Purificazione delle proteine ​​superficiali delle cellule biotinilate da Rhipicephalus microplus Cellule epiteliali delle ghiandole

Purificazione di proteine di superficie cellulare biotinilate da cellule intestinali epiteliali di Rhipicephalus microplus. Nell'ambito di questo studio, è stata utilizzata una metodologia modificata basata sul gradiente di Percoll per isolare singole cellule epiteliali dal tessuto intestinale di Rhipicephalus microplus. Le proteine legate alla superficie sono state biotinilate e purificate attraverso perle magnetiche di streptavidina per l'utilizzo in applicazioni a valle.

Dissezione dell'epitelio intestinale da Rhipicephalus microplus semi-gonfio. Avrai bisogno dei seguenti materiali. Far aderire una striscia di nastro adesivo sul fondo di una capsula di Petri.

Aggiungi una goccia di Super Glue al nastro. Posiziona la zecca con il lato ventrale rivolto verso il basso sulla Super Colla, lasciandola asciugare. Immergere completamente la zecca in 100 ml di PBS.

Utilizzando un bisturi di misura 11, tagliare dalla parte superiore degli occhi ai festoni inferiori su entrambi i lati della zecca. Utilizzando una pinza sterile, rimuovere completamente lo scuto e l'allosso per esporre gli organi interni. Rimuovere gli organi filiformi bianchi e le altre membrane.

Rimuovere l'intestino usando una pinza. Conservare l'intestino in HBSS e PIC ghiacciati. Dissociazione delle cellule epiteliali.

Avrai bisogno dei seguenti materiali. Versare l'intestino sezionato su un colino cellulare da 70 micron all'interno di una provetta Falcon da 50 mL. Poiché potrebbe formarsi un vuoto all'interno del tubo Falcon, sollevare il filtro per consentire la circolazione dell'aria.

Lavare il tessuto intestinale con 50 ml di HBSS ghiacciato con PIC. Risospendere le budella in 30 mL di HBSS ghiacciato con PIC. Se necessario, utilizzare un raschietto sterile per favorire la risospensione intestinale.

Centrifugare a 500 g. Rimuovere il surnatante e ripetere il processo di lavaggio tre volte. Risospendere le cellule intestinali in 10 mL di DMEM, 2%FCS, EDTA da 5 millimolari, TCEP da un millimolare e PIC.

Mescolare delicatamente. Incubare per 60 minuti a 37 gradi Celsius con una rotazione lenta utilizzando un rullo. Filtrare la sospensione attraverso un filtro cellulare da 250 micron.

Agitare il flusso attraverso. E filtrare attraverso un filtro a celle da 70 micron, raccogliendo il flusso rimanente. Centrifugare la sospensione.

Isolamento di singole cellule epiteliali mediante un gradiente di Percoll. Avrai bisogno dei seguenti materiali. Filtrando con la carta da prefiltro AP15, preparare il 40% e il 20% di Percoll in acqua Milli-Q.

Caricare una siringa sterile con la soluzione di Percoll. Applicarlo al filtro e scaricare lentamente il Percoll. Raffreddare a quattro gradi Celsius per un'ora prima di stratificare la sfumatura.

Installare la pompa peristaltica come mostrato. Utilizzando una pompa peristaltica impostata alla velocità più bassa, stratificare tre mL di Percoll al 40% in una provetta per ultracentrifuga da 16 mL. Lasciarlo riposare sul ghiaccio per 15 minuti.

La velocità della pompa dovrebbe portare a una portata inferiore a un ml al minuto. Inclinando il tubo a un angolo di 45 gradi, utilizzare la pompa peristaltica per sovrapporre il 20% di Percoll sopra lo strato di 40%. Assicurarsi che il tubo di uscita sia appoggiato contro il tubo da centrifuga per evitare che le goccioline si mescolino con gli strati inferiori.

La velocità della pompa dovrebbe portare a una portata inferiore a un ml al minuto. Lasciare riposare gli strati sul ghiaccio per 15 minuti. Utilizzando la pompa peristaltica a una portata inferiore a un mL al minuto per stratificare tre mL di soluzione DMEM contenente le cellule epiteliali isolate sul gradiente di Percoll dal 20 al 40%.

Assicurarsi che il tubo di uscita sia appoggiato contro il tubo da centrifuga per evitare che le goccioline si mescolino con gli strati inferiori, interrompendo il gradiente. Centrifugare a 600 g per 10 minuti. Raccogli le interfasi tra il DMEM, il gradiente Percoll 20% e i gradienti Percoll 20% 40% per isolare singole cellule epiteliali.

Biotinilazione delle proteine di superficie cellulare e isolamento di proteine di superficie biotinilate. Avrai bisogno dei seguenti materiali. Biotinilare 100 microlitri di cellule epiteliali unicellulari utilizzando il kit di coniugazione della biotina di tipo A secondo le istruzioni del produttore.

Aggiungere 100 microlitri di PBS, 1% Triton X-100, 10% glicerolo, 100 micromolari di glutatione ossidato e PIC alle cellule biotinilate. Incubare su ghiaccio per un'ora mescolando delicatamente ogni 10 minuti. Centrifugare l'estratto cellulare a 20.000 g a quattro gradi Celsius per 20 minuti e mettere da parte.

Preparare 50 microlitri di perle magnetiche di streptavidina lavando con 1.000 microlitri di TBS 1%Tween-20. Mescolare delicatamente muovendo con il dito. Posizionare il tubo in un supporto magnetico, raccogliendo le perline contro il lato del tubo.

Rimuovere ed eliminare il surnatante. Combina 300 microlitri di proteine biotinilate della superficie cellulare con microsfere magnetiche lavate. Incubare per due ore a temperatura ambiente con agitazione.

Raccogli le perline con il supporto magnetico, rimuovi e getta il surnatante. Aggiungere 300 microlitri di TBS 1%Tween-20 al tubo, mescolando delicatamente per risospendere le perle. Raccogli le perline, rimuovi e scarta il surnatante.

Ripetere questa fase di lavaggio due volte. Aggiungere 100 microlitri di 1 molare di glicina pH due alle microsfere magnetiche. E incubare a temperatura ambiente per cinque minuti.

Raccogliere le perle e rimuovere il surnatante contenente proteine di superficie biotinilate eluite. La prima figura è una rappresentazione del protocollo utilizzato per isolare le cellule epiteliali e le loro proteine di superficie da un'intera zecca. Utilizzando questo protocollo, è possibile purificare circa 1,2 per 10 su sette cellule per mL con una vitalità dal 75 all'80% e da 20 a 24 microgrammi di proteine di superficie biotinilate purificate da una dissezione iniziale di 50 zecche.

Le immagini rappresentative al microscopio a fluorescenza delle cellule epiteliali delle zecche preparate utilizzando questo protocollo sono mostrate nella figura 2A e 2B. Le cellule appaiono come una morfologia singolare, sferica, a superficie liscia e con una dimensione costante in tutto il campione. Si ritiene che gli isolamenti scadenti contengano la dissociazione incompleta delle singole cellule epiteliali con popolazioni cellulari variabili identificate attraverso le diverse dimensioni e morfologie cellulari.

contaminazione crociata da proteine ospiti, figura 3A, può essere minimizzata risciacquando adeguatamente le viscere delle zecche per produrre un gradiente di Percoll bianco o chiaro, figura 3B. Il confronto delle proteine mediante SDS-PAGE, figura 4A, colorazione d'argento, figura 4B, punto blot, figura cinque e ELISA, figura sei, indica che le metodologie descritte hanno purificato con successo le proteine di superficie biotinilate da singole cellule epiteliali isolate dalle viscere delle zecche di Rhipicephalus microplus. In conclusione, i metodi utilizzati in questo studio hanno isolato con successo singole cellule epiteliali dall'intero intestino di Rhipicephalus microplus.

Le proteine dalla superficie delle cellule epiteliali di Rhipicephalus microplus sono state ottenute per ulteriori analisi e studi. Infine, il protocollo sviluppato ha dimostrato la potenziale resa delle singole cellule epiteliali dall'intestino della zecca e l'efficienza delle proteine di superficie biotinilate della cellula. Il protocollo sviluppato può essere utilizzato in qualsiasi specie di zecca di importanza economica nel tentativo di studiare le interazioni zecche-ospite studiando la composizione proteica di membrana dell'intestino.