Preparazione di vescicole a membrana plasmatica da cellule staminali mesenchimali del midollo osseo per potenziali terapie di sostituzione del citoplasma

L'obiettivo generale di questa procedura è quello di fornire una nuova terapia sostitutiva del citoplasma al muscolo gastrocnemio dei topi utilizzando vescicole di membrana plasmatica o PMV derivate da cellule staminali mesenchimali del midollo osseo di topo o BMSC. Questo metodo può aiutare a rispondere alle domande con l'integrazione di cellule con citoplasma giovane da altre BMSC tramite fusione PMV può migliorare o addirittura invertire i fenotipi associativi dell'età. Il vantaggio principale di questa tecnica è che l'incapsulamento PMV del citosol BMSC può essere indotto istantaneamente da un'estrusione meccanica.

Quando si dimostra questo metodo, è fondamentale poiché si sta estrudendo e costruendo i passaggi sono difficili da imparare testando per possedere effettivamente. Per generare i PMV, prima colture di BMSC di topo in terreno di coltura DMEM completo in un pozzetto di una piastra a sei pozzetti in un incubatore umidificato a 37 gradi Celsius e 5% di anidride carbonica. Quando le cellule hanno raggiunto il 90% di confluenza, sciacquare il pozzetto con 0,5 millilitri di PBS privo di calcio e staccare le cellule con 0,5 millilitri di tripsina-EDTA allo 0,25%.

Dopo tre minuti a 37 gradi Celsius, picchiettare la piastra con il palmo della mano alcune volte per facilitare la dissociazione cellulare e fermare la digestione con un millilitro di terreno di coltura. Trasferire le cellule in una provetta conica da cinque millilitri per la centrifugazione e risospendere il pellet in quattro millilitri di terreno di coltura fresco. Quindi dividere le cellule tra due pozzetti di una nuova piastra a sei pozzetti e rimettere la piastra nell'incubatore per colture cellulari per 24 ore.

Il giorno successivo, raccogliere le cellule da un pozzo mediante digestione della tripsina, come appena dimostrato. Risospensione del pellet in 0,5 millilitri di terreno di coltura fresco dopo la raccolta mediante centrifugazione. Caricare le cellule in una siringa da insulina da un millilitro e collegare la siringa a un'unità filtro.

Premere rapidamente lo stantuffo per spremere le celle attraverso il filtro e scartare il mezzo estruso. Quindi caricare ed erogare 0,5 millilitri di terreno di coltura extra attraverso il filtro, come appena dimostrato, raccogliendo il terreno dalla seconda estrusione. Seminare 150 microlitri del terreno raccolto in un piatto di vetro da 35 millilitri e lasciare riposare le vescicole per circa 10 minuti.

Quindi confermare la presenza di PMV sotto un microscopio a contrasto di fase invertito dotato di una telecamera CCD che utilizza un obiettivo 20x. Per tracciare l'involucro mitocondriale e il potenziale di membrana nei PMV, colorare una coltura BMSC confluente al 90% con un colorante mitocondriale appropriato o una sonda del potenziale di membrana mitocondriale rispettivamente in terreno di coltura fresco per 30 minuti a 37 gradi Celsius. Quindi sciacquare le cellule tre volte con 0,5 millilitri di PBS per lavaggio e raccogliere le cellule mediante digestione della tripsina per la generazione di PMV, come appena dimostrato per la loro visualizzazione mediante microscopia confocale.

Per tracciare la localizzazione citoplasmatica delle proteine PMV, diluire prima due microgrammi di DNA plasmidico superavvolto per una cassetta di espressione EGFP e sei microlitri di reagente di trasfezione cationica in singole provette da 0,5 millilitri contenenti 50 microlitri di DMEM libero dal siero. Agitare le provette, seguita da una breve centrifugazione. Quindi aggiungere il reagente di trasfezione goccia a goccia nella provetta contenente la soluzione di DNA diluita.

Agitare la miscela di trasfezione del DNA in modo robusto per un minuto, seguito da una breve rotazione in un'incubazione di 10 minuti a temperatura ambiente. Quindi, alimentare una coltura BMSC confluente al 30% in una piastra a sei pozzetti con due millilitri di terreno di coltura fresco e aggiungere la miscela di DNA goccia a goccia alle cellule. 48 ore dopo la loro trasfezione, raccogliere il BMSC mediante digestione della tripsina e preparare i PMV come appena dimostrato.

I PMV possono quindi essere analizzati mediante microscopia confocale utilizzando un obiettivo ad olio 100x. Prima di iniettare i PMV, etichettare una coltura BMSC con un colorante tracciante cellulare fluorescente colorante a membrana in un millilitro di terreno di coltura fresco a 37 gradi Celsius per 30 minuti e raccogliere le cellule mediante digestione della tripsina. Risospendere le cellule marcate in 0,5 millilitri di terreno di coltura fresco integrato con un microgrammo di polietilene ammina e preparare i PMV come dimostrato.

Quindi concentrare i PMV mediante centrifugazione e risospendere il pellet in 100 microlitri di terreno di coltura fresco con una leggera agitazione. Successivamente, caricare le cellule in una siringa da insulina da un millilitro dotata di un ago calibro 30 e disinfettare l'esterno del muscolo gastrocnemio di un topo BALB/c anestetizzato con etanolo al 75%. Quindi iniettare lentamente l'intero volume di PMV nel muscolo e consentire all'animale di riprendersi sotto una lampada termica.

Dopo 12 ore, cospargere il muscolo con il 75% di etanolo, aprire la pelle con le forbici e raccogliere l'intero muscolo gastrocnemio ad entrambe le estremità. Sciacquare il muscolo con PBS e metterlo sotto un microscopio a fluorescenza. Utilizzando la lente dell'obiettivo 20 volte, rimuovere i pezzi di tessuto muscolare non fluorescenti con una lama di rasoio affilata e tritare i restanti pezzi fluorescenti fortemente rossi in cubi di circa nove millimetri cubi

Incorporare ogni cubetto in un mezzo di taglio a temperatura ottimale. Quindi immergere i cubetti in azoto liquido per cinque minuti. E conservare i campioni di tessuto a meno 20 gradi Celsius fino alla loro analisi.

I PMV generati dalle BMSC, come dimostrato, mostrano prevalentemente una dimensione nell'intervallo di circa tre micrometri di diametro, come esaminato al microscopio a contrasto di fase utilizzando l'obiettivo 20 volte. La trasfezione BMSC con una cassetta di espressione fluorescente per 48 ore illustra l'incapsulamento citoplasmatico della proteina EGFP da parte dei PMV. Inoltre, stando con un colorante mitocondriale fluorescente si scopre che una grande frazione dei PMV contiene mitocondri.

La maggior parte dei quali si colora positivamente per un colorante potenziale di membrana mitocondriale, indicando la funzionalità dei mitocondri. Il trattamento con polietilenammina prima della loro somministrazione in vivo previene l'aggregazione del PMV durante la loro concentrazione centrifuga per la rimozione dei componenti cellulari. La marcatura del colorante a membrana delle BMSC prima della generazione di PMV facilita la generazione di PMV tracciabili a fluorescenza.

Infatti, la visualizzazione di sezioni congelate del muscolo gastrocnemio dopo la somministrazione intramuscolare di PMV marcati indica la somministrazione di PMV al citoplasma delle cellule muscolari probabilmente tramite endocitosi. Quando si tenta la procedura di generazione PMV, è importante ricordarsi di caricare la siringa con il numero appropriato di celle per premere rapidamente lo stantuffo quando si fluiscono le cellule attraverso il filtro. Dopo il suo sviluppo, questa tecnica ha aperto la strada ai ricercatori nel campo della terapia con cellule staminali per esplorare il trattamento delle malattie legate all'età nei topi.

Dopo aver visto questo video, dovresti avere una buona comprensione di come preparare il PMV da BMSC per la somministrazione di citoplasma nel muscolo gastrocnemio dei topi.