Name: A lungo termine Imaging in diretta di Drosophila Disco Eye (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-05-06T14:00:00.000+00:00
Duration: 6 min 8 s
Description: Scopri l'imaging a lungo termine di dischi immaginali di Drosophila per studiare la differenziazione dei fotorecettori e la rotazione ommatidiale. Questo metodo consente l'osservazione in vivo dello sviluppo cellulare.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Siamo grati a Chun-lan Hsu e Yu-Chi Yang per la preparazione del cibo mosca e il mantenimento delle scorte mosca, e Su-Ping Lee e l&#39;IMB Imaging Nucleo per il loro aiuto con la microscopia confocale. Questo studio è stato sostenuto da sovvenzioni a YHS (NSC 101-2321-B-001 -004, NSC 100-2321-B-001 -012, NSC 102-2321-B-001 -002, PIÙ 103-2311-B-001 -035 -MY3) dal Consiglio nazionale della Scienza e il Ministero della Scienza e della Tecnologia della Repubblica Popolare cinese.

Impostazione 1. Pre-sperimentale <ol><li> Raccogliere un uovo mosca che esprime nucleare proteina fluorescente verde (GFP) sotto mδ0.5-GAL4 e la cultura a 25 ° C per 5 giorni. </li><li> Microonde 0,7 g di agarosio bassofondente in 10 mL di 1x salina tamponata con fosfato (PBS) finché l&#39;agarosio è completamente sciolto. Mantenere il gel bassofondente 0,7% in un incubatore a 37 ° fino al momento dell&#39;uso. </li><li> Sterilizzare tutti gli utensili, tra cui pinze, forbici, 42 mm x 0,17 mm coprioggetto, di una piastra di vetro 9-well, e una camera di coltura magnetico, con il 70% di etanolo per più di 12 ore. </li><li> Preparare il terreno di coltura 3: media Drosophila Schneider integrato con 2% di siero fetale bovino (FBS), 0,5% di penicillina-streptomicina, e 1,25 mg / ml di insulina. Per evitare la contaminazione, preparare il mezzo in una cappa di coltura cellulare. Conservare il terreno di coltura preparato a 4 ° C ed utilizzato entro un mese. </li><li> Pulire la piattaforma dissezione e lo sperimentatore&#39;s mani con il 70% di etanolo prima di iniziare la dissezione. </li></ol> Dissection 2. Disco <ol><li> Far asciugare tutta l&#39;attrezzatura dal 70% di etanolo. </li><li> Seleziona una larva terzo instar da una fiala mosca. Per evitare la contaminazione dalla fiala mosca, lavare la larva in 1x PBS 3x per rimuovere i rifiuti. </li><li> Sezionare la larva pulito in 1 ml di terreno di coltura (a RT) nel posto piatto di vetro 9-bene sotto un microscopio di dissezione. </li><li> Afferrare la larva con un paio di pinze a circa un terzo della distanza tra l&#39;estremità posteriore e un altro pinza del gancio bocca. Tirare le due pinze in direzioni opposte per rilasciare i tessuti interni. <ol><li> Rimuovere le ghiandole salivari, il grasso corporeo, e cuticola dal complesso occhio-cervello attaccato al gancio bocca. Se il cordone nervoso ventrale è ancora attaccato, tagliare con le forbici. </li></ol></li><li> Utilizzare un paio di pinze per afferrare il gancio bocca e una coppia di pinze per rimuovere un pezzo di tessuto che connects il cervello e dischi degli occhi nella parte dorsale. NOTA: Se questo tessuto non viene rimosso, i due dischi eye-antenne saranno vicini l&#39;uno all&#39;altro e il cervello. I dischi oculari verranno quindi non piatte sul vetrino perché questo tessuto, il cervello, e il disco eye-antennale formeranno un triangolo. </li><li> Ruotare l&#39;intero complesso ad una posizione ventrale-alto. Rimuovere il filamento che collega il gancio o disco al cervello. NOTA: Se il filamento non viene rimosso, il disco occhio-antennale si dividerà in due pezzi quando il gancio bocca viene rimosso. <ol><li> Rimuovere il gancio bocca. Fare attenzione a non danneggiare il disco occhio durante il processo. NOTA: Il disco occhio è ora gratuito nel medio e solo collegata al cervello attraverso il gambo ottica. </li></ol></li></ol> 3. Montaggio <ol><li> Aria secca e assemblare i componenti della camera con un 42 copri oggetto x 0,17 millimetri. Collegare un doppio strato di O-ring al centro del vetrino per tenere the agarosio. </li><li> Montare la camera con coprioggetto. Mettere i 42 mm x 0,17 millimetri vetrino sul palco accettore. Posizionare l&#39;anello O-silicio sul vetrino. Posizionare la base. Bloccare l&#39;armadietto di tenuta e posizionare il coperchio (Figura 1). </li><li> Trasferire accuratamente il complesso occhio-cervello sezionato al centro di O-ring con una micropipetta 20 l con una punta di 10-200 microlitri. </li><li> Rimuovere la maggior parte del mezzo e aggiungere 12 ml di 0,7% agarosio bassofondente (a 37 ° C) al campione. NOTA: La posizione del disco occhio può essere modificata con una pinza prima della solidificazione del agarosio. L&#39;agarosio si solidifica entro 5 minuti. <ol><li> Aggiungere 1 ml di terreno di coltura a temperatura ambiente al centro di O-ring; ciascun O-ring può caricare fino a 4 campioni. Assicurarsi che l&#39;agarosio è incollato alla O-ring per evitare la deriva del campione. NOTA: Non aerazione o di circolazione del mezzo è necessaria. </li></ol></li></ol>4. Microscopia confocale <ol><li> Posizionare la camera sulla scena di un microscopio confocale invertito per 30 minuti per equilibrare la temperatura. Questo può evitare la dispersione asse Z durante l&#39;imaging. </li><li> Prima di immagini dal vivo a lungo termine, controllare se il tessuto è intatto dal microscopio a contrasto di interferenza differenziale. </li><li> Per evitare la fototossicità, utilizzare un laser di potenza inferiore al 2 mW. Utilizzare un obiettivo 40X per l&#39;imaging. </li><li> Acquisire 62 um immagini Z-stack di 12 min con un intervallo ottico di 1 um. Acquisire 40 cicli di scansione per un totale di 10 h. Assicurarsi che ogni ciclo contiene 12 min di imaging e 3 min di riposo. </li></ol>

<ol><li>Cohen, S. M. Imaginal disc development. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aCohen%2C+SM+%22The+Development+of+Drosophila+melanogaster%22">The Development of Drosophila melanogaster</a>. Bate, M., Martinez-Arias, A. 2, Cold Spring Harbor. NY. 747-842 (1993).</li>
<li>Auerbach, C. The development of the legs, wings and halteres in wild type and some mutant strains of Drosophila melanogaster. Proc. R. Soc. Edinb. B. 58, 787-815 (1936).</li>
<li>Tsao, C. K., Ku, H. Y., Lee, Y. M., Huang, Y. F., Sun, Y. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Long-term+Ex+Vivo+Culture+and+Live+Imaging+of+Drosophila+Larval+Imaginal+Discs%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Long-term Ex Vivo Culture and Live Imaging of Drosophila Larval Imaginal Discs.</a> PLoS One. 11 (9), e0163744(2016).</li>
<li>Ready, D. F., Hanson, T. E., Benzer, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Development+of+the+Drosophila+retina%2C+a+neurocrystalline+lattice%5BTitle%5D)+AND+%22Dev+Biol%22%5BJournal%5D)">Development of the Drosophila retina, a neurocrystalline lattice.</a> Dev Biol. 53 (2), 217-240 (1976).</li>
<li>Wolff, T., Ready, D. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+beginning+of+pattern+formation+in+the+Drosophila+compound+eye%3A+the+morphogenetic+furrow+and+the+second+mitotic+wave%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">The beginning of pattern formation in the Drosophila compound eye: the morphogenetic furrow and the second mitotic wave.</a> Development. 113 (3), 841-850 (1991).</li>
<li>Tomlinson, A., Ready, D. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neuronal+differentiation+in+Drosophila+ommatidium%5BTitle%5D)+AND+%22Dev+Biol%22%5BJournal%5D)">Neuronal differentiation in Drosophila ommatidium.</a> Dev Biol. 120 (2), 366-376 (1987).</li>
<li>Wolff, T., Ready, D. F. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aWolff%2C+T+%22The+Development+of+Drosophila+Melanogaster%22">The Development of Drosophila Melanogaster</a>. , Cold Spring Harbor Press. 1277-1316 (1993).</li>
<li>Adler, P. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Planar+signaling+and+morphogenesis+in+Drosophila%5BTitle%5D)+AND+%22Dev+Cell%22%5BJournal%5D)">Planar signaling and morphogenesis in Drosophila.</a> Dev Cell. 2 (5), 525-535 (2002).</li>
<li>Choi, K. W., Benzer, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Migration+of+glia+along+photoreceptor+axons+in+the+developing+Drosophila+eye%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Migration of glia along photoreceptor axons in the developing Drosophila eye.</a> Neuron. 12 (2), 423-431 (1994).</li>
<li>Strutt, D. I., Mlodzik, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ommatidial+polarity+in+the+Drosophila+eye+is+determined+by+the+direction+of+furrow+progression+and+local+interactions%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Ommatidial polarity in the Drosophila eye is determined by the direction of furrow progression and local interactions.</a> Development. 121 (12), 4247-4256 (1995).</li>
<li>Gaengel, K., Mlodzik, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Egfr+signaling+regulates+ommatidial+rotation+and+cell+motility+in+the+Drosophila+eye+via+MAPK%2FPnt+signaling+and+the+Ras+effector+Canoe%2FAF6%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Egfr signaling regulates ommatidial rotation and cell motility in the Drosophila eye via MAPK/Pnt signaling and the Ras effector Canoe/AF6.</a> Development. 130 (22), 5413-5423 (2003).</li>
<li>Li, C., Meinertzhagen, I. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Conditions+for+the+primary+culture+of+eye+imaginal+discs+from+Drosophila+melanogaster%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurobiol%22%5BJournal%5D)">Conditions for the primary culture of eye imaginal discs from Drosophila melanogaster.</a> J Neurobiol. 28 (3), 363-380 (1995).</li>
<li>Carthew, R. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pattern+formation+in+the+Drosophila+eye%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Opin+Genet+Dev%22%5BJournal%5D)">Pattern formation in the Drosophila eye.</a> Curr Opin Genet Dev. 17 (4), 309-313 (2007).</li>
<li>Treisman, J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Retinal+differentiation+in+Drosophila%5BTitle%5D)+AND+%22Wiley+Interdiscip+Rev+Dev+Biol%22%5BJournal%5D)">Retinal differentiation in Drosophila.</a> Wiley Interdiscip Rev Dev Biol. 2 (4), 545-557 (2013).</li>
<li>Huisken, J., Swoger, J., Del Bene,, Wittbrodt, F., J,, Stelzer, E. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Optical+sectioning+deep+inside+live+embryos+by+selective+plane+illumination+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Optical sectioning deep inside live embryos by selective plane illumination microscopy.</a> Science. 305 (5686), 1007-1009 (2004).</li>
<li>Keller, P. J., Stelzer, E. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantitative+in+vivo+imaging+of+entire+embryos+with+Digital+Scanned+Laser+Light+Sheet+Fluorescence+Microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Opin+Neurobiol%22%5BJournal%5D)">Quantitative in vivo imaging of entire embryos with Digital Scanned Laser Light Sheet Fluorescence Microscopy.</a> Curr Opin Neurobiol. 18 (6), 624-632 (2008).</li>
<li>Winter, P. W., Shroff, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Faster+fluorescence+microscopy%3A+advances+in+high+speed+biological+imaging%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Opin+Chem+Biol%22%5BJournal%5D)">Faster fluorescence microscopy: advances in high speed biological imaging.</a> Curr Opin Chem Biol. 20, 46-53 (2014).</li>
<li>Bosveld, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mechanical+Control+of+Morphogenesis+by+Fat%2FDachsous%2FFour-Jointed+Planar+Cell+Polarity+Pathway%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Mechanical Control of Morphogenesis by Fat/Dachsous/Four-Jointed Planar Cell Polarity Pathway.</a> Science. 336 (6082), 724-727 (2012).</li>
<li>Ghannad-Rezaie, M., Wang, X., Mishra, B., Collins, C., Chronis, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microfluidic+Chips+for+In+Vivo+Imaging+of+Cellular+Responses+to+Neural+Injury+in+Drosophila+Larvae%5BTitle%5D)+AND+%22Plos+One%22%5BJournal%5D)">Microfluidic Chips for In Vivo Imaging of Cellular Responses to Neural Injury in Drosophila Larvae.</a> Plos One. 7 (1), (2012).</li>
<li>Heemskerk, I., Lecuit, T., LeGoff, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dynamic+clonal+analysis+based+on+chronic+in+vivo+imaging+allows+multiscale+quantification+of+growth+in+the+Drosophila+wing+disc%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Dynamic clonal analysis based on chronic in vivo imaging allows multiscale quantification of growth in the Drosophila wing disc.</a> Development. 141 (11), 2339-2348 (2014).</li>
<li>Taylor, J., Adler, P. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell+rearrangement+and+cell+division+during+the+tissue+level+morphogenesis+of+evaginating+Drosophila+imaginal+discs%5BTitle%5D)+AND+%22Dev+Biol%22%5BJournal%5D)">Cell rearrangement and cell division during the tissue level morphogenesis of evaginating Drosophila imaginal discs.</a> Dev Biol. 313 (2), 739-751 (2008).</li>
<li>Ward, R. E., Reid, P., Bashirullah, A., D'Avino, P. P., Thummel, C. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((GFP+in+living+animals+reveals+dynamic+developmental+responses+to+ecdysone+during+drosophila+metamorphosis%5BTitle%5D)+AND+%22Dev+Biol%22%5BJournal%5D)">GFP in living animals reveals dynamic developmental responses to ecdysone during drosophila metamorphosis.</a> Dev Biol. 256 (2), 389-402 (2003).</li>
<li>Gibbs, S. M., Truman, J. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nitric+oxide+and+cyclic+GMP+regulate+retinal+patterning+in+the+optic+lobe+of+Drosophila%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Nitric oxide and cyclic GMP regulate retinal patterning in the optic lobe of Drosophila.</a> Neuron. 20 (1), 83-93 (1998).</li>
<li>Fristrom, J. W., Logan, W. R., Murphy, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Synthetic+and+Minimal+Culture+Requirements+for+Evagination+of+Imaginal+of+Drosophila-Melanogaster+in-Vitro%5BTitle%5D)+AND+%22Dev+Biol%22%5BJournal%5D)">Synthetic and Minimal Culture Requirements for Evagination of Imaginal of Drosophila-Melanogaster in-Vitro.</a> Dev Biol. 33 (2), 441-456 (1973).</li>
</ol>

Gli autori dichiarano di non avere interessi finanziari in competizione.

In questo studio, mettiamo a disposizione un protocollo dettagliato per un esperimento di imaging dal vivo a lungo termine su dischi immaginali Drosophila. Abbiamo passato un sacco di tempo praticando la dissezione attenta per evitare danni disco e per consentire il fissaggio del disco vicino alle lamelle. Abbiamo provato Poli-L-lisina (PLL) e basso punto di fusione agarosio per tenere il tessuto; Alla fine, l&#39;agarosio a bassa fusione ha mostrato una migliore capacità di trattenere il tessuto. Anche se solo il disco occhio è stato utilizzato in questo documento per dimostrare la normale verificarsi di differenziazione dei fotorecettori e rotazione ommatidial durante il periodo in vivo imaging 10 h, questo metodo può essere applicato ad almeno un altro disco, il disco ala, come dimostrato in un studio precedente 3. Inoltre, la preparazione del mezzo di coltura e la configurazione di imaging in tempo reale sono semplici e non richiedono l&#39;aerazione o medio circolazione. Continuo immagini dal vivo in grado di fornire una chiara sequenza temporale di vigilia biologicanti. Nella nostra precedente relazione di differenziazione glia e la migrazione nel disco occhio, abbiamo fornito la prova diretta che glia avvolgenti differenziano dalla glia esistente dopo la migrazione a anteriore del disco occhio 3. A lungo termine ex vivo della cultura consente la specifica di etichettatura laser-attivata di cellule, come la foto-conversione della proteina fluorescente KAEDE, a seguire i loro comportamenti 3. Può ospitare anche la sperimentazione di sostanze chimiche che vengono aggiunti direttamente al mezzo di coltura; Quindi, può essere utilizzato come piattaforma di screening farmaco. Da qualche processo dinamico verifica entro minuti o secondi, è richiesta un&#39;elevata risoluzione temporale. Per migliorare la risoluzione temporale, foglio microscopia ottica 15, 16 o filatura disco microscopia 17 può essere una buona opzione. La condizione cultura attuale non è perfetta. Non supporta la crescita del disco. cellulare proliferation è supportata solo fino a 12 h 3. Dopo 12 ore in coltura ex vivo, il tasso di differenziazione dei fotorecettori inizia a diminuire 3. Ciò può essere dovuto alla mancanza di determinate sostanze nutritive o ormoni. Poiché la differenza principale in questo terreno di coltura è l&#39;alta concentrazione di insulina, l&#39;insulina mammiferi può essere parzialmente mimando la funzione di peptidi insulino-simile endogeni. L&#39;aggiunta di estratto di volare, l&#39;insetto trealosio di zucchero nel sangue, e varie concentrazioni dell&#39;ormone muta 20-hydroxyecdysone, non erano favorevoli 3. Tuttavia, il periodo di coltura 12-18 h è sufficiente per studiare molti processi di sviluppo. Metodi di coltura alternativi per la coltura dischi immaginali larvali sono stati confrontati 3, e la nostra coltura e di imaging condizioni fornisce la finestra di tempo più lungo e più chiarezza per l&#39;imaging dal vivo. Sebbene i dischi all&#39;interno di larve vive e pupe possono essere esposte direttamente18, 19, 20, 21, 22, la finestra risoluzione e il tempo per le osservazioni sono limitate. Tardi larvale e dischi pupa possono essere coltivate per lungo tempo 23, 24, ma i dischi subiscono significativa morfogenesi. Per sfruttare le piane, dischi larvali 2D, il nostro metodo di coltura e di imaging è la soluzione migliore finora.

I Drosophila larvali dischi imaginali sono stati un sistema sperimentale favorita per lo studio di una grande varietà di meccanismi biologici. Questi dischi invaginate dall&#39;epitelio embrionale e diventano strutture sac-come costruito da due strati epiteliali, Peripodial Epitelio (PE) e Disc Proper (DP) 1, 2. Le cellule disco imaginal proliferano e progressivamente differenziano durante gli stadi larvali e pupe ed eventualmente sviluppare nelle strutture corporee degli adulti. A causa della struttura a due strati piatta e semplice dei dischi imaginali, sono facili da osservare quando sezionato da larve. Tuttavia, nonostante molti sforzi da molti gruppi, i metodi attuali per la cultura a lungo termine dei dischi immaginali non sono stati soddisfacenti. Abbiamo recentemente messo a punto un metodo di coltura che può sostenere il normale sviluppo di molteplici dischi immaginali per un massimo di 18 ore e che permette l&#39;imaging dal vivo 3 </sup&gt;. Il metodo di coltura può supportare la differenziazione e migrazione cellulare, ma può sostenere la proliferazione cellulare solo per 7-12 ore e non può sostenere la crescita disco. La differenza principale nel mezzo di coltura è l&#39;alta concentrazione di insulina 3. Il metodo è semplice, e non richiede alcun particolare aerazione o medio circolazione. Uno dei dischi immaginali più studiato è il disco di eye-antenne. L&#39;occhio di Drosophila è costruita di circa 800 ommatidi. Ogni ommatidium comprende otto fotorecettori (R1-R8). Nel disco occhio larvale, le cellule visive differenziare dopo il passaggio del Morfogenetica Solco (MF), che spazia attraverso il disco occhio da posteriore ad anteriore 4, 5. I fotorecettori in un ommatidium differenziano in sequenza, cominciando con R8, seguita da R2 / R5, R3 / R4, R1 / R6, R7 e 6. L&#39;ommatidi nella dorsale e vemetà ntral del disco dell&#39;occhio subiscono una rotazione di 90 ° in senso opposto, con conseguente chiralità opposta 7, 8. Il processo di rotazione avviene in due fasi: in primo luogo, una rotazione di 45 ° inizia a ed è completato alla sesta fila ommatidi dietro la MF; la seconda rotazione di 45 ° si completa in circa 16 fila 9, 10. Questo studio ha utilizzato rotazione ommatidial, contrassegnata dalla R3 / 4-specifici mδ0.5-GA4 11, per dimostrare la differenziazione cellulare normale e dinamiche che possono essere osservati attraverso questo metodo di coltura e vivere immagine disco occhio.

<table><tbody><tr><td>Agarosio a basso punto di fusione</td><td>AMRESCO&nbsp;</td><td>0815-25G</td><td></td></tr><tr><td>Soluzione salina tamponata con fosfato (PBS)</td><td>AMRESCO</td><td>0780-2PK</td><td></td></tr><tr><td>42 mm x 0,17 mm vetrini di copertura&nbsp;</td><td>PST</td><td>G401-42</td><td></td></tr><tr><td>Schneider' s Drosophila medium&nbsp;</td><td>Thermo</td><td>21720-024</td><td></td></tr><tr><td>Siero fetale bovino (FBS)</td><td>Sigma</td><td>F9665</td><td></td></tr><tr><td>Penicillina-streptomicina&nbsp;</td><td>GIBCO</td><td>759</td><td></td></tr><tr><td>Insulina</td><td>Sigma</td><td>I9278</td><td></td></tr><tr><td>Camera di coltura&nbsp;</td><td>PECON</td><td></td><td>POC-R2 Sistema di coltivazione cellulare</td></tr><tr><td>40X obiettivo</td><td></td><td></td><td>C-Apochromat 40X / 1.2W Obiettivo Korr</td></tr><tr><td>Mosca sforzo:nls. GFP</td><td>Bloominggton</td><td>4775</td><td></td></tr></tbody></table>

a lungo termine imaging in diretta di<em&gt; drosophila</em&gt; disco eye

Long-term Live Imaging of Drosophila Eye Disc

Immagini dal vivo offre la possibilità di monitorare continuamente i processi cellulari e dello sviluppo dinamico in tempo reale. Drosophila dischi imaginal larvali sono stati utilizzati per studiare molti processi biologici, quali la proliferazione cellulare, la differenziazione, la crescita, migrazione, apoptosi, concorrenza, segnalazione cellula-cellula, e la formazione confine compartimentale. Tuttavia, i metodi per il lungo termine ex vivo della cultura e immagini dal vivo dei dischi immaginali non sono stati soddisfacenti, nonostante i molti sforzi. Recentemente, abbiamo sviluppato un metodo per il lungo termine ex vivo la cultura e l&#39;imaging dal vivo di dischi immaginali per un massimo di 18 ore. Oltre a utilizzare una concentrazione elevata di insulina nel mezzo di coltura, un agarosio bassofondente è stato utilizzato anche per incorporare il disco per evitare che deriva durante il periodo di imaging. Questo rapporto utilizza i dischi eye-antennomero come esempio. / 4-specifico espressione fotorecettore R3 mδ0.5-GA4 stata seguita per dimostrare che fotorecettore differenziazione e rotazione ommatidial possono essere osservati durante un periodo imaging dal vivo 10 h. Questo è un protocollo dettagliato descrive questo metodo semplice.

<html> In questo esempio, i fotorecettori R3 / R4 sono stati marcati con mδ0.5-GA4 per monitorare differenziazione dei fotorecettori. mδ0.5-GA4 spinge forte espressione in R4 ed espressione debole in R3 11, rendendolo un eccellente indicatore di R3 e R4, nonché per il processo di rotazione ommatidial. Nel film 1, R3 e R4 sono stati etichettati con GFP. All&#39;inizio del 10 h sessione live-imaging, c&#39;erano 8 file di cluster ommatidial (Figura 2A e film 1) e 14 righe di cluster ommatidial alla fine (Figura 2B). Il tasso di differenziazione ommatidial era 1,67 h per riga, che è vicino al tasso di 1,5-2 h / riga dischi in vivo 7, 8, 9, 10, 11,s = &quot;xref&quot;&gt; 12, 13, 14. Sulla base delle posizioni relative di R3 e R4, rotazione ommatidial verificato nel disco coltivate ex vivo durante l&#39;imaging in tempo reale (Figura 2A &#39;A &#39;&#39;, B&#39;, e B &#39;&#39;). Un singolo gruppo R3 / R4 è stato marcato con una sfera bianca nel primo fotogramma del film 2. In principio, l&#39;asse R3 / R4 sembra essere perpendicolare all&#39;equatore (Figura 2C e film 2). Quindi sembra ruotare di 15 °, 30 °, e 45 ° a 3 (Figura 2C &#39;), 6 (Figura 2C &#39;&#39;) e 9 (figura 2C &#39;&#39;&#39;) h, rispettivamente. Questi dati suggeriscono che questo metodo può sostenere la differenziazione dei fotorecettori durante la 10 ore di immagini in diretta. <img alt="Figura 1" src="/files/ftp_upload/55748/55748fig1.jpg" /> Figure 1: Schema dell&#39;Assemblea Camera. Schema di montaggio della camera: (1) Inserire il coprioggetto doppio strato O-ring-attaccato sulla accettore palco. (2) Inserire l&#39;O-ring silicio sul vetrino. (3) Posizionare la base. (4) Bloccare l&#39;armadietto di tenuta. (5) Caricare il campione al centro della O-ring e posizionare il coperchio. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55748/55748fig1large.jpg" target="_blank">Si prega di cliccare qui per vedere una versione più grande di questa figura.</a> <img alt="figura 2" src="/files/ftp_upload/55748/55748fig2.jpg" /> Figura 2: Imaging vivo di R3 / R4 Differenziazione e rotazione. R3 / R4 etichettato con mδ0.5-GAL4 espressione forma nucleare GFP per 10 h di imaging dal vivo. Tutte le figure sono state catturate dal film 1. (A) Immagine catturata all&#39;inizio. ( <strong<html> &gt; A&#39;-A&quot;) Immagine ingrandita dalla zona in scatola a sinistra (A&#39;) e destra (A&quot;). (B) immagine presa al termine del periodo di 10 h. (B&#39;-B&quot;) Immagine ingrandita dalla zona in scatola a sinistra (B&#39;) e destra (B&quot;). (CC &#39;&#39; &#39;) Una singola coppia R3 / R4 (contrassegnata da una freccia in A&#39;) è seguita nel tempo per mostrare la rotazione della coppia R3 / R4. Barre di scala = 15 micron, 10 micron e 5 micron in A, B, e C, rispettivamente. Tutte le figure sono di massima intensità z-proiezioni. La scala temporale è mostrata in h: min. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55748/55748fig2large.jpg" target="_blank">Si prega di cliccare qui per vedere una versione più grande di questa figura.</a> <img alt="film 1" src="/files/ftp_upload/55748/55748mov1.jpg" /> Film 1:rce.jove.com/files/ftp_upload/55748/Movie_1.avi&quot; target = &#39;_ blank&#39;&gt; Clicca qui per scaricare questo film. <img alt="Movie 2" src="/files/ftp_upload/55748/55748mov2.jpg" /> Film 1: <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55748/Movie_2.avi" target="_blank">Si prega di cliccare qui per scaricare questo film.</a>

Questo protocollo descrive un metodo dettagliato per il lungo termine coltura ex vivo e in vivo imaging di un disco immaginale Drosophila. Dimostra la differenziazione dei fotorecettori e la rotazione ommatidial entro il periodo di 10 h di immagini dal vivo del disco occhio. Il protocollo è semplice e non richiede l&#39;installazione costosa.

A lungo termine Imaging in diretta di<em&gt; Drosophila</em&gt; Disco Eye

Live imaging provides the ability to continuously track dynamic cellular and developmental processes in real time. Drosophila larval imaginal discs have ...

L'obiettivo generale di questo metodo è mostrare l'imaging in tempo reale dei dischi immaginali, che sono comunemente utilizzati come modelli sperimentali per lo studio di una vasta gamma di fenomeni biologici, tra cui proliferazione cellulare, differenziamento, apoptosi e competizione cellulare. Questo metodo può contribuire a rispondere a domande fondamentali nel campo della biologia dello sviluppo, come ad esempio la morfologia e la migrazione cellulare in tessuti specifici. Il principale vantaggio di questa tecnica è che l'imaging continuo può fornire maggiori informazioni rispetto all'analisi di tessuti fissati, ad esempio sulla migrazione cellulare.Generalmente, chi si approccia per la prima volta a questo metodo incontrerà difficoltà, poiché la dissezione e il montaggio sono operazioni complesse. Una dimostrazione visiva di questo metodo è fondamentale, poiché la fase di rotazione e trasferimento è difficile da apprendere: una dissezione inadeguata porta infatti a risoluzioni scadenti. Per iniziare il protocollo, disinfettare l'equipaggiamento con etanolo al 70% e lasciarlo asciugare all'aria.Successivamente, selezionare una larva di terzo stadio da un contenitore per Drosophila e lavare la larva in soluzione salina fosfato tamponata 1X, o PBS, per prevenire contaminazioni provenienti dal contenitore. Posizionare la larva pulita in un millilitro di mezzo di coltura a temperatura ambiente in una piastra in vetro con nove pozzetti sotto un microscopio stereoscopico. Afferrare la larva con una pinzetta a circa un terzo della distanza rispetto all'estremità posteriore e, con un'altra pinzetta, afferrare l'uncino boccale.Tirare le due pinzette in direzioni opposte per liberare i tessuti interni. Quindi, rimuovere le ghiandole salivari, il corpo adiposo e il tegumento dal complesso occhio-cervello attaccato all'uncino boccale. Se il cordone nervoso ventrale è ancora attaccato, tagliarlo con le forbici.Utilizzare una pinzetta per afferrare l'uncino boccale. Utilizzare l'altra pinzetta per rimuovere il tessuto che collega il cervello e i dischi oculari nella regione dorsale. Successivamente, ruotare l'intero complesso in modo che il lato ventrale sia rivolto verso l'alto.Rimuovere il filamento che collega l'uncino o il disco al cervello. Successivamente, rimuovere l'uncino boccale, avendo cura di non danneggiare il disco oculare durante l'operazione. Il disco oculare è ora libero nel mezzo e collegato al cervello soltanto dal peduncolo ottico.Applicare uno strato doppio di anelli O al centro di un coperchio di 42 millimetri per 0,17 millimetri per trattenere l'agarosio. Successivamente, assemblare la camera con il coperchio. Posizionare il coperchio sull'accettore della piastra.Quindi, posizionare l'O-ring in silicone sul vetrino. Successivamente, posizionare la base, bloccare il fermo di sigillatura e applicare il coperchio. Utilizzando una micropipetta da 20 microlitri con un puntale da 10 a 200 microlitri, trasferire con attenzione il complesso occhio-cervello dissecato al centro dell'O-ring.Rimuovere la maggior parte del mezzo e aggiungere 12 microlitri di agarosio allo 0,7% a basso punto di fusione, a 37 gradi Celsius, al campione. Inclinare leggermente l'agarosio in modo che il campione rimanga aderente al coverslip ed evitare che il tessuto si stacchi. Aggiungere un millilitro di mezzo di coltura a temperatura ambiente al centro dell'O-ring.Assicurarsi che l'agarosio sia incollato all'O-ring per evitare che il campione si sposti. Posizionare la camera preparata sul piatto di un microscopio confocale invertito per 30 minuti per stabilizzare la temperatura. Prima dell'acquisizione prolungata di immagini in tempo reale, verificare che il tessuto sia integro mediante microscopia a contrasto di interferenza differenziale.Passare all'obiettivo 40x per l'acquisizione delle immagini. Infine, acquisire immagini Z-stack da 62 micrometri in 12 minuti con un intervallo ottico di un micrometro. Acquisire 40 cicli di scansioni per un totale di 10 ore, assicurandosi che ogni ciclo comprenda 12 minuti di acquisizione e 3 minuti di pausa.R3 e R4 sono stati marcati con GFP. All'inizio della sessione di imaging in tempo reale della durata di 10 ore, erano presenti otto file di aggregati ommatidiali, mentre alla fine si contavano 14 file di aggregati ommatidiali. Sulla base delle posizioni relative di R3 e R4, si è verificata una rotazione ommatidiale nel disco coltivato ex vivo durante l'imaging in tempo reale.All'inizio, l'asse R3/R4 appare perpendicolare all'equatore. Successivamente, sembra ruotare di 15 gradi in tre ore, di 30 gradi in sei ore e di 45 gradi in nove ore, suggerendo che questo metodo possa sostenere la differenziazione dei fotorecettori durante 10 ore di imaging vitale. Dopo aver visto questo video, si dovrebbe avere una buona comprensione di come dissezionare correttamente il disco oculare di Drosophila e di come eseguire l'immagine vitale.

long-term-live-imaging-of-drosophila-eye-disc

Research

Ricerca

JoVE Journal

Developmental Biology

Biologia dello sviluppo

Qui descriviamo un protocollo per esaminare la migrazione delle cellule gliali in un occhio lo sviluppo di Drosophila mediante l'analisi microscopica vivono in coppia con tag GFP cellule gliali.

Vivere Imaging della migrazione cellule gliali nella Eye Disco Drosophila immaginale

Descriviamo un romanzo rosso proteina fluorescente (RFP), giornalista che si esprime in particolare...

Un Reporter Novel RFP per aiutare nella visualizzazione del Disco Eye immaginale in Drosophila</em

Ematociti concentrati Drosophila disperdere sulla totalità dello sviluppo dell'embrione. Questo protocollo dimostra come montare e immagine queste migrazioni uso di embrioni con ematociti concentrati fluorescente.

Immagini dal vivo di Drosophila melanogaster Migrazioni Hemocyte embrionali

Preparazione di Sviluppo e degli adulti Drosophila Brains e retina per l&#39;imaging dal vivo

Source: Hellerman, M. B., et al. Imaging dal vivo dell'occhio  della pupa  di Drosophila. J. Vis. Exp. (2015)Il video dimostra una tecnica di imaging dal vivo per studiare il pattern oculare in una pupa di Drosophila melanogaster. I marcatori marcati con proteina fluorescente verde (GFP) consentono la visualizzazione dell'organizzazione e della differenziazione cellulare durante la formazione della struttura dell'occhio in via di sviluppo.

Imaging dal vivo dell'occhio pupale di Drosophila mediante microscopia a fluorescenza

Il metodo Tomato / GFP-FLP / FRT comporta la visualizzazione cellule fotorecettrici mosaico nel vivere Drosophila. Può essere usato per seguire singoli destini delle cellule fotorecettrici nella retina per giorni o settimane. Questo metodo è ideale per gli studi di degenerazione retinica e di malattie neurodegenerative o lo sviluppo delle cellule fotorecettori.

Il pomodoro / GFP-FLP / FRT Metodo per Live Imaging del Mosaico adulti<em&gt; Drosophila</em&gt; cellule fotorecettrici

Dettagli Questo protocollo un metodo semplificato utilizzato per condurre cellule vive nel contesto di un cervello larvale intatto. Approcci di imaging cellulare dal vivo hanno un valore inestimabile per lo studio delle divisioni asimmetriche di cellule staminali neurali così come altri processi neurogena e di sviluppo, in coerenza scoprendo i meccanismi che sono stati precedentemente trascurato.

Immagini dal vivo di<em&gt; Drosophila</em&gt; larvali neuroblasti

Le strutture adulte di Drosophila derivano da strutture simili a sacche chiamate dischi immaginali. L'analisi di questi dischi fornisce informazioni su molti processi di sviluppo, tra cui la determinazione dei tessuti, la definizione dei confini compartimentali, la proliferazione cellulare, la specificazione del destino cellulare e la polarità cellulare planare. Questo protocollo viene utilizzato per preparare i dischi immaginali per la microscopia ottica/fluorescente.

Dissezione e Immunostaining di immaginale dischi da Drosophila melanogaster

Questo protocollo presenta un metodo efficiente per l'imaging del neuroepitelio dell'occhio pupale di Drosophila. Questo metodo compensa il movimento dei tessuti e la topologia irregolare, migliora la visualizzazione dei confini cellulari attraverso l'uso di più proteine di giunzione marcate con GFP e utilizza un impianto di imaging facilmente assemblabile.

Live-imaging del Drosophila Pupa Eye

Qui, forniamo un protocollo dettagliato per eseguire l'imaging dal vivo della divisione asimmetrica delle cellule staminali germinali (GSC) nella nicchia ovarica di Drosophila. Utilizziamo una linea transgenica che esprime ubiquitariamente una fusione di proteina fluorescente verde (GFP) della proteina spettrosoma Par-1.

Imaging dal vivo esteso di nicchie di cellule staminali germinali femmina di Drosophila melanogaster

Qui, viene presentato un protocollo per l'imaging dal vivo a lungo termine della zampa di Drosophila durante lo stadio pupale, che prevede la rimozione completa del pupario. Questo protocollo può essere applicato anche ad altri tessuti.

Imaging dal vivo a lungo termine dello sviluppo della zampa pupale di Drosophila dopo la rimozione del pupario

Scopri l'imaging a lungo termine di dischi immaginali di Drosophila per studiare la differenziazione dei fotorecettori e la rotazione ommatidiale. Questo metodo consente l'osservazione in vivo dello sviluppo cellulare.

A lungo termine Imaging in diretta di

Esplora altri video