DiI Perfusion come metodo per la visualizzazione vascolare in Ambystoma mexicanum

L'obiettivo generale di questa procedura è visualizzare la vascolarizzazione dell'axolotl. Questo metodo può aiutare a rispondere a domande chiave nel campo della medicina rigenerativa sulle complessità della rivascolarizzazione dei tessuti rigeneranti nell'axolotl. Il vantaggio principale di questa tecnica di visualizzazione vascolare è che tutti i vasi sanguigni dell'animale possono essere facilmente visualizzati su un microscopio a fluorescenza standard.

Sebbene questo metodo possa fornire informazioni sulla rigenerazione degli arti dell'axolotl, può essere applicato anche ad altri tessuti, come la coda, il cuore, gli occhi, le branchie o altri organi. Prima di aprire il torace axolotl, confermare il livello appropriato di sedazione pizzicando le dita dei piedi. Quindi, usa una pinza chirurgica per pizzicare la pelle lungo l'asse centrale del torace, appena sotto la linea delle spalle.

Usando un bisturi, fai un'incisione nel punto in cui la pelle viene tirata verso l'alto e rimuovi una macchia quadrata di pelle sul torace per rivelare due placche cartilaginee. Quindi, apri una finestra sulla cavità toracica e strappa con cura il tessuto connettivo senza tagliare i vasi sanguigni principali. Usa una pinza per sollevare ogni placca cartilaginea individualmente, asportando ogni placca con le forbici chirurgiche.

Pizzicare con cautela il pericardio esposto con la pinza. Tirando su il tessuto e perforandolo con le forbici chirurgiche, quel tanto che basta per rimuovere il pericardio senza ferire il cuore. Quindi, rimuovere delicatamente il pericardio per esporre il cuore e l'aorta, per vedere chiaramente il cuore a circa cinque millimetri dell'aorta, che si dirama dal cuore.

Per perfondere l'axolotl, posizionare un supporto a morsetto con un ago a farfalla caricato accanto a un telaio in polistirene espanso, in modo tale che il braccio del morsetto sia facilmente manipolabile per l'inserimento dell'ago. Accendere una pompa peristaltica per far passare 0,7 volte il PBS attraverso il tubo della pompa e puntare la punta dell'ago verso l'aspetto rostrale. Far scorrere la pinza sotto l'arco aortico e tirare leggermente verso l'alto.

Quindi, manovrare la combinazione del morsetto dell'ago, in modo che l'ago scorra lungo la lunghezza dell'aorta verso la testa dell'animale, e inserire l'ago per circa cinque millimetri nell'aorta, mantenendo la pinza dietro l'aorta per il supporto. Un inserimento riuscito può essere confermato da un allargamento visibile degli atri cardiaci. Lacera rapidamente un atrio e lascia defluire il sangue.

Quindi, perfondere l'axolotl con circa 20-30 millilitri di PBS. Dopo una perfusione riuscita, l'animale dovrebbe cambiare dal rosa chiaro al bianco. Quando tutto il PBS è stato perfuso, mettere in pausa la pompa peristaltica e spostare l'estremità libera del tubo in un tubo da 15 millilitri di soluzione Dil.

Riavviare la pompa, facendo attenzione a non creare bolle nel tubo e a perfondere l'animale con l'intero ceppo Dil funzionante. In una perfusione riuscita, l'axolotl cambierà in un colore rosa brillante che sarà più evidente nelle branchie. Quando tutto il Dil è stato perfuso, mettere in pausa la pompa e posizionare l'estremità libera del tubo in una soluzione di paraformaldeide al 4%.

Quindi, riavviare la pompa e perfondere almeno 10 millilitri di fissativo. Quando tutta la paraformaldeide è stata somministrata, arrestare la pompa e rimuovere l'ago. Trasferisci l'axolotl su un piatto di plastica e posiziona il piatto su un tavolino da microscopio fluorescente.

Quindi, con le luci spente, selezionare un filtro che consenta l'eccitazione di Dil, che emette una luce rosso arancione. Dopo una perfusione riuscita, la colorazione Dil è visibile come un segnale di ammissione rosso in tutti i tessuti dell'axolotl, compresa la coda, gli arti, le branchie e gli occhi. Una volta padroneggiata, questa tecnica può essere completata in un'ora se eseguita correttamente.

Durante il tentativo di questa procedura, è importante ricordare di fare attenzione a non lacerare i principali vasi sanguigni o il cuore durante l'apertura della cavità toracica e di inserire l'ago in linea con l'aorta per evitare punture passanti. Seguendo questa procedura, è possibile eseguire altri metodi come la preparazione scheletrica per rispondere a ulteriori domande. Dopo il suo sviluppo, questa tecnica ha aperto la strada ai ricercatori in campo biomedico per esplorare la vascolarizzazione di diverse specie.

Dopo aver visto questo video, dovresti avere una buona comprensione di come eseguire una perfusione cardiaca dell'axolotl con il colorante carbocianina, Dil. Non dimenticare che lavorare con aghi e paraformaldeide può essere estremamente pericoloso e che le precauzioni, come indossare i dispositivi di protezione individuale appropriati, devono essere sempre prese durante l'esecuzione della procedura.