Rilevamento di ligandi estrogenici nei prodotti di cura personale utilizzando un lievito estrogeno schermo ottimizzato per il laboratorio di insegnamento universitari

L'obiettivo generale di questa procedura è utilizzare un test di screening degli estrogeni su lievito per quantificare gli agonisti del recettore degli estrogeni umani estratti da prodotti per la cura personale. Questo metodo può contribuire a rispondere a domande fondamentali nel campo della tossicologia, del disturbo endocrino e dell'ecofisiologia, poiché consente di rilevare e quantificare gli estrogeni ambientali presenti nell'acqua, negli alimenti e nei prodotti per la cura personale. I principali vantaggi di questa tecnica in vitro sono il basso costo, l'ampia diffusione e l'offerta di un'ottima piattaforma per l'insegnamento delle abilità tecniche di laboratorio.

Il rilevamento degli estrogeni ambientali è fondamentale perché possono alterare la segnalazione ormonale, in particolare durante lo sviluppo fetale e i periodi di transizione fisiologica come la pubertà. Le parti più complesse di questo metodo sono i calcoli e l'analisi dei dati, che abbiamo semplificato sviluppando un'applicazione di facile utilizzo. Inoltre, è essenziale un'accurata pipettaggio.

Questo protocollo inizia con la preparazione dei reagenti. Preparare i mezzi di coltura contenenti glucosio e galattosio, i controlli del veicolo con etanolo al 50% e gli standard di estradiolo che verranno utilizzati nel primo giorno del saggio, nonché il buffer LacZ, il ditiotreitolo e il carbonato di sodio per il secondo giorno. Sterilizzare i mezzi di coltura contenenti glucosio e galattosio mediante filtrazione attraverso un filtro da 0,2 micrometri.

Fino a 23 diversi prodotti per la cura personale (PCP) o controlli di estrazione possono essere testati in triplice replicato su una singola piastra a 96 pozzetti. I PCP includono sapone, crema per capelli, shampoo, protezione solare, trucco, crema da barba e lozione. Ai fini della ripresa, i campioni saranno preparati a partire da soli otto PCP.

Combinare un grammo di ogni campione con 10 millilitri di etanolo anidro in un tubo conico da 15 millilitri. Inoltre, preparare un controllo negativo di estrazione costituito da 11 millilitri di etanolo anidro in un tubo conico da 15 millilitri. Omogeneizzare il contenuto di ciascun tubo conico per 30 minuti mediante una combinazione di agitazione manuale e vortexaggio.

Centrifugare i tubi conici alla velocità massima consentita in una centrifuga a cestello per 10 minuti. Decantare il soprannatante da ogni tubo attraverso un filtro cellulare da 40 micrometri in un tubo conico da 50 millilitri. Successivamente, trasferire il contenuto di ogni tubo da 50 millilitri in un vial di vetro per scintillazione.

Lasciare evaporare completamente l'etanolo lasciando le provette aperte in una cappa ventilata per una settimana. Proteggere i campioni in asciugatura dalla luce per evitare il degrado dei costituenti sensibili alla luce. Quando i campioni sono asciutti, ricostituire ciascun campione in un millilitro di etanolo al 50% e quindi vortexare per omogeneizzare.

Due notti o circa 42 ore prima di preparare le piastre per il saggio di estrogeni su lievito (YES), utilizzare una tecnica asettica per sottocolturare il lievito aggiungendo 0,1 millilitri di ciascuna coltura attiva di lievito a 10 millilitri di terreno al glucosio sterilizzato per filtrazione in un matraccio Erlenmeyer sterile. Incubare a 30 gradi Celsius e continuare a incubare le colture originali come riserve. Due giorni dopo, al primo giorno del saggio YES, utilizzare una tecnica asettica per diluire le colture di lievito sospese e il terreno al galattosio sterilizzato per filtrazione in un becher sterile.

Verificare la densità ottica prelevando con una pipetta 120 microlitri di ciascun campione di lievito in triplice replicato, insieme a tre campioni bianchi di mezzo contenente galattosio, in una piastra in polistirene trasparente. Utilizzare un fotometro a piastre per verificare che la coltura di lievito diluita abbia una densità ottica netta di 0,065 più o meno 0,005 a una lunghezza d'onda di 610 nanometri. Determinare l'OD610 netto del lievito sottraendo l'OD610 dei campioni bianchi di mezzo contenente galattosio.

Utilizzando una pipetta ripetitrice con una punta sterile per siringa, aggiungere la sospensione di lievito diluita nei pozzetti di una micropiastina sterile in polipropilene a 96 pozzetti seguendo questo schema della piastra. Durante la pipettatura, mantenere il lievito in sospensione agitando continuamente il becher o mescolando con la pipetta. Infine, aggiungere 120 microlitri di mezzo al galattosio sterilizzato mediante filtrazione nei pozzetti H10-H12, indicati in verde nello schema della piastra, come controlli del mezzo per tenere conto degli assorbimenti dovuti esclusivamente al mezzo.

Preparare piastre separate per ogni combinazione di ceppo di lievito e substrato calorimetrico da testare. Successivamente, costruire una curva standard in ciascuna piastra mediante diluizione seriale secondo la disposizione della piastra. Utilizzare una pipetta monocanale con punte sterili per aggiungere cinque microlitri di standard di estradiolo nei pozzetti A2, A2 e A3. Usare una pipetta multicanale per mescolare il contenuto dei pozzetti mediante pipettaggio, quindi trasferire 205 microlitri dai pozzetti A1 ad A3 nei pozzetti B1 a B3. Ripetere il trasferimento di 205 microlitri fino alla riga G. Al termine della diluizione seriale, scartare 205 microlitri dai pozzetti G1 a G3. Al termine di questo passaggio, tutti i pozzetti dello standard dovranno contenere 120 microlitri.

Aggiungere cinque microlitri di etanolo al 50% in ciascun pozzetto del controllo veicolo contenente la sospensione di lievito, pozzetti H1, H2 e H3, indicati in blu in questo schema della piastra. Il passaggio successivo consiste nell'aggiungere triplicati di cinque microlitri di campioni o controlli negativi di estrazione nei pozzetti contenenti la sospensione di lievito, indicati in viola nello schema della piastra. Annotare quali campioni o controlli di estrazione vengono posizionati in ciascun pozzetto.

Per tenere traccia di quali pozzetti contengono campioni e quali no, iniziare con una nuova scatola di punte e utilizzare le punte dalle stesse posizioni della scatola corrispondenti alle posizioni dei pozzetti nella piastra. Mescolare il contenuto dei pozzetti del campione, del controllo di estrazione e del controllo del veicolo mediante pipettaggio. Regolare i volumi di questi pozzetti a 120 microlitri rimuovendo 205 microlitri da ciascuno.

Sigillare ogni piastra con un film adesivo sterile poroso, etichettarla e incubarla a 30 gradi Celsius per 17 ore. Dopo l'incubazione di 17 ore, rimuovere le piastre dall'incubatore. Se le piastre non possono essere processate immediatamente, avvolgerle nella pellicola trasparente e conservarle in frigorifero, a quattro gradi Celsius, per sei giorni.

Quando si è pronti per elaborare le piastre, rimuovere l'involucro. Utilizzare una pipetta multicanale per mescolare il contenuto di ogni riga di pozzetti, quindi trasferire 50 microlitri di sospensione di lievito da ogni pozzetto al pozzetto corrispondente di una nuova piastra microtitolazione da 96 pozzetti in polistirene trasparente. Etichettare la nuova piastra.

Per evitare la contaminazione incrociata tra pozzetti, utilizzare punte di pipetta nuove per ciascun pozzetto, ma le punte non devono essere sterili. In una cappa chimica, aggiungere 20 microlitri di DTT uno molare a 20 millilitri di buffer LacZ scongelato e a temperatura ambiente per ottenere una concentrazione finale di un millimolare di DTT. Mescolare bene il buffer LacZ.

Utilizzando una pipetta ripetitrice, aggiungere 200 microlitri di tampone LacZ contenente DTT e ONPG o CPRG in tutte le pozzette della piastra in polistirene e misurare immediatamente e registrare la densità ottica a 610 nanometri di tutte le pozzette utilizzando un lettore di piastre. Ripetere secondo necessità per piastre aggiuntive. Coprire le piastre con un coperchio e incubarle a 30 gradi Celsius per i tempi indicati.

Al termine dell'incubazione, rimuovere le piastre dall'incubatore. Utilizzare una pipetta ripetitrice per aggiungere 100 microlitri di carbonato di sodio in ciascun pozzetto per arrestare la reazione della beta-galattosidasi. Misurare e registrare la densità ottica a 405 nanometri per ONPG oppure a 574 nanometri per CPRG di tutti i pozzetti, utilizzando un spettrofotometro per piastre.

Il calcolo dei valori LacZ può essere effettuato utilizzando un'applicazione automatizzata che richiede l'installazione di Java. Per iniziare, aprire l'applicazione automatizzata LacZ descritta nell'appendice uno. Incollare le letture di densità ottica a 405 nanometri per ONPG o a 574 nanometri per CPRG di tutti i pozzetti, utilizzando un layout della piastra identico a quello mostrato nella figura uno.

Inserire la durata dell'incubazione e le ore necessarie per lo sviluppo del colore nel saggio, quindi fare clic su Avanti. Incollare i valori di densità ottica a 610 nanometri per tutti i pozzetti. Fare clic su Invia per visualizzare i risultati di LacZ.

I risultati di LacZ possono essere copiati utilizzando i comandi della tastiera e incollati in un foglio elettronico o in altri file secondo necessità. Per iniziare questa analisi, aprire l'applicazione online per l'analisi dei dati del saggio YES. Caricare un file di dati CSV formattato come descritto nella prima scheda.

Digitalizzare la curva standard di estradiolo nella seconda scheda e stimare i parametri di regressione. Visualizzare i risultati del modello di regressione nella terza scheda, quindi trovare i valori interpolati sull'asse x corrispondenti ai valori di LacZ dei campioni nella quarta scheda. Fare clic sulla quinta scheda per visualizzare i valori di equivalente estrogenico (EEQ) dei campioni.

Infine, standardizzare i valori di EEQ rispetto alla massa originale del campione come descritto nel protocollo del testo. Vengono mostrati esempi di curve standard ottenute dopo un'incubazione di 17 ore di lievito con 17 beta-estradiolo. Per i motivi discussi nel manoscritto, il CPRG è spesso una scelta di substrato migliore rispetto all'ONPG.

In linea con osservazioni precedenti, i saggi condotti con lieviti che esprimono ER Beta hanno mostrato una sensibilità superiore di oltre un ordine di grandezza rispetto ai saggi con lieviti che esprimono ER Alpha. Pertanto, l'attività estrogenica è stata rilevata più frequentemente utilizzando lieviti che esprimono ER Beta. Un ulteriore obiettivo dello studio era testare durate di incubazione compatibili con il programma di un corso di laboratorio per studenti universitari.

Quando è stato introdotto un periodo di refrigerazione di sei giorni dopo l'incubazione di 17 ore, le curve standard ottenute da piastre refrigerate erano paragonabili a quelle ottenute da piastre non refrigerate. Gli errori standard dei parametri stimati mediante modelli di regressione logistica a quattro parametri sono risultati tutti inferiori per le piastre refrigerate rispetto a quelle non refrigerate. Pertanto, la refrigerazione delle piastre per sei giorni riduce l'errore e migliora l'accuratezza delle stime di EEQ.

Una volta padroneggiata, questa tecnica può essere completata in due o tre-quattro sessioni di lavoro. Durante l'esecuzione della procedura, è fondamentale ricordare di adottare una tecnica asettica per tutti i passaggi eseguiti prima del periodo di incubazione di 17 ore, di pipettare con attenzione e precisione e di seguire il layout della piastra illustrato nella figura uno. Dopo aver seguito questa procedura, altri metodi, come saggi in vivo su animali, possono essere eseguiti per indagare ulteriori meccanismi d'azione degli estrogeni e gli effetti sull'organismo nel suo complesso.

Dopo il suo sviluppo, il test per lo screening degli estrogeni nel lievito è stato accettato come metodo economico per misurare ligandi estrogenici in campioni ambientali come alimenti, tessuti vegetali e prodotti per la cura personale. Dopo aver visto questo video, si dovrebbe avere una buona comprensione di come eseguire semplici estrazioni di prodotti per la cura personale, coltivare lieviti, preparare curve di diluizione standard, eseguire il saggio YES in una piastra a 96 pozzetti e completare i calcoli associati. E non dimenticare che lavorare con l'estradiolo può essere estremamente pericoloso, e che è sempre necessario adottare precauzioni come indossare guanti e altri dispositivi di protezione individuale, oltre a garantire lo smaltimento appropriato durante l'esecuzione di questa procedura.