolare dalle membrane mitocondriali.

<table><tbody><tr><td>Mini-camera Protean II</td><td>Biorad</td><td>1658004</td><td>Set completo per versare ed eseguire l'elettroforesi mini-gel</td></tr><tr><td>Maxi-gel</td><td>Biorad</td> XL <td>1653189 Set completo per versare ed eseguire l'elettroforesi maxi-gel</td><td></td></tr><tr><td>Creatore di gradienti, Hoefer SG15</td><td>VWR</td><td>95044-704</td><td>Versare gradienti mini-gel</td></tr><tr><td>Creatore di gradienti, maxi-gel</td><td>VWR</td><td>GM-100</td><td>Versare maxi-gel gradienti</td></tr><tr><td>Kit di trasferimento</td><td>Biorad</td><td>1703930</td><td>Set completo per il trasferimento a umido di proteine su membrane Elettroelettrico</td></tr><tr><td>modello 422</td><td>Biorad</td><td>1652976</td><td>Elettroeluizione di proteine da PAGINE native o SDS PAGES</td></tr><tr><td>Piastre di vetro</td><td>Biorad</td><td>1653308</td><td>Piastre corte</td></tr><tr><td>Piastre di vetro</td><td>Biorad</td><td>1653312</td><td>Piastre distanziatrici</td></tr><tr><td>Lastre</td> <td>di vetroBiorad</td><td>1651823</td><td>Piastre interne</td></tr><tr><td>Piastre di vetro</td><td>Biorad</td><td>1651824</td><td>Piastre esterne</td></tr><tr><td>Alimentatore</td><td>Biorad</td><td>1645070</td><td>Alimentatore adatto per elettroforesi nativa</td></tr><tr><td>ECL-Western&nbsp;</td><td>Thermo Scientific</td><td>32209</td><td>Substrato di chemiolumniscense</td></tr><tr><td>SuperSignal-West</td><td>Dura Thermo Scientific</td><td>34075</td><td>Substrato di chemiolumniscense potenziato</td></tr><tr><td>Pellicola/pellicola per autoradiografia</td><td>GE Health care</td><td>28906845</td><td>Documentazione delle macchie occidentali Processore di</td></tr><tr><td>pellicole CP1000</td><td>Agfa</td><td>NC0872640</td><td></td></tr><tr><td>Canon Power Shot 640&nbsp;</td><td>Canon</td><td>NA</td><td>Scattare foto per documentare gel, membrane e macchie.</td></tr><tr><td>Paraluce Canon Power Shot 640</td><td>Fotocamera schermante Canon</td><td></td><td>per foto scattate su un tavolo luminoso</td></tr><tr><td>Acrilammide/bisacrilammide</td><td>Biorad</td><td>1610148</td><td>soluzione premiscelata al 40%</td></tr><tr><td>Glycine</td><td>Sigma</td><td>G7403</td><td></td></tr><tr><td>SDS (sodio dodecil solfato)</td><td>Invitrogen</td><td>15525-017</td><td></td></tr><tr><td>Tris-base</td><td>Sigma</td><td>T1503</td><td>Buffer</td></tr><tr><td>Tricine</td><td>Sigma</td><td>T0377</td><td></td></tr><tr><td>Sodio desossichelato</td><td>Sigma</td><td>D66750</td><td>Detergente</td></tr><tr><td>EDTA</td><td>Sigma</td><td>E5134</td><td></td></tr><tr><td>Saccarosio</td><td>Sigma</td><td>S9378</td><td></td></tr><tr><td>MOPS</td><td>Sigma</td><td>M1254</td><td>Tampone</td></tr><tr><td>Imidazole</td><td>Sigma</td><td>I15513</td><td>Tampone</td></tr><tr><td>Lauryl maltoside</td><td>Sigma</td><td>D4641</td><td>Detergente</td></tr><tr><td>Coomassie G250</td><td>Biorad</td><td>161-0406</td><td></td></tr><tr><td>Acido aminoesanoico</td><td>Sigma</td><td>O7260</td><td></td></tr><tr><td>Kit di peso molecolare nativo</td><td>GE Health care</td><td>17-0445-01</td><td>Kit di calibrazione ad alto peso molecolare per elettroforesi nativa.</td></tr><tr><td>Name</td><td>Azienda</td><td>Numero di catalogo</td><td>Comments</td></tr><tr><td>NADH</td><td>Sigma</td><td>N4505</td><td></td></tr><tr><td>Nitroblue tetrazolium</td><td>Sigma</td><td>N6639</td><td></td></tr><tr><td>Tris HCl</td><td>Sigma</td><td>T3253</td><td></td></tr><tr><td>ATP&nbsp; &nbsp;</td><td>Sigma</td><td>A2383</td><td></td></tr><tr><td>Nome</td><td>Azienda</td><td>Numero di catalogo</td><td>Comments</td></tr><tr><td>Lead(II) nitrato (Pb(NO3)2):</td><td>Sigma</td><td>228621</td><td></td></tr><tr><td>Oligomicina</td><td>Sigma</td><td>O4876</td><td></td></tr><tr><td> Nome</td><td>Azienda</td><td>Numero di catalogo</td><td>Comments</td></tr><tr><td>Ponceau S</td><td>Sigma</td><td>P3504</td><td></td></tr><tr><td>anti-ATP5A</td><td>Abcam</td><td>ab14748</td><td>anticorpo alla subunità ATP sintasi ATP5A</td></tr><tr><td>anti-NDUFB6</td><td>Abcam</td><td>ab110244</td><td>anticorpo alla subunità Cx-1 NDUFB6</td></tr><tr><td>anti-VDAC</td><td>Calbiochem 529534</td><td></td><td>anticorpo contro VDAC</td></tr><tr><td>ECL HRP linkato anticorpo</td><td>GE Health Care</td><td>NA931V</td><td>anticorpo secondario contro ATP5A, NDUFB6 e</td></tr><tr><td>VDAC Reagente bloccante</td><td>Biorad</td><td>170-6404</td><td></td></tr><tr><td>BSA</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>cloruro di sodio</td><td>Sigma</td><td>S9888</td><td></td></tr><tr><td>cloruro di potassio</td><td>Sigma</td><td>P9541</td><td></td></tr><tr><td>EGTA</td><td>Sigma</td><td>E3889</td><td></td></tr><tr><td>Name</td><td>Azienda</td><td>Numero di catalogo</td><td>Comments</td></tr><tr><td>Kit di colorazione dell'argento</td><td>Invitrogen</td><td>LC6070</td><td></td></tr></tbody></table>

analisi di supercomplexes della catena di trasporto elettronico mitocondriale con elettroforesi nativa, analisi in-gel e elettroelution

Analyzing Supercomplexes of the Mitochondrial Electron Transport Chain with Native Electrophoresis, In-gel Assays, and Electroelution

La catena di trasporto elettronico mitocondriale (ETC) trasforma l&#39;energia derivata dalla rottura di vari combustibili nella valuta bioenergetica della cellula, ATP. L&#39;ETC è composto da 5 complessi proteici massicci, che si riuniscono anche in supercomplexes chiamati respirasomi (CI, C-III e C-IV) e sintasi (CV) che aumentano l&#39;efficienza del trasporto di elettroni e della produzione di ATP. Sono stati utilizzati diversi metodi per oltre 50 anni per misurare la funzione ETC, ma questi protocolli non forniscono informazioni sull&#39;assemblaggio di singoli complessi e supercomplex. Questo protocollo descrive la tecnica dell&#39;elettroforesi genica gel poliacrilammide (PAGE), un metodo modificato più di 20 anni fa per studiare la struttura complessa di ETC. L&#39;elettroforesi nativa consente la separazione dei complessi ETC nelle loro forme attive, e questi complessi possono essere studiati utilizzando immunoblotting, test in-gel (IGA) e purificazione mediante elettroelution. Combinando il reI risultati di un gel nativo PAGE con quelli di altri test mitocondriali, è possibile ottenere un quadro completo dell&#39;attività ETC, del suo assemblaggio dinamico e dello smontaggio e come questo regola la struttura e la funzione mitocondriale. Questo lavoro discuterà anche i limiti di queste tecniche. In sintesi, la tecnica della PAGE nativa, seguita da immunoblotting, IGA e elettroelution, presentata sotto, è un modo potente per studiare la funzionalità e la composizione dei supercomplex mitocondriali ETC.

Per visualizzare i supercomplex mitocondriali, i mitocondri freschi isolati dai topi sono stati usati 17 , 18 . I supercomplex mitocondriali sono sensibili a ripetuti cicli di congelamento e scongelamento, portando alla loro disgregazione, anche se questo può essere tollerabile per alcuni ricercatori. Se il freddo è necessario per lo stoccaggio, per garantire i migliori risultati, i campioni non devono subire più di un ciclo di c...

Questo protocollo descrive la separazione dei complessi funzionali della catena di trasporto elettronico mitocondriale (Cx) IV e dei suoi supercomplexi utilizzando l&#39;elettroforesi nativa per rivelare informazioni sulla loro struttura e struttura. Il gel nativo può essere sottoposto a immunoblotting, analisi in-gel e purificazione mediante elettroelution per caratterizzare ulteriormente i singoli complessi.

Analisi di supercomplexes della catena di trasporto elettronico mitocondriale con elettroforesi nativa, analisi in-gel e elettroelution

The mitochondrial electron transport chain (ETC) transduces the energy derived from the breakdown of various fuels into the bioenergetic currency of the ...

L'obiettivo generale dell'elettroforesi nativa in combinazione con saggi in gel, immunoblotting ed elettroelusione nativa è preservare e analizzare l'assemblaggio dei supercomplessi mitocondriali. Questo metodo può aiutare a comprendere in che modo i complessi proteici della catena di trasporto degli elettroni mitocondriale si assemblano in supercomplessi in base a numerosi fattori, tra cui le esigenze bioenergetiche e le condizioni fisiologiche e patologiche. Il principale vantaggio di questa tecnica è che, se eseguita correttamente, l'integrità fisiologica e la funzionalità dei supercomplessi mitocondriali vengono preservate durante l'intero processo di isolamento, che risulta piuttosto lungo.Questo metodo può essere applicato anche per studiare la dinamica dell'assemblaggio dei supercomplessi e per analizzare i complessi proteici nella membrana plasmatica, così come in altre membrane intracellulari. Durante la preparazione per i saggi in gel, è assolutamente fondamentale che tutti i componenti utilizzati per l'elettroforesi nativa non siano contaminati da detergenti, poiché questi causerebbero la disintegrazione dei supercomplessi mitocondriali. Tagliare una o più corsie da un g

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In questo video vi mostreremo come il complesso della catena respiratoria mitocondriale di cellule staminali embrionali umane possono essere analizzati utilizzando nelle prove di attività gel.

Sondaggio per mitocondriale complessa attività di cellule staminali embrionali umane

In questo video, dimostriamo una tecnica elettroforetica, chiamata blue native PAGE, per l'analisi di complessi proteici respiratori mitocondriali nel loro stato nativamente ripiegato e funzionalmente attivo. Il colorante blu anionico Coomassie fa sì che i complessi proteici si carichino negativamente, consentendo la separazione in base alle dimensioni e alla struttura.

Elettroforesi su gel di poliacrilammide nativo blu: una tecnica di separazione non denaturante per l'analisi di complessi di catene respiratorie mitocondriali intatti

Questo protocollo dimostra l'analisi dei complessi della catena respiratoria mitocondriale mediante elettroforesi in gel di poliacrilammide nativo blu. Qui è descritto il metodo applicato alle cellule umane coltivate.

Analisi dei complessi della catena respiratoria mitocondriale in cellule umane coltivate mediante elettroforesi in Gel di poliacrilammide nativo blu e Immunoblotting

Qui presentiamo un protocollo per estrarre, risolvere e identificare i supercomplessi mitocondriali che minimizzano l'esposizione ai detergenti e a Coomassie Blue. Questo protocollo offre un equilibrio ottimale tra la risoluzione e la conservazione delle attività enzimatiche, riducendo al minimo il rischio di perdere le interazioni proteina-proteina labile.

Elettroforesi ibrida trasparente/blu nativa per la separazione e l'analisi dei supercomplessi di catene respiratorie mitocondriali

Il genoma mitocondriale del lievito di Baker codifica otto polipeptidi. L'obiettivo del protocollo corrente è etichettarli tutti e successivamente visualizzarli come bande separate.

Etichettatura e visualizzazione dei prodotti di espressione del genoma mitocondriale nel lievito di Baker Saccharomyces cerevisiae

La preparazione di campioni arricchiti di mitocondri da tessuti solidi archiviati precedentemente congelati ha permesso ai ricercatori di eseguire valutazioni sia funzionali che analitiche dei mitocondri in varie modalità sperimentali. Questo studio dimostra come preparare preparati arricchiti con mitocondri dal tessuto cardiaco congelato ed eseguire valutazioni analitiche dei mitocondri.

Misurazione dei complessi di trasferimento di elettroni mitocondriali nel tessuto cardiaco precedentemente congelato dalla prole della scrofa: un modello per valutare i cambiamenti bioenergetici mitocondriali indotti dall'esercizio

Questo protocollo descrive una tecnica per l'analisi dei supercomplessi respiratori quando sono disponibili solo piccole quantità di campioni.

Isolamento dei mitocondri per l'analisi dei supercomplessi mitocondriali da piccoli campioni di tessuti e colture cellulari 

Questo articolo descrive un metodo per valutare le interazioni e gli assemblaggi di proteine integrali di membrana in vitro con vari fattori partner in un ambiente lipidico-prossimale.

Utilizzando impalcatura liposomi per ricostituire interazioni proteina-proteina lipidi-prossimale In Vitro

Librerie di visualizzazione batterica di Biopanning è una tecnica collaudata per la scoperta dei reagenti di affinità del peptide, un'alternativa affidabile agli anticorpi. Il metodo di ordinamento semi-automatizzato nel presente documento ha razionalizzato biopanning per ridurre l'occorrenza di falsi positivi. Qui illustriamo il processo di pensiero e tecniche applicate nella valutazione dei candidati e minimizzazione dell'analisi a valle.

Biopanning semi-automatizzato di librerie visualizzazione batterica per Peptide affinità reagente scoperta e l'analisi degli isolati risultanti

L'obiettivo del presente protocollo è di monitorare spettrofotometricamente trans-plasma membrana elettrone trasporto utilizzando accettori extracellulari e di analizzare le interazioni enzimatiche che possono verificarsi con questi accettori extracellulari.

Trasporto dell'elettrone di miotubi C2C12 Trans-Plasma membrana di misura

Impara l'elettroforesi nativa per analizzare i supercomplessi della catena di trasporto elettronico mitocondriale. Questo metodo preserva l'integrità fisiologica dei complessi durante l'isolamento, consentendo studi funzionali dettagliati.

Analisi di supercomplexes della catena di trasporto elettronico mitocondriale con elettroforesi nativa, analisi in-gel e elettroelution (Video) | JoVE Journal

Analisi di supercomplexes della catena di trasporto elettronico mitocondriale con elettroforesi nativa, analisi in-gel e elettroelution

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