Glycoengineering metabolica di acido sialico utilizzando N-acil-per volta Mannosamines

L'obiettivo generale di questa tecnica è quello di generare cellule o prodotti derivati da cellule con espressione modificata dell'acido sialico. Pertanto, le cellule vengono trattate con mannosamine modificate con N-acile che vengono metabolizzate nei corrispondenti acidi sialici e successivamente espresse sulla superficie cellulare. Questo metodo può aiutare a rispondere a domande chiave nel campo della glicobiologia, come l'influenza sui glicoconiugati sulle interazioni recettore-ligando.

Il vantaggio principale di questa tecnica è che è facile da applicare e puramente citotossico. Per dimostrare la glicoingegneria metabolica, utilizzeremo la N-acetilmannosamina, che è disponibile in commercio. Inoltre, dimostreremo la sintesi e l'uso di N-propionil e N-butanoilmannosamina.

Sono mostrati gli effetti biologici della glicoingegneria metabolica sull'espressione dell'acido polisialico. Innanzitutto, sciogliere 431,2 milligrammi di mannosamina cloridrato in 10 millilitri di soluzione di metossido di sodio millimolare in un flacone di vetro da 15 millilitri contenente un'ancoretta di agitazione. Raffreddare il composto con ghiaccio a zero gradi Celsius.

Mescolando, aggiungere lentamente 210 micrometri di cloruro di propionil goccia per goccia alla soluzione. Quindi, incubare la miscela di agitazione a zero gradi Celsius per quattro ore. Successivamente, trasferire la soluzione in un tubo di plastica da 50 millilitri e praticare da quattro a 8 fori nel tappo del tubo con un ago sottile.

Congelare rapidamente la soluzione utilizzando azoto liquido. Quindi, liofilizzare il campione fino a quando non si è completamente asciugato. Dopo la liofilizzazione, sciogliere il prodotto essiccato in acetato di etile, metanolo e acqua.

Utilizzando una pipetta, caricare la soluzione su una colonna di gel di silice precedentemente preparata. Dopo aver eluito 500 millilitri di solvente, raccogliere quattro millilitri di frazioni. Trasferire le frazioni eluite in una provetta di plastica da 15 millilitri e praticare da tre a sei fori nel tappo della provetta con un ago sottile.

Dopo aver congelato la soluzione con azoto liquido, liofilizzare il campione fino a quando non si è completamente asciugato. Coltura di cellule di neuroblastoma Kelly in terreno RPMI a 37 gradi Celsius e 5% di anidride carbonica. Prima dell'applicazione delle mannosamine, staccare le cellule del neuroblastoma di Kelly incubandole per 10 minuti con tripsina e EDTA.

Dopo aver neutralizzato la tripsina con il terreno RPMI, contare le cellule utilizzando una camera di Neubauer. Per misurare i monosaccaridi dell'acido sialico, inserire le cellule in 500 microlitri di terreno in una piastra di coltura tissutale a 48 pozzetti. Per l'analisi degli acidi polisialici, posizionare le cellule in tre millilitri di terreno su un piatto di coltura cellulare di sei centimetri di diametro.

Aggiungere i rispettivi derivati della mannosamina, disciolti in RPMI, alle cellule appena piastre, in una concentrazione finale di cinque millimolari e incubare a 37 gradi Celsius e 5% di anidride carbonica, sostituendo il terreno contenente le mannosamine modificate con N-acile ogni 24 ore. Dopo il trattamento, decantare il terreno e lavare le cellule con PBS. Staccare le cellule incubandole per 10 minuti con tripsina e EDTA.

Neutralizzare la tripsina aggiungendo lo stesso volume di terreno di coltura cellulare alle cellule staccate. Successivamente, trasferire le cellule staccate in provette di plastica da 15 millilitri. Centrifugare i campioni per tre minuti a 500 volte G.Dopo aver scartato il surnatante, lavare le cellule tre volte con cinque millilitri di PBS.

Dopo la centrifugazione, risospendere i pellet cellulari raccolti in 500 microlitri di tampone di lisi HPLC ghiacciato. Ultrasuoni i campioni con un ago del processore a ultrasuoni tre volte per un periodo di 30 secondi ad ampiezze medio-alte, raffreddando i campioni sul ghiaccio per almeno un minuto tra i cicli. Dopo aver centrifugato i campioni di cellule lisate, separare il surnatante dalle frazioni di membrana in provette di plastica da 1,5 millilitri.

Per l'idrolisi acida, aggiungere 150 microlitri di una soluzione di TFA molare alle frazioni di membrana separate. Incubare i campioni per quattro ore a 80 gradi Celsius con agitazione da 200 a 600 giri/min. Successivamente, trasportare i campioni in provette filtranti da 0,5 millilitri con tre membrane di esclusione kilodalton.

Centrifugare i campioni per circa 30 minuti a 20.000 volte G e 21 gradi Celsius, fino a quando il volume della fase superiore è inferiore a 20 microlitri. Successivamente, scartare gli inserti e praticare da due a quattro fori nei tappi delle provette contenenti l'ultrafiltrato con un ago sottile. Dopo aver congelato i campioni con azoto liquido, liofilizzarli per una notte.

Risospendere i campioni essiccati in 10 microlitri di soluzione TFA da 120 millimolari e aggiungere 50 microlitri di soluzione DMB. Trasferire i campioni in provette scure da 1,5 millilitri per proteggerli dalla luce ultravioletta. Incubare i campioni e gli standard della membrana cellulare per 1,5 ore a 56 gradi Celsius.

Dopo l'incubazione, aggiungere quattro microlitri di soluzione di idrossido di sodio da 400 millimolari a ciascun campione per arrestare la reazione di marcatura. Per l'analisi HPLC, impostare la temperatura della colonna a 40 gradi Celsius e configurare il rivelatore a fluorescenza rispettivamente a 373 nanometri per l'eccitazione e a 448 nanometri per l'omissione. Iniettare 10 microlitri di volume di campione e separare le sonde per 15 minuti a una portata di 0,5 millilitri al minuto con metanolo, acetonitrile e acqua come eluente.

Per l'analisi della spettrometria di massa, iniettare 20 microlitri di ciascun campione HPLC raccolto in un sistema di rivelatori selettivi di massa LC. Nel software di valutazione del sistema di rivelatore selettivo di massa LC, selezionare il picco di interesse nel cromatogramma ionico totale. Visualizza lo spettro di massa del picco risolto e visualizza il rapporto massa/carica positivo tra 300 e 700.

Aggiungere un millilitro di tampone di lisi western blot ai pellet precedentemente preparati di cellule glicoingegnerizzate e vortice. Incubare i campioni per 30 minuti sul ghiaccio, vorticando ogni cinque minuti. Successivamente, centrifugare i campioni per 1,5 ore a 20.000 volte G e quattro gradi Celsius.

Quindi, raccogliere il surnatante contenente le proteine dalle cellule lisate in provette da 1,5 millilitri. Preparare i campioni per la pagina SDS aggiungendo 10 microlitri di tampone campione Laemmli a 90 microlitri di ciascuna frazione proteica. Far bollire i campioni per cinque minuti.

Dopo aver caricato i campioni su un gel di acrilammide SDS all'8%, far funzionare il gel a 25 milliampere per due ore a temperatura ambiente. Al termine, rimuovere con cautela il coperchio di vetro dal gel e ritagliare la parte superiore del gel contenente le tasche di caricamento. Successivamente, posizionare il gel su una membrana di micro nitrocellulosa 0,2, precedentemente imbevuta di tampone western blot.

Trasferire le proteine nella nitrocellulosa secondo le raccomandazioni del sistema. Dopo aver rimosso la membrana di nitrocellulosa dal sistema di blotting, colorare il blot con il rosso Ponceau per visualizzare le proteine e quindi controllare la qualità del trasferimento. Quindi, trasferire la membrana di nitrocellulosa in una camera di plastica e aggiungere 10 millilitri di soluzione bloccante.

Dopo aver incubato la membrana di nitrocellulosa, decantare la soluzione bloccante e aggiungere l'anticorpo monoclonale anti-acido polisialico 735 in PBS. Dopo l'incubazione, lavare la membrana almeno tre volte per cinque minuti con PBS. Ora, aggiungere alla membrana della nitrocellulosa l'anticorpo secondario policlonale anti-IgG di topo accoppiato alla perossidasi di rafano.

Dopo l'incubazione e il lavaggio della membrana, trasferirla su una piastra di un imager appropriato. Quindi, rilevare il segnale secondo le istruzioni del produttore. L'acido N-glicolil neuraminico marcato con DMB, eluisce tra i sette e i nove minuti.

Inoltre, l'acido N-acetil neuraminico marcato con DMB eluisce tra i 10 e i 12 minuti. Diversi picchi più piccoli osservati nel cromatogramma rappresentano DMB non reagiti e intermedi di reazione. I cromatogrammi HPLC dei lisati cellulari mostrano diversi picchi indefiniti, che rappresentano impurità interne e sottoprodotti DMB derivanti dalla reazione con altri alfa chetoacidi presenti nei lisati cellulari.

Il trattamento con N-acetil mannosamina porta spesso alla deplezione dell'acido N-glicolilneuraminico sulla superficie cellulare. Nei cromatogrammi di cellule lisate trattate con acido N-propionilneuraminico o acido N-butanoil neuraminico, si osservano picchi che indicano la comparsa dei corrispondenti acidi sialici non naturali. La reazione del DMB con le specie di acido sialico porta ad un aumento della massa molecolare di 116,2 dalton, rispetto alle specie di acido sialico che non sono marcate con questo colorante.

Oltre alle specie ioniche potenziate, si osservano anche gli addotti di sodio. La DMB-Neu5Gc eluisce poco dopo la specie DMB non reagita o parzialmente reattiva, il che spiega la comparsa di picchi indefiniti nello spettro di massa della DMB-Neu5Gc. Il trattamento delle cellule di neuroblastoma di Kelly con N-propionilmannosamina o N-butanoilmannosamina porta a una ridotta espressione di acido polisiatico sulla superficie cellulare.

Il trattamento con N-acetilmannosamina, d'altra parte, porta ad un aumento dell'espressione dell'acido polisiatico. Applicando questa tecnica, le cellule con sialilazione totale possono essere generate entro pochi giorni. Tali cellule glicoingegnerizzate possono essere utilizzate in ulteriori esperimenti.

Ad esempio, per studiare le interazioni recettore-ligando o, come mostrato qui, per inibire l'espressione dell'acido polisiatico. La procedura di ingegneria metabolica qui presentata è ottimizzata per gli esperimenti con l'acido sialico. Tuttavia, la stessa procedura può essere utilizzata anche negli esperimenti sugli animali.

Speriamo che il nostro protocollo presentato e la produzione di questo video siano di aiuto per gli autori a portare la glicoingegneria metabolica nei laboratori per analizzare la funzione e anche il ruolo biologico dell'acido sialico e dei recettori dell'acido sialico nei sistemi biologici. I chimici organici potrebbero sintetizzare mannosamine modificate con N-acile con strutture più complesse e utilizzarle come suggerito nel nostro protocollo. Seguendo il nostro protocollo, tutti i campioni devono essere analizzati immediatamente dopo l'etichettatura fluorescente.

Di conseguenza, non dovrebbero esserci ritardi tra gli analizzatori HPLC e ACMS.