Rilevamento di ligandi estrogenici nei prodotti di cura personale utilizzando un lievito estrogeno schermo ottimizzato per il laboratorio di insegnamento universitari

L'obiettivo generale di questa procedura è quello di utilizzare uno screening degli estrogeni del lievito per quantificare gli agonisti del recettore degli estrogeni umani estratti dai prodotti per la cura personale. Questo metodo può aiutare a rispondere a domande importanti nel campo della tossicologia, dell'interferenza endocrina e dell'ecofisiologia perché rileva e quantifica gli estrogeni ambientali nell'acqua, negli alimenti e nei prodotti per la cura personale. I principali vantaggi di questa tecnica in vitro sono che è economica e ampiamente utilizzata e fornisce un'eccellente piattaforma per l'insegnamento delle competenze tecniche di laboratorio.

Il rilevamento degli estrogeni ambientali è fondamentale perché possono modificare la segnalazione ormonale, in particolare durante lo sviluppo fetale e i periodi di transizione fisiologica come la pubertà. Le parti più difficili di questo metodo sono i calcoli e l'analisi dei dati, che abbiamo semplificato sviluppando un'applicazione facile da usare. Inoltre, un pipettaggio accurato è essenziale.

Questo protocollo inizia con la produzione dei reagenti. Preparare i terreni di glucosio e galattosio, i controlli del veicolo con etanolo al 50% e gli standard di estradiolo che verranno utilizzati il primo giorno del test, nonché il tampone LacZ, il ditiotreitolo e il carbonato di sodio per il secondo giorno. Sterilizzare i terreni di glucosio e galattosio mediante filtrazione attraverso un filtro da 0,2 micrometri.

È possibile testare fino a 23 diversi prodotti per la cura personale o PCP e controlli di estrazione in triplicato su una singola piastra a 96 pozzetti. I PCP includono sapone, crema per capelli, shampoo, crema solare, trucco, crema da barba e lozione. Ai fini delle riprese, i campioni saranno preparati da soli otto PCP.

Combinare un grammo di ciascun campione con 10 millilitri di etanolo anidro in una provetta conica da 15 millilitri. Inoltre, preparare un controllo di estrazione negativo costituito da 11 millilitri di etanolo anidro in una provetta conica da 15 millilitri. Omogeneizzare il contenuto di ciascun tubo conico per 30 minuti mediante una combinazione di agitazione manuale e vortex.

Centrifugare le provette coniche alla velocità massima consentita in una centrifuga a secchiello per 10 minuti. Decantare il surnatante da ciascuna provetta attraverso un colino cellulare da 40 micrometri in una provetta conica da 50 millilitri. Quindi trasferire il contenuto di ogni provetta da 50 millilitri in una fiala di vetro a scintillazione.

Lasciare evaporare completamente l'etanolo lasciando le fiale aperte in una cappa ventilata per una settimana. Proteggere i campioni essiccati dalla luce per evitare la degradazione dei componenti sensibili alla luce. Quando i campioni sono asciutti, ricostituire ogni campione in un millilitro di etanolo al 50% e poi agitare per omogeneizzare.

Due notti o circa 42 ore prima di preparare lo screening degli estrogeni del lievito o le piastre YES, utilizzare una tecnica sterile per sottocoltivare il lievito aggiungendo 0,1 millilitri di ciascuna coltura di lievito attivo a 10 millilitri di terreno di glucosio sterilizzato con filtro in un pallone sterile di Erlenmeyer. Incubare a 30 gradi Celsius e continuare a incubare le colture originali come ceppi. Due giorni dopo, il primo giorno del test YES, utilizzare una tecnica sterile per diluire le colture di lievito in sospensione e filtrare i terreni di galattosio sterilizzati in un becher sterile.

Confermare la densità ottica pipettando 120 microlitri di ciascun campione di lievito in triplicato insieme a spazi vuoti di terreno di galattosio triplicato in una lastra di polistirene trasparente. Utilizzare uno spettrofotometro a piastra per verificare che la coltura di lievito diluita abbia una densità ottica netta di 0,065 più o meno 0,005 a una lunghezza d'onda di 610 nanometri. Determinare l'OD610 netto del lievito sottraendo l'OD610 dei bianchi del terreno di galattosio.

Utilizzando un pipettatore ripetuto con una punta per siringa sterile, aggiungere la sospensione di lievito diluita ai pozzetti di una micropiastra sterile in polipropilene a 96 pozzetti secondo questo layout della piastra. Durante il pipettaggio, mantenere in sospeso il lievito di partenza facendo roteare continuamente il becher o mescolando con la pipetta. Infine, aggiungere 120 microlitri di terreno di galattosio sterilizzato con filtro ai pozzetti da H10 a H12, indicati in verde nel layout della piastra, per fungere da controlli del terreno che terranno conto degli assorbenti forniti dal solo terreno.

Preparare piastre separate per ogni combinazione di ceppo di lievito e substrato calorimetrico che verrà testato. Quindi, costruire una curva standard in ciascuna piastra mediante diluizione seriale in base al layout della piastra. Utilizzare un pipettatore monocanale con puntali sterili per aggiungere cinque microlitri di estradiolo standard ai pozzetti A2, A2 e A3. Utilizzare un pipettatore multicanale per miscelare il contenuto dei pozzetti mediante pipettaggio, quindi trasferire 205 microlitri dai pozzetti A1 ad A3 nei pozzetti da B1 a B3. Ripetere il trasferimento di 205 microlitri attraverso la riga G.Dopo aver completato la diluizione seriale, scartare 205 microlitri dai pozzetti G1 a G3.At la fine di questo passaggio, tutti i pozzetti standard dovrebbero contenere 120 microlitri.

Aggiungere cinque microlitri di etanolo al 50% a ciascun pozzetto di controllo del veicolo contenente le sospensioni del lievito, pozzetti H1, H2 e H3, indicati in blu in questo layout di targa. Il passo successivo consiste nell'aggiungere triplicati di campioni da cinque microlitri o controlli di estrazione negativi ai pozzetti contenenti la sospensione di lievito, indicati in viola nel layout della piastra. Prendere nota di quali campioni o controlli di estrazione sono collocati in quali pozzi.

Per tenere traccia di quali pozzetti hanno campioni e quali no, inizia con una nuova scatola di punte e usa le punte dalle stesse posizioni nella scatola delle posizioni dei pozzetti corrispondenti nella piastra. Miscelare il contenuto dei pozzetti del campione, del controllo dell'estrazione e del controllo del veicolo mediante pipettaggio. Regolare i volumi di questi pozzetti a 120 microlitri rimuovendo 205 microlitri da ciascuno.

Sigillare ogni piastra con una pellicola porosa adesiva sterile, etichettare e incubare a 30 gradi Celsius per 17 ore. Dopo l'incubazione di 17 ore, rimuovere le piastre dall'incubatrice. Se le piastre non possono essere lavorate immediatamente, avvolgerle nella pellicola trasparente e conservare in frigorifero le piastre avvolte a quattro gradi Celsius per sei giorni.

Quando sei pronto per lavorare i piatti, scartali. Utilizzare un pipettatore multicanale per miscelare il contenuto di ogni fila di pozzetti, quindi trasferire 50 microlitri di sospensione di lievito da ciascun pozzetto al pozzetto corrispondente di una micropiastra a 96 pozzetti in polistirene trasparente. Etichettare la nuova targa.

Per evitare la contaminazione incrociata dei pozzetti, utilizzare nuovi puntali per pipette per ogni pozzetto, ma non è necessario che i puntali siano sterili. In una cappa aspirante, aggiungere 20 microlitri di DTT molare a 20 millilitri di tampone LacZ scongelato a temperatura ambiente per una concentrazione finale di DTT millimolare. Mescolare bene il tampone LacZ.

Utilizzando un pipettatore ripetuto, aggiungere 200 microlitri di tampone LacZ contenente DTT e ONPG o CPRG a tutti i pozzetti della piastra di polistirene e misurare e registrare immediatamente la densità ottica a 610 nanometri di tutti i pozzetti utilizzando un lettore di piastre. Ripetere l'operazione se necessario per le piastre aggiuntive. Coprite le piastre con un coperchio e incubatele a 30 gradi centigradi per i tempi indicati.

Al termine dell'incubazione, rimuovere le piastre dall'incubatrice. Utilizzare un pipettatore ripetuto per aggiungere 100 microlitri di carbonato di sodio a ciascun pozzetto per mantenere la reazione beta-galattosidasi. Misurare e registrare la densità ottica a 405 nanometri per ONPG o 574 nanometri per CPRG di tutti i pozzetti utilizzando uno spettrofotometro a piastre.

Un calcolo dei valori LacZ può essere effettuato utilizzando un'applicazione automatizzata che richiede l'installazione di Java. Per iniziare, aprire l'applicazione automatizzata LacZ descritta nell'appendice uno. Incollare le letture della densità ottica a 405 nanometri per ONPG o 574 nanometri per CPRG di tutti i pozzetti utilizzando una disposizione della piastra identica a quella mostrata nella figura uno.

Immettere la quantità di tempo e ore di incubazione per la produzione del colore da parte del saggio, quindi fare clic su Avanti. Incollare le letture della densità ottica a 610 nanometri per tutti i pozzetti. Fare clic su Invia per visualizzare i risultati di LacZ.

I risultati di LacZ possono essere copiati utilizzando i comandi da tastiera e incollati in un foglio di calcolo o in altri file, se necessario. Inizia questa analisi aprendo l'applicazione online per l'analisi dei dati del saggio YES. Caricare un file di dati CSV formattato come descritto nella prima scheda.

Digitalizza la curva standard dell'estradiolo nella seconda scheda e stima i parametri di regressione. Visualizzare gli output del modello di regressione nella terza scheda e quindi trovare i valori dell'asse x interpolati corrispondenti ai valori LacZ degli esempi nella quarta scheda. Fare clic sulla quinta scheda per visualizzare i valori equivalenti di estrogeni o EEQ dei campioni.

Infine, standardizzare i valori EEQ alla massa del campione originale come descritto nel protocollo di testo. Sono mostrati esempi di curve standard dopo un'incubazione di 17 ore di lievito con 17 beta-estradiolo. Per le ragioni discusse nel manoscritto, il CPRG è spesso una scelta di substrato migliore rispetto all'ONPG.

Coerentemente con le osservazioni precedenti, i saggi con ER Beta che esprime lievito erano più di un ordine di grandezza più sensibili rispetto ai test con ER Alpha che esprime lievito. Pertanto, l'attività estrogenica è stata rilevata più spesso con il lievito che esprime ER Beta. Un ulteriore obiettivo dello studio è stato quello di testare tempi di durata dell'incubazione compatibili con il programma di un corso di laboratorio universitario.

Quando è stato introdotto un periodo di refrigerazione di sei giorni dopo l'incubazione di 17 ore, le curve standard delle piastre refrigerate erano paragonabili a quelle delle piastre non refrigerate. Gli errori standard dei parametri stimati utilizzando modelli di regressione logistica a quattro parametri erano tutti più piccoli per le piastre refrigerate rispetto alle piastre non refrigerate. Pertanto, la refrigerazione delle piastre per sei giorni riduce l'errore e migliora l'accuratezza delle stime EEQ.

Una volta padroneggiata, questa tecnica può essere completata in due sessioni di tre o quattro ore. Durante il tentativo di eseguire la procedura, è importante ricordare di utilizzare la tecnica sterile per tutti i passaggi eseguiti prima del periodo di incubazione di 17 ore, di pipettare con attenzione e precisione e di seguire il layout della piastra presentato nella figura uno. Seguendo questa procedura, è possibile eseguire altri metodi, come i saggi in vivo su animali, per studiare ulteriori meccanismi di azione estrogenica e gli effetti dell'intero organismo.

Dopo il suo sviluppo, lo screening degli estrogeni del lievito è stato accettato come misura a basso costo per misurare i ligandi estrogenici in campioni ambientali come alimenti, tessuti vegetali e prodotti per la cura personale. Dopo aver visto questo video, dovresti avere una buona comprensione di come eseguire semplici estrazioni di prodotti per la cura personale, coltivare il lievito, preparare curve di diluizione standard, eseguire il test YES in una piastra a 96 pozzetti e completare i calcoli associati. E non dimenticare che lavorare con l'estradiolo può essere estremamente pericoloso e che durante l'esecuzione di questa procedura dovrebbero essere sempre prese precauzioni come indossare guanti e altri dispositivi di protezione individuale, oltre a garantire uno smaltimento appropriato.