A lungo termine Imaging in diretta di Drosophila Disco Eye
May 6th, 2017
Questo protocollo descrive un metodo dettagliato per il lungo termine coltura ex vivo e in vivo imaging di un disco immaginale Drosophila. Dimostra la differenziazione dei fotorecettori e la rotazione ommatidial entro il periodo di 10 h di immagini dal vivo del disco occhio. Il protocollo è semplice e non richiede l'installazione costosa.
L'obiettivo generale di questo metodo è quello di mostrare l'imaging dal vivo dei dischi immaginali, che sono soggetti sperimentali popolari per lo studio di un'ampia varietà di fenomeni biologici tra cui la proliferazione cellulare, la differenziazione, l'apoptosi e la competizione. Questo metodo può aiutare a rispondere a domande chiave nel campo della biologia dello sviluppo, come la morfologia cellulare e la migrazione in tessuti specifici. Il vantaggio principale di questa tecnica è che l'imaging continuo può mostrare più informazioni rispetto al tessuto fisso, come la migrazione cellulare.
In generale, gli individui che non conoscono questo metodo avranno difficoltà perché la dissezione e il montaggio sono difficili. La dimostrazione visiva di questo metodo è fondamentale in quanto la fase di rotazione e trasferimento è difficile da apprendere perché una dissezione impropria provoca scarse risoluzioni. Per iniziare il protocollo, disinfettare l'attrezzatura con etanolo al 70% e lasciare asciugare l'attrezzatura all'aria.
Quindi, selezionare una larva di terzo stadio da una fiala di mosca e lavare la larva in soluzione salina tamponata con fosfato 1X, o PBS, per prevenire la contaminazione dalla fiala di mosca. Porre la larva pulita in un millilitro di terreno di coltura a temperatura ambiente in una piastra spot di vetro a nove pozzetti al microscopio da dissezione. Afferra la larva con un paio di pinze a 1/3 dell'estremità posteriore e, con un'altra pinza, afferra il gancio per la bocca.
Tirare le due pinze in direzioni opposte per rilasciare i tessuti interni. Quindi, rimuovere le ghiandole salivari, il corpo grasso e la cuticola dal complesso occhio-cervello attaccato al gancio della bocca. Se il cordone nervoso ventrale è ancora attaccato, taglialo via con le forbici.
Usa un paio di pinze per afferrare il gancio della bocca. Usa l'altro paio di pinze per rimuovere il tessuto che collega il cervello e i dischi oculari nella regione dorsale. Quindi, ruota l'intero complesso in modo che il lato ventrale sia rivolto verso l'alto.
Rimuovere il filamento che collega il gancio o il disco al cervello. Quindi, rimuovere il gancio per la bocca, facendo attenzione a non danneggiare il disco oculare durante il processo. Il disco oculare è ora libero nel mezzo e collegato al cervello solo dal gambo ottico.
Attacca un doppio strato di O-ring al centro di un vetrino coprioggetti da 42 millimetri per 0,17 millimetri per trattenere l'agarosio. Quindi, assemblare la camera con il vetrino coprioggetti. Posizionare il vetrino coprioggetti sull'accettore di scena.
Quindi, posizionare l'O-ring in silicone sul vetrino coprioggetti. Quindi, posizionare la base, bloccare l'armadietto di tenuta e posizionare il coperchio. Utilizzando una micropipetta da 20 microlitri con punta da 10 a 200 microlitri, trasferire con cura il complesso occhio-cervello sezionato al centro dell'O-ring.
Rimuovere la maggior parte del terreno e aggiungere al campione 12 microlitri di agarosio a 37 gradi Celsius allo 0,7% a basso punto di fusione. Verticalmente l'estremità dell'agar al campione può mantenere il tessuto vicino a un vetrino coprioggetti ed evitare di rotolare via dal campione. Aggiungere un millilitro di terreno di coltura a temperatura ambiente al centro dell'O-ring.
Assicurarsi che l'agarosio sia incollato all'O-ring per evitare che il campione vada alla deriva. Posizionare la camera preparata sul tavolino di un microscopio confocale invertito per 30 minuti per bilanciare la temperatura. Prima dell'imaging dal vivo a lungo termine, verificare se il tessuto è intatto mediante microscopia a contrasto ad interferenza differenziale.
Cambia l'obiettivo su 40x per l'imaging. Infine, acquisisci immagini Z-stack da 62 micrometri in 12 minuti a un intervallo ottico di un micrometro. Acquisisci 40 cicli di scansioni per un totale di 10 ore e assicurati che ogni ciclo contenga 12 minuti di imaging e tre minuti di riposo.
R3 e R4 sono stati etichettati con GFP. All'inizio della sessione di imaging dal vivo di 10 ore, c'erano otto file di cluster ommatidiali e, alla fine, 14 file di cluster ommatidiali. Sulla base delle posizioni relative di R3 e R4, la rotazione ommatidiale si è verificata nel disco coltivato ex vivo durante l'imaging dal vivo.
All'inizio, l'asse R3/R4 sembra essere perpendicolare all'equatore. Quindi, sembra ruotare di 15 gradi in tre ore, 30 gradi in sei ore e 45 gradi in nove ore, suggerendo che questo metodo può sostenere la differenziazione dei fotorecettori durante 10 ore di imaging dal vivo. Dopo aver visto questo video, dovresti avere una buona comprensione di come sezionare correttamente il disco oculare di Drosophila e condurre l'immagine dal vivo.
Panoramica
Questo protocollo delinea un metodo per la coltura ex vivo a lungo termine e l'imaging in vivo dei dischi immaginali di Drosophila, concentrandosi sulla differenziazione dei fotorecettori e sulla rotazione degli ommidei. La tecnica consente un'osservazione dettagliata per un periodo di 10 ore senza la necessità di attrezzature costose.
Componenti chiave dello studio
Area della scienza
- Biologia dello sviluppo
- Biologia cellulare
- Tecniche di imaging
Sfondo
- I dischi immaginali sono utilizzati per studiare vari fenomeni biologici.
- L'imaging in vivo fornisce informazioni sul comportamento cellulare che i tessuti fissi non possono.
- Le tecniche di dissezione e montaggio sono impegnative per i principianti.
- Le dimostrazioni visive sono cruciali per padroneggiare il protocollo.
Obiettivo dello studio
- Dimostrare l'imaging in vivo dei dischi oculari di Drosophila.
- Indagare sulla morfologia e migrazione cellulare.
- Osservare la differenziazione dei fotorecettori nel tempo.
Metodi utilizzati
- Dissezione di larve di terzo stadio per isolare i dischi oculari.
- Preparazione del mezzo di coltura e dell'agarosa per il supporto del tessuto.
- Imaging a lungo termine utilizzando un microscopio confocale invertito.
- Acquisizione di immagini Z-stack per monitorare la rotazione degli ommidei.
Risultati principali
- I cluster di ommidei sono aumentati da otto a quattordici file in 10 ore.
- I fotorecettori R3 e R4 hanno mostrato una rotazione di 45 gradi durante l'imaging.
- Il metodo ha mantenuto l'integrità del tessuto per tutto il periodo di imaging.
- La differenziazione dei fotorecettori è stata monitorata con successo in vivo.
Conclusioni
- Questo protocollo consente un'osservazione dettagliata dello sviluppo dei dischi oculari di Drosophila.
- L'imaging in vivo fornisce informazioni critiche sui processi cellulari.
- La tecnica può essere adattata per varie applicazioni sperimentali.
Domande frequenti
Executive Industry Relevance
Long-term live imaging of Drosophila imaginal discs enables real-time observation of dynamic developmental processes such as cell differentiation and tissue morphogenesis. This capability supports target validation by providing quantitative, time-resolved data on cellular behaviors in a genetically tractable system. The method enhances predictive confidence in early discovery by allowing direct visualization of phenotypic outcomes over extended culture periods.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Enables interrogation of therapeutic hypotheses through direct observation of photoreceptor differentiation and ommatidial rotation in eye-antennal discs.
- Operational Value: Supports biological de-risking by allowing functional validation of genetic targets in a disease-relevant system over 10-hour imaging windows.
Screening & Assay Development
- Scientific Value: Prepares validated biological systems for downstream workflows by maintaining tissue integrity and enabling consistent Z-stack acquisition.
- Operational Value: Addresses assay standardization and reproducibility through standardized dissection, embedding in low-melting agarose, and controlled culture conditions.
Translational & Preclinical Research
- Scientific Value: Discusses disease relevance and translational biomarker alignment by linking ommatidial rotation to photoreceptor maturation as a measurable developmental readout.
- Operational Value: Describes continuity from discovery through preclinical validation by sustaining tissue viability for up to 18 hours, enabling longitudinal tracking of differentiation events.
Pipeline & Workflow Integration
The method positions itself within the discovery continuum from Early Discovery to Lead Identification by supporting hypothesis testing and pathway clarification in developmental signaling pathways.
- Discovery Biology: Explains how the method supports hypothesis testing, pathway clarification, or biological de-risking by enabling real-time observation of R3/R4 photoreceptor dynamics during ommatidial rotation.
- Screening: Describes assay readiness, reproducibility, or quantitative outputs when supported by the article through standardized chamber preparation and consistent 62-micrometer Z-stack imaging over 40 cycles.
- Analytics: Highlights measurements, readouts, or statistical outputs that help teams compare conditions via tracking of ommatidial cluster row increase from eight to fourteen and R3/R4 axis rotation over time.
- Translational Research: Connects the method to preclinical continuity or biomarker alignment only when the source supports it by linking photoreceptor differentiation to observable structural changes in the eye disc.
- Enterprise Reuse: Frames the method as a reusable capability rather than a single-use technique through standardized agarose embedding and O-ring chamber design preventing sample drift.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Predictive confidence, target validation, reduction of mechanistic ambiguity.
- Operational Value: Standardization, reproducibility, and scalability.
- Strategic Value: Better go/no-go decisions, capital efficiency, and reduced late-stage biological risk.
- Portfolio Impact: Risk-adjusted prioritization and advancement decisions.
Implementation Considerations
- Required scientific expertise in Drosophila dissection and confocal microscopy.
- Instrumentation and analytical infrastructure needs including inverted confocal microscope and temperature-controlled stage.
- Cross-team standardization requirements for tissue handling, agarose preparation, and imaging protocol consistency.
- Adaptation considerations across model systems such as other imaginal discs or cultured cell systems.
- Practical limitations supported by source material including the difficulty of dissection and mounting for beginners and the need for visual demonstration to ensure proper technique.
