Name: Iontoforesi in tempo reale con tetrametilammonio per quantificare la frazione del volume e la tortuosità dello spazio extracellulare del cervello (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-07-24T13:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 45 s
Description: Impara l'iontoforesi in tempo reale con tetrametilammonio per quantificare la frazione del volume e la tortuosità dello spazio extracellulare cerebrale. Questo metodo consente la caratterizzazione in tempo reale dei parametri ECS nel tessuto cerebrale vivo.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Il lavoro è stato sostenuto da NIH NINDS concedere R01 NS047557.

<ol><li>Sykova, E., Nicholson, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Diffusion+in+brain+extracellular+space%5BTitle%5D)+AND+%22Physiol+Rev%22%5BJournal%5D)">Diffusion in brain extracellular space.</a> Physiol Rev. 88 (4), 1277-1340 (2008).</li>
<li>Nicholson, C. <a target="_blank" href="https://www.researchgate.net/publication/230904011_Diffusion_and_related_transport_mechanisms_in_brain_tissue">Diffusion and related transport mechanisms in brain tissue.</a> Rep Prog Phys. 64 (7), 815-884 (2001).</li>
<li>Nicholson, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ion-selective+microelectrodes+and+diffusion+measurements+as+tools+to+explore+the+brain+cell+microenvironment%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci+Methods%22%5BJournal%5D)">Ion-selective microelectrodes and diffusion measurements as tools to explore the brain cell microenvironment.</a> J Neurosci Methods. 48 (3), 199-213 (1993).</li>
<li>Nicholson, C., Phillips, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ion+diffusion+modified+by+tortuosity+and+volume+fraction+in+the+extracellular+microenvironment+of+the+rat+cerebellum%5BTitle%5D)+AND+%22J+Physiol%22%5BJournal%5D)">Ion diffusion modified by tortuosity and volume fraction in the extracellular microenvironment of the rat cerebellum.</a> J Physiol. 321, 225-257 (1981).</li>
<li>Nicholson, C., Sykova, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Extracellular+space+structure+revealed+by+diffusion+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Extracellular space structure revealed by diffusion analysis.</a> Trends Neurosci. 21 (5), 207-215 (1998).</li>
<li>Xie, L. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sleep+drives+metabolite+clearance+from+the+adult+brain%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Sleep drives metabolite clearance from the adult brain.</a> Science. 342 (6156), 373-377 (2013).</li>
<li>Hrabetova, S., Nicholson, C. Biophysical properties of brain extracellular space explored with ion-selective microelectrodes, integrative optical imaging and related techniques. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/?term=Biophysical+properties+of+brain+extracellular+space+explored+with+ion-selective+microelectrodes%2C+integrative+optical+imaging+and+related+techniques">Electrochemical Methods for Neuroscience Neuroscience</a>. Michael, A. C., Borland, L. M. , CRC press. 167-204 (2007).</li>
<li>Rice, M. E., Okada, Y. C., Nicholson, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Anisotropic+and+heterogeneous+diffusion+in+the+turtle+cerebellum%3A+implications+for+volume+transmission%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurophysiol%22%5BJournal%5D)">Anisotropic and heterogeneous diffusion in the turtle cerebellum: implications for volume transmission.</a> J Neurophysiol. 70 (5), 2035-2044 (1993).</li>
<li>Vargova, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Diffusion+parameters+of+the+extracellular+space+in+human+gliomas%5BTitle%5D)+AND+%22Glia%22%5BJournal%5D)">Diffusion parameters of the extracellular space in human gliomas.</a> Glia. 42 (1), 77-88 (2003).</li>
<li>Haack, N., Durry, S., Kafitz, K. W., Chesler, M., Rose, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Double-barreled+and+concentric+microelectrodes+for+measurement+of+extracellular+ion+signals+in+brain+tissue%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Double-barreled and concentric microelectrodes for measurement of extracellular ion signals in brain tissue.</a> J Vis Exp. (103), (2015).</li>
<li>Xiao, F., Hrabetova, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Enlarged+extracellular+space+of+aquaporin-4-deficient+mice+does+not+enhance+diffusion+of+Alexa+Fluor+488+or+dextran+polymers%5BTitle%5D)+AND+%22Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Enlarged extracellular space of aquaporin-4-deficient mice does not enhance diffusion of Alexa Fluor 488 or dextran polymers.</a> Neuroscience. 161 (1), 39-45 (2009).</li>
<li>Sherpa, A. D., Pvan de Nes,, Xiao, F., Weedon, J., Hrabetova, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Gliotoxin-induced+swelling+of+astrocytes+hinders+diffusion+in+brain+extracellular+space+via+formation+of+dead-space+microdomains%5BTitle%5D)+AND+%22Glia%22%5BJournal%5D)">Gliotoxin-induced swelling of astrocytes hinders diffusion in brain extracellular space via formation of dead-space microdomains.</a> Glia. 62 (7), 1053-1065 (2014).</li>
<li>Kume-Kick, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Independence+of+extracellular+tortuosity+and+volume+fraction+during+osmotic+challenge+in+rat+neocortex%5BTitle%5D)+AND+%22J+Physiol%22%5BJournal%5D)">Independence of extracellular tortuosity and volume fraction during osmotic challenge in rat neocortex.</a> J Physiol. 542 (Pt 2), 515-527 (2002).</li>
<li>Saghyan, A., Lewis, D. P., Hrabe, J., Hrabetova, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Extracellular+diffusion+in+laminar+brain+structures+exemplified+by+hippocampus%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci+Methods%22%5BJournal%5D)">Extracellular diffusion in laminar brain structures exemplified by hippocampus.</a> J Neurosci Methods. 205 (1), 110-118 (2012).</li>
<li>Fedirko, N., Svichar, N., Chesler, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fabrication+and+use+of+high-speed%2C+concentric+H%2B-+and+Ca2%2B-selective+microelectrodes+suitable+for+in+vitro+extracellular+recording%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurophys%22%5BJournal%5D)">Fabrication and use of high-speed, concentric H+- and Ca2+-selective microelectrodes suitable for in vitro extracellular recording.</a> J Neurophys. 96 (2), 919-924 (2006).</li>
<li>Nicholson, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Diffusion+from+an+injected+volume+of+a+substance+in+brain+tissue+with+arbitrary+volume+fraction+and+tortuosity%5BTitle%5D)+AND+%22Brain+Res%22%5BJournal%5D)">Diffusion from an injected volume of a substance in brain tissue with arbitrary volume fraction and tortuosity.</a> Brain Res. 333 (2), 325-329 (1985).</li>
<li>Nicholson, C., Tao, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hindered+diffusion+of+high+molecular+weight+compounds+in+brain+extracellular+microenvironment+measured+with+integrative+optical+imaging%5BTitle%5D)+AND+%22Biophys+J%22%5BJournal%5D)">Hindered diffusion of high molecular weight compounds in brain extracellular microenvironment measured with integrative optical imaging.</a> Biophys J. 65 (6), 2277-2290 (1993).</li>
<li>Thorne, R. G., Nicholson, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vivo+diffusion+analysis+with+quantum+dots+and+dextrans+predicts+the+width+of+brain+extracellular+space%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">In vivo diffusion analysis with quantum dots and dextrans predicts the width of brain extracellular space.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 103 (14), 5567-5572 (2006).</li>
<li>Wolak, D. J., Thorne, R. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Diffusion+of+macromolecules+in+the+brain%3A+implications+for+drug+delivery%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Pharm%22%5BJournal%5D)">Diffusion of macromolecules in the brain: implications for drug delivery.</a> Mol Pharm. 10 (5), 1492-1504 (2013).</li>
</ol>

Gli autori dichiarano di non avere interessi finanziari concorrenti.

<img alt="Figura 10" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/55755/55755fig10.jpg" /> Figura 10: Dati non ideali che dimostrano problemi tecnici comuni. (A) Schemi di problemi tecnici comuni con microelettrodi ionoforesi: Confronto tra il normale rilascio di TMA da un microelettrodo funzionamento ionoforesi con tre fonti che dimostrano problemi tecnici. [Elevata ingrandimento, a1] La corrente in una sorgente ionoforica ideale viene trasportata ugualmente da rilascio di TMA e assorbi...

<html> Lo spazio extracellulare (ECS) è la rete di canali interconnessi esterni a tutte le cellule del cervello e contiene sia il liquido interstiziale che la matrice extracellulare ( Figura 1a e Figura 1b ). La distribuzione di molte sostanze necessarie per la funzionalità delle cellule cerebrali, comprese le sostanze nutritive, gli ormoni e i neurotrasmettitori, avviene per diffusione attraverso la ECS. I cambiamenti nei parametri fisici di questo spazio, compresi il volume, la geometria e la matrice extracellulare, possono influenzare drasticamente la diffusione attraverso la ECS e le cellule cerebrali di concentrazione delle ioni locali che hanno un impatto profondo sulla funzione delle cellule cerebrali 1 , 2 . La iontoforesi in tempo reale (RTI) è utilizzata per determinare due caratteristiche strutturali di una regione del cervello: frazione di volume e tortuosità 3 , 4 ,&quot;Xref&quot;&gt; 5. La frazione di volume ( α ) è la proporzione del volume tissutale occupato dall&#39;ECS ( V ECS ) rispetto al volume totale del tessuto ( tessuto V ) in un volume elementare rappresentativo; <img alt="Equazione" src="/files/ftp_upload/55755/55755eq1.jpg" /> La tortuosità ( λ ) è l&#39;impedenza relativa che una sostanza incontra quando diffonde attraverso una regione del cervello rispetto ad un mezzo senza ostruzioni; <img alt="Equazione" src="/files/ftp_upload/55755/55755eq2.jpg" /> Dove D * (cm 2 s -1 ) è il efficace coefficiente di diffusione della sostanza nel cervello e D (cm 2 s -1 ) è il coefficiente di diffusione libera della sostanza in un mezzo libero, come il gel agarosio diluito. Oggi, la sostanza sonda più comunemente utilizzata per la RIl metodo TI è il piccolo cation tetrametilammonio (TMA). TMA ha un peso molecolare di 74 g / mol, si dissociizza completamente in soluzione e ha una carica positiva. Gli studi di RTI con questo ione hanno dimostrato che α <img alt="Equazione" src="/files/ftp_upload/55755/55755eq3.jpg" /> 0,2 e λ <img alt="Equazione" src="/files/ftp_upload/55755/55755eq3.jpg" /> 1,6 1 , 2 . Ciò significa che l&#39;ECS è circa il 20% del volume totale del cervello e che la diffusione di una piccola molecola inerte si verifica circa 2,5 volte più lentamente nella ECS che in un mezzo senza ostruzioni 3 . Tuttavia, entrambi α e λ variano con l&#39;età del cervello, la regione e lo stato e nelle condizioni patologiche 1 . Le alterazioni di questi parametri sono state legate allo sviluppo del cervello, all&#39;invecchiamento, al sonno, all&#39;epilessia e ad altri processi fondamentali e alle malattie del cervello 1, 6 . Mentre altre tecniche misurano α e λ , RTI può misurare sia in regioni localizzate del tessuto vivente in tempo reale. Per questa ragione, RTI è diventato uno strumento indispensabile per indagare i cambiamenti in α e λ durante le sfide acute e reversibili. La teoria che supporta RTI è stata originariamente convalidata da Nicholson e Phillips, e la tecnica è stata ampiamente usata da quel tempo 4 , 7 . Gli esperimenti che impiegano RTI iniziano con il rilascio di un impulso di TMA da un microelettrodo di origine mediante iontoforesi in un gel agaroso diluito. Una volta espulsi, gli ioni si diffondono liberamente dalla sorgente di punti, scegliendo da un numero potenzialmente infinito di percorsi casuali ( Figura 1d ). La variabile concentrazione dello ione viene misurata nel tempo utilizzando un microelettrodo ionico-selettivo (ISM) posizionato approssimativamente100 μm di distanza ( figura 1c ). Le variazioni della concentrazione TMA sono grafiche e montate su una curva che permette di calcolare sia il D che il numero di trasporto del microelettrodo ionoforesi (parametri discussi nel Protocollo). Con questi valori, la procedura viene ripetuta in una regione cerebrale di interesse per ottenere D * e per calcolare sia α che λ . Il controllo del microelettrodo ionoforesi, la raccolta dei dati, la grafica e l&#39;adattamento della curva di concentrazione TMA e il calcolo dei parametri sperimentali sono tutti tipicamente eseguiti dai programmi Wanda e Walter, che sono stati appositamente progettati per questo scopo (il software ei relativi manuali sono Liberamente disponibile dagli autori su richiesta). La sezione del protocollo di questa rassegna descrive le procedure di base necessarie per progettare e eseguire RTI nelle fette del cervello di roditore. La tecnica è stata usata anche in non-astaTra cui le fette del cervello umano e le preparazioni cerebrali in vivo 1 , 4 , 6 , 8 , 9 . La sezione Risultati rappresentativi fornisce sia risultati ideali che non ideali per evidenziare le sfumature nell&#39;interpretazione dei dati. Infine, la sezione Discussione riguarda brevemente tecniche di risoluzione dei problemi, limitazioni di RTI, tecniche alternative utilizzate per studiare l&#39;ECS e future applicazioni di RTI. <img alt="Figura 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/55755/55755fig1.jpg" /> Figura 1: Diagrammi di diffusione tramite ECS. (A) Schema di ECS: dimostra la dimensione e la posizione della ECS in una sezione tipica del cervello. Il colore giallo contrassegna l&#39;ECS tra i processi grigi della cervello. Il volume della ECS è circa il 20% del volume totale del tessuto ( cioè, frazione volume = 0.2) in condizioni fisiologiche. ( B ) Schema ingrandito della ECS: evidenzia i parametri fisici che contribuiscono alla tortuosità, compresa la geometria delle cellule cerebrali (grigio) e la matrice extracellulare (schematizzata come una mesh di glicosaminoglicani multicolori e proteoglicani). ( C ) Diagramma 3D della diffusione da una sorgente di punti: dimostra il movimento netto delle molecole inerte da una sorgente ionoforoica ad un ISM. Escludendo le barriere di diffusione e l&#39;assorbimento cellulare le molecole si diffondono verso l&#39;esterno in tutte le direzioni, producendo una parte frontale di concentrazione sferica. L&#39;ISM quantifica la concentrazione locale delle molecole inerte rilasciate dalla fonte iontoforica. ( D ) Simulazione computerizzata della diffusione in ECS del cervello: [Fine a sinistra] Impostazione per la simulazione di Monte Carlo; Le sfere verdi rappresentano i processi delle cellule cerebrali e la croce rossa rappresenta una fonte di punti. Questa impostazione modella il tessuto cerebrale disegnato in Figura 1a . [Immagini medie] 3 e6 molecole che eseguono movimenti casuali in quanto diffondono attraverso lo spazio extracellulare del cervello, mostrato in 2 dimensioni. [Estrema destra] Camminate casuali di molte molecole rilasciate dalla sorgente di punti. Il movimento netto di tutte le molecole dalla sorgente di punti è verso l&#39;esterno come mostrato nella Figura 1c . Le passeggiate casuali cumulative delineano gli spazi tra le celle ( cioè l&#39;ECS; vedere il riferimento 5 per ulteriori spiegazioni). <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55755/55755fig1large.jpg" target="_blank">Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>

<table><tbody><tr><td>Convertitore A/D e D/A</td><td>National Instruments Corporation</td><td>NI USB-6221 DAQ</td><td>NI USB-6221 è ancora venduto come dispositivo 'Legacy' da NI. Si consiglia l'utilizzo di NI USB-6341 X Series DAQs per le nuove installazioni, tuttavia non abbiamo testato le unità più recenti. Descriviamo l'utilizzo di NI USB-6221 con MATLAB e Windows 7 (32-bit). Alternative: il convertitore A/D PCI-MIO-16E-4 molto più vecchio (utilizzato solo con Windows XP o sistemi operativi precedenti) con pannello connettore BNC-2090 BNC e cavo SH68-68-EP. Come indicato nel Manuale Wanda, è disponibile un programma MATLAB sperimentale per l'utilizzo dei file binari Axon.</td></tr><tr><td>agarosio</td><td>Lonza</td><td>NuSieve GTG Agarosio #50081</td><td>per preparare gel di agarosio diluito per misure RTI</td></tr><tr><td>amplificatore per ISM</td><td>Dagan</td><td>Modello IX2-700 Dual Intracellular Preamplifier</td><td>amplificatore di tensione ionica e di riferimento con N=0,1 (per cilindro di riferimento) e N=0,001 (per cilindro ionico)</td></tr><tr><td>miscroscopio composto biologico (con obiettivo 4x e 10x)</td><td></td><td></td><td>per la scheggiatura delle punte dei microelettrodi e l'ispezione dei microelettrodi; vari fornitori, ad es. AmScope</td></tr><tr><td>tubo di vetro capillare in borosilicato theta</td><td>Harvard</td><td>Apparatus Warner Instruments modello TG200-4; ordine #64-0811</td><td>tubo di vetro a doppio cilindro per microelettrodi iono-selettivi e microelettrodi ionoforetici; O.D. 2,0 mm, D.I. 1,4 mm, setto 0,2 mm, lunghezza 10 cm</td></tr><tr><td>spazzola</td><td>Winsor & Newton</td><td>University Serie 233, spazzola</td><td>rotonda con manico rotondo misura 0, disponibile da Amazon</td></tr><tr><td>Bruciatore bunsen</td> Telecamera <td>Fisher</td><td></td><td></td></tr><tr><td>per la visualizzazione di micropipette</td><td>Olympus</td><td>OLY-150</td><td>richiede monitor, filtro IR sull'illuminatore del sottostadio è un</td></tr><tr><td>registratore</td><td></td><td></td> <td>grafico opzionaleregistrare in continuo le tensioni su microelettrodi iono-selettivi durante la calibrazione negli standard di tetrametilammonio e durante l'esperimento RTI; ad esempio Kipp & Zonen tipo BD112 grafico a doppio cannello registrato, disponibile</td></tr><tr><td>clorotrimetilsilano ricondizionato, puriss., > 99%</td><td>Catalogo Sigma-Aldrich</td><td># 92360</td><td>per silanizzazione; ATTENZIONE: infiammabile, tossicità acuta (orale, cutanea, per inalazione), corrosione della pelle, danni agli occhi, reagisce violentemente con l'acqua, vedere le Informazioni sulla sicurezza Sigma-Aldrich per la descrizione completa</td></tr><tr><td>Software commerciale</td><td>The MathWorks</td><td>MATLAB, Data acquisition toolbox</td><td>per l'acquisizione e l'analisi dei dati utilizzando i programmi Wanda e Walter. Si noti che è disponibile una licenza accademica.</td></tr><tr><td>occhiali protettivi per gli occhi Microscopio</td> composto <td>a</td> stadio fisso Fisher <td></td><td></td></tr><tr><td></td><td>Olympus</td><td>BX51WI</td><td>può utilizzare altri microscopi composti con pinze a stadi fissi</td></tr><tr><td></td><td>Fine Science Tools</td><td>#11251-10</td><td>per chippare il capillare di vetro; Dumond #5, preferibilmente utilizzato e non più necessario per il lavoro fine</td></tr><tr><td>cappa aspirante</td><td></td><td></td><td>per la silanizzazione e il riempimento della punta del cilindro iono-selettivo con scambiatore di ioni liquido; vari fornitori, ad es Captair con filtro appropriato venduto da Erlab</td></tr><tr><td>vetrino per microscopio</td><td>Fisher</td><td>#12-550A</td><td>per chippare le punte dei microelettrodi</td></tr><tr><td>riscaldatore/agitatore</td><td>Fisher</td><td>Corning PC-420D</td><td>per preparare gel di agarosio diluito e soluzioni di agitazione</td></tr><tr><td>unità ionoforetica</td><td>Dagan</td><td>ION-100 e PS-100</td><td>ION-100 è un'unità di ionoforesi a canale singolo +/- 130 V compliance; PS-100 è un alimentatore esterno; alternative: es. Axoprobe-1A prodotto da Axon Instruments (ora Molecular Devices), fuori produzione, verifica la disponibilità di unità ricondizionate (eBay e altri siti)</td></tr><tr><td>scambiatore di ioni liquidi (LIX) per tetrametilammonio</td><td>World Precision Instruments</td><td>IE190 Potassium Ion Exchanger</td><td>Nota: questo è equivalente allo scambiatore di potassio originale Corning 477317 basato su tetrafenlyborate - non confondere con lo scambiatore di potassio con vettore neutro proveniente dal laboratorio del Dr. Simon, ETH, Zurigo, che non rileva il tetrametilammonio, ed è venduto da Fluka. È anche possibile realizzare da soli uno scambiatore di ioni liquidi per tetrametilammonio: 3% in peso di tetrakis di potassio = (p-clorofenil) borato disciolto in 2,3-dimetilnitrobenzene. Acquista prodotti chimici da Fluka (ora parte di Sigma). Vedi Oehme e Simon (1976) Anal. Chim. Atti 86: 21-25; ATTENZIONE: Le proprietà tossicologiche di questo scambiatore di ioni liquidi non sono state completamente determinate. L'ingestione o il contatto con il corpo umano possono essere dannosi. Prestare la dovuta attenzione! Gli scambiatori di ioni liquidi devono essere conservati in un luogo fresco, al riparo dalla luce solare diretta.</td></tr><tr><td>porta microelettrodo</td><td>WPI M3301EH</td><td></td><td>per contenere prefabbricato microelettrodo iono-selettivo per la silanizzazione e il riempimento della punta del barilotto iono-selettivo con scambiatore di ioni liquido; WPI vende due versioni di questo supporto, M3301EH trasparente e M3301EH nero. Nella nostra esperienza, il M3301EH chiaro sembra essere più robusto del M3301EH nero.</td></tr><tr><td>micromanipolatore</td><td>Narishige</td><td>MM-3</td><td>per posizionare il microelettrodo iono-selettivo prefabbricato durante la silanizzazione e il riempimento della punta del barilotto iono-selettivo con scambiatore di ioni liquido; può essere sostituito con qualsiasi micromanipolatore a tre assi in buone condizioni di lavoro</td></tr><tr><td>estrattore per micropipette</td><td>Sutter Instruments</td><td>Modello P-97</td><td>per tirare tubi di vetro a doppia canna; altri estrattori possono essere utilizzati purché possano ospitare</td></tr><tr><td>un termometro a microsonda</td> con tubi di vetro a doppio cilindro di grande diametro <td>Physiotemp</td><td>Modello BAT-12R</td><td>la sonda fine di questo termometro è posizionata vicino all'ago del sito di registrazione</td></tr><tr><td></td><td></td><td>Siringhe BD e aghi # 305122 (calibro 25)</td> <td>per la silanizzazione; Aghi BD PrecisionGlide 25 G x 5/8 pollici (0,5 mm x 16 mm)</td></tr> <tr><td>obiettivo 5X asciutto</td><td>Olympus</td><td>MPlan N</td><td></td></tr><tr><td>10X immersione in acqua L'obiettivo</td><td>Olympus</td><td>UMPlan FL N</td><td>10X è a immersione in acqua, l'apertura numerica è 0,3, la distanza di lavoro è di 3,3 mm</td></tr><tr>contenitori<td>di plastica (con coperchi)</td><td>Fisher</td><td>#14-375-148</td><td>per conservare soluzioni standard di tetrametilammonio e microelettrodi</td></tr><tr><td>piattaforma e tavolino di traslazione x-y per microscopio a tavolino fisso</td><td>EXFO</td><td>Gibraltar Burleigh</td><td>la piattaforma contiene la camera a fette, i micromanipolatori e gli accessori, il tavolino traslazionale x-y muove il microscopio senza compromettere la stabilità di registrazione</td></tr><tr><td>minicoppa</td><td></td><td></td><td>porosa per misure RTI in un gel di agarosio diluito; adesivo riutilizzabile fatto in casa</td></tr><tr><td></td><td>Bostik</td><td>Blu-Tack</td><td>per fissare i microelettrodi al recipiente di contenimento e per altri usi; vari fornitori, disponibili da Amazon</td></tr><tr><td>Micromanipolatore robotico con posizionamento preciso x, y, z</td><td>Sutter Instruments</td><td>MP-285</td><td>Sono necessari due micromanipolatori per tenere separati il microelettrodo iono-selettivo e il microelettrodo ionoforetico. È anche possibile incollare micropipette in una matrice distanziata (vedi testo).</td></tr><tr><td></td><td>Axon Instruments</td><td>CyberAmp 320 o 380</td><td>non è più disponibile presso il produttore, ma potrebbe essere disponibile presso E-Bay; alternative: ad es FLA-01 Filter/Amplifier di Cygnus Technology. Si tratta di uno strumento a canale singolo con un taglio minimo a 10 Hz che utilizza un filtro Bessel multipolare, ma l'azienda potrebbe essere disposta a modificarlo per una frequenza di taglio più bassa (2 Hz), se necessario.</td></tr><tr><td>filo d'argento</td><td>A-M Systems</td><td>#7830</td><td>diametro 0,015", camera a fette nuda (senza rivestimento)</td></tr> <tr><td></td><td>Apparato</td><td>Warner Modello RC-27L</td><td>si tratta di una camera a fette a immersione; non utilizzare</td></tr><tr><td>lo stereomicroscopio</td><td></td><td></td> a camera <td>a fette di interfaccia per la silanizzazione e il riempimento della punta del barilotto iono-selettivo con scambiatore di ioni liquidi; montato orizzontalmente;</td></tr><tr><td>siringa di vari fornitori, 10 mL</td><td></td><td>Siringhe e aghi BD #309604</td><td>per il riempimento di microelettrodi e per la silanizzazione; BD Filtro per siringa con punta Luer-Lok</td></tr><tr><td>0,22 & micro; m pore</td><td>Whatman</td><td>#6780-1302</td><td>per filtrare soluzioni di riempimento; disponibile da</td></tr><tr><td>Fisher ago per siringa, calibro 28, 97 mm</td><td>World Precision Instruments</td><td>MicroFil MF28G-5</td><td>per microelettrodi di riempimento</td></tr><tr><td>Tubo in teflon (=PTFE)</td><td>Fornitura di componenti</td><td>STT-28 Tubo in PTFE parete leggera (calibro 28)</td><td>per la silanizzazione di cilindri iono-selettivi; si adatta agli aghi BD PrecisionGlide 25 G x 5/8 pollici. Nota: il teflon è essenziale, il tubo in PVC si scioglierebbe con la cera calda.</td></tr><tr><td>sistema di controllo della temperatura</td><td>Harvard Apparatus</td><td>Warner Modelli TC-344B e SH-27A</td><td>TC-344B è un doppio regolatore di temperatura automatico, SH-27A è un riscaldatore in linea; il controller e il riscaldatore funzionano con le camere a fette Warner</td></tr><tr><td>tetrametiammonio (TMA) cloruro</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T-3411</td><td>5 M soluzione; ATTENZIONE: tossicità acuta (orale, cutanea, per inalazione), cancerogenicità, pericoloso per l'ambiente acquatico, vedere le informazioni sulla sicurezza Sigma-Aldrich per la descrizione completa</td></tr><tr><td>del microtomo a lama vibrante</td><td>Leica</td><td>VT1000S</td><td>per tagliare fette di cervello</td></tr><tr><td>xileni</td><td>Fisher</td><td>X5-1</td><td>per silanizzazione; ATTENZIONE: infiammabile, tossicità acuta (orale, cutanea, per inalazione), corrosione della pelle, danni agli occhi, cancerogenicità, vedere le Informazioni sulla sicurezza Fisher per la descrizione completa</td></tr></tbody></table>

iontoforesi in tempo reale con tetrametilammonio per quantificare la frazione del volume e la tortuosità dello spazio extracellulare del cervello

Real-time Iontophoresis with Tetramethylammonium to Quantify Volume Fraction and Tortuosity of Brain Extracellular Space

Questa revisione descrive i concetti base e il protocollo per eseguire il metodo in tempo reale di iontoforesi (RTI), lo standard oro per esplorare e quantificare lo spazio extracellulare (ECS) del cervello vivente. L&#39;ECS circonda tutte le cellule del cervello e contiene sia il liquido interstiziale che la matrice extracellulare. Il trasporto di molte sostanze necessarie per l&#39;attività cerebrale, compresi i neurotrasmettitori, gli ormoni e le sostanze nutritive, avviene per diffusione attraverso la ECS. Le variazioni del volume e della geometria di questo spazio si verificano durante i processi normali del cervello, come il sonno e le condizioni patologiche, come l&#39;ischemia. Tuttavia, la struttura e la regolazione della ECS cerebrale, in particolare negli stati malati, rimangono in gran parte inesplorati. Il metodo RTI misura due parametri fisici del cervello vivente: frazione di volume e tortuosità. La frazione di volume è la proporzione del volume di tessuto occupata da ECS. Tortuosità è una misura della relativa impedenza che una sostanza incontra quando si diffonde attraverso un cervelloGion rispetto ad un mezzo senza ostruzioni. In RTI, una molecola inerte viene pulsata da un microelettrodo di origine nel cervello ECS. Mentre le molecole si diffondono da questa sorgente, la variabile concentrazione dello ione viene misurata nel tempo utilizzando un microelettrodo ionico selettivo posizionato a circa 100 μm di distanza. Dalla curva di diffusione risultante, è possibile calcolare sia la frazione di volume sia la tortuosità. Questa tecnica è stata utilizzata in fette cerebrali di molteplici specie (compresi gli esseri umani) e in vivo per studiare cambiamenti acuti e cronici a ECS. A differenza di altri metodi, RTI può essere utilizzato per esaminare sia cambiamenti reversibili che irreversibili nel cervello ECS in tempo reale.

L&#39;utilità della tecnica RTI è dimostrata in un esperimento progettato per misurare i cambiamenti in α e durante una sfida ipoosmolare ( Figura 8 e Figura 9 ). È stato precedentemente dimostrato che ridurre l&#39;osmolarità del ECS mediante lavaggio su ACSF ipotonico produrrà una diminuzione di α e un aumento di λ 13 . <p class="jove_content" fo:keep-together.within-page=...

Questo protocollo descrive la iontoforesi in tempo reale, un metodo che misura i parametri fisici dello spazio extracellulare (ECS) dei cervelli viventi. La diffusione di una molecola inerte rilasciata nell&#39;ECS viene usata per calcolare la frazione del volume ECS e la tortuosità. È ideale per studiare cambiamenti reversibili acuti al cervello ECS.

Iontoforesi in tempo reale con tetrametilammonio per quantificare la frazione del volume e la tortuosità dello spazio extracellulare del cervello

This review describes the basic concepts and protocol to perform the real-time iontophoresis (RTI) method, the gold-standard to explore and quantify the ...

L'obiettivo generale di questa procedura è quantificare la frazione di volume e la tortuosità dello spazio extracellulare nel tessuto cerebrale. Questo metodo risponde a domande chiave riguardanti la relazione tra lo spazio extracellulare e la fisiologia e la malattia. Il vantaggio principale di questa tecnica è che permette la caratterizzazione in tempo reale di due importanti parametri dello spazio extracellulare.In generale, gli individui che non conoscono questo metodo avranno difficoltà perché il microelettrodo ionoforetico mostra una tendenza a modificare le sue proprietà durante gli esperimenti e spesso richiede la risoluzione dei problemi durante gli esperimenti. La dimostrazione visiva di questo metodo è fondamentale in quanto per ottenere una registrazione di successo è necessaria la manipolazione precisa di un microelettrodo iono-selettivo, un elettrodo ionoforetico su più passaggi. Per iniziare questa procedura, eseguire ACSF contenente tetrametilammonio, o TMA, attraverso la camera di immersione a due millilitri al minuto.Impostare il regolatore di temperatura alla temperatura desiderata e far bollire l'ACSF con il 95% di ossigeno e il 5% di anidride carbonica per tutta la durata dell'esperimento. Quindi, montare l'elettrodo di terra su un supporto e immergere la punta nell'ACSF che attraversa la camera di immersione. Quindi, riempire la tazza porosa con lo 0,3% di agarosio contenente TMA preparata in precedenza e posizionarla nella camera di immersione.A questo punto, fissare un microelettrodo per ionoforesi al supporto della pipetta di un micromanipolatore. Collegare il filo del microelettrodo per ionoforesi allo stadio principale dell'unità di ionoforesi. Quindi, fissare un ISM calibrato al secondo micromanipolatore e collegare l'ISM ai suoi stadi principali.Successivamente, accendi il computer contenente i programmi Wanda e Walter. Nell'interfaccia utente di Wanda, fare clic su Calibra. Quindi, nella casella Calibrazione, inserire le tensioni misurate durante la calibrazione ISM e fare clic su Fit Data (Dati di adattamento).Successivamente, fare clic su Accetta nella casella Calibra per trasferire automaticamente la pendenza e l'interferenza generate alla GUI principale. Sul lato sinistro della GUI, assicurarsi che tutti i parametri sperimentali siano impostati nelle voci corrispondenti. Quindi, posizionare una sonda di temperatura nella tazza dell'agar.Registrare la temperatura misurata nella voce Temperatura nella casella dell'elettrodo di misura della GUI. Quindi, abbassare i microelettrodi ad almeno 1.000 micrometri di profondità nell'agarosio e centrarli nella coppa. Visualizzali al microscopio utilizzando un obiettivo 10X.Sull'amplificatore a due canali, spostare manualmente il connettore del canale ISM sull'uscita di sottrazione di tensione per impostare la sottrazione tra i canali di riferimento e ISM. Centrare le punte l'una sull'altra su tutti e tre gli assi direzionali. Successivamente, azzerare le posizioni relative di entrambi i microelettrodi sulle scatole di controllo del micromanipolatore e assicurarsi che i microelettrodi siano centrati in modo accurato e preciso.Quindi, allontanare l'ISM di 120 micrometri dal microelettrodo per ionoforesi su un asse. Successivamente, avviare una registrazione facendo clic su Acquisisci nella GUI e consentire l'esecuzione del programma per una registrazione completa. In questa procedura, aprire il programma Walter sul computer.Nel menu Zero record da, fare clic sul pulsante Wanda Voltoro per leggere i record generati da Wanda. Nella finestra popup successiva, selezionare uno o più record da leggere e fare clic su Apri. Nel menu One Write Excel, fare clic su Foglio 1.3 e seguire le istruzioni visualizzate fino a quando i record non vengono automaticamente rappresentati graficamente.Per iniziare la procedura di montaggio, nel menu Due Opzioni, fare clic sul pulsante di selezione della registrazione. Quindi, nella finestra popup della figura due, utilizzare il mouse per spostare il mirino sul primo record da elaborare e premere uno dei pulsanti del mouse per scegliere il record. Successivamente, fare clic su Adatta curva nel menu e utilizzare almeno 20 iterazioni di adattamento per ottenere un adattamento accurato dei dati.Quindi, seleziona tutto per adattare tutti i punti dati e seleziona continua. Il programma si adatta alla curva visualizzata. Quindi, seleziona l'opzione per scrivere il risultato nel programma di foglio di calcolo appropriato facendo clic su Excel nel menu dei sette risultati.Assegna un nome al file Excel. Annotare e registrare i dati generati che verranno utilizzati per determinare la funzionalità del microelettrodo per ionoforesi. Se il microelettrodo per ionoforesi è ritenuto adatto per l'esperimento, registrare il numero medio di trasporto di tutte le prove nel campo finale TransportNum nell'interfaccia grafica Wanda.In questa procedura, posizionare una fetta di cervello spessa 400 micrometri nella camera di registrazione assicurandosi che sia completamente immersa nell'ACSF che scorre. Quindi, spostare sia il microelettrodo della ionoforesi che l'ISM sopra il campo di interesse sulla fetta cerebrale. Immergere entrambi gli elettrodi nell'ACSF che scorre, ma sopra la fetta.Quindi, sfalsare la tensione sia per il canale di riferimento che per quello di rilevamento ionico a zero millivolt. Attendere che la tensione in entrambi i canali si stabilizzi. Sul registratore grafico, contrassegnare la tensione misurata sul canale di rilevamento ionico dell'ISM.Quindi, posizionare i microelettrodi ISM e ionoforesi a 200 micrometri di profondità nella fetta e a 120 micrometri di distanza l'uno dall'altro. Calcolare la differenza di tensione tra i segnali TMA misurati nell'ACSF in flusso e nel cervello e inserire questo valore nel campo Baseline Volt Millivolt nella scatola dell'elettrodo di misura dell'interfaccia grafica Wanda. Sul lato sinistro della GUI, assicurarsi che tutti i parametri sperimentali siano stati inseriti correttamente.Avvia la registrazione facendo clic su Acquisisci e consentigli di eseguire una registrazione completa. Dopo aver spostato entrambi i microelettrodi fuori dalla fetta, utilizzare il registratore grafico per determinare qualsiasi variazione tra la tensione misurata ora e la sua misurazione precedente. Per analizzare le registrazioni dal cervello, ripetere le procedure per l'analisi dei dati di agarosio utilizzando il programma Walter.Scrivere i dati nel foglio di calcolo facendo clic su Excel nel menu Walter. Quindi, registrare la frazione di volume del SEC cerebrale, la tortuosità del SEC cerebrale e la clearance non specifica. Per verificare il numero di trasporto, effettuare nuove registrazioni in agarosio e ripetere le procedure del programma Walter per ottenere il numero di trasporto.Ispeziona il foglio di calcolo e controlla se il numero di trasporto è cambiato di oltre il 10% rispetto al numero di trasporto ottenuto prima delle misurazioni del cervello. In tal caso, i dati ottenuti con il microelettrodo ionoforetico non sono affidabili. Il numero di trasporto misurato in questa fase deve corrispondere strettamente a quello ottenuto prima delle misurazioni cerebrali, altrimenti la frazione di volume non può essere considerata accurata.Utilizzare i dati di taratura ISM appena ottenuti come input nella casella Calibrazione Wanda e verificare che il valore della pendenza differisca di meno del 10% dalla taratura precedente. Di seguito sono riportati i dati rappresentativi di un singolo studio ottenuto in agar che dimostra la curva di concentrazione della TMA. E questa è una curva adattata ottenuta dall'elaborazione dei dati in Walter.La sovrapposizione dei dati nella curva adattata dimostra che l'adattamento della curva fatto da Walter modella accuratamente la diffusione in questa prova. Ecco la tabella delle misurazioni dell'agar prima della sperimentazione nel cervello. Ecco un riassunto delle misurazioni effettuate in una fetta di cervello di topo in condizioni di controllo e sperimentali.L'alfa diminuiva durante una sfida ipoosmolare mentre la tortuosità aumentava come previsto. L'alfa ha superato i valori di controllo nelle condizioni di recupero. Ed ecco la tabella delle misure di agra dopo la sperimentazione nel cervello.I numeri medi di trasporto prima e dopo l'esperimento erano entro il 10% l'uno dall'altro, il che indica che i valori registrati nel cervello erano affidabili. Una volta padroneggiata, questa procedura può essere eseguita in 14 ore in due giorni. Il primo giorno, gli ISM vengono fabbricati e calibrati.Il secondo giorno, gli ISM vengono ricalibrati e viene eseguita la ionoforesi in tempo reale. Durante il tentativo di questa procedura, è importante prima essere precisi nella spaziatura degli elettrodi. In secondo luogo, è importante accettare un esperimento solo se il numero di trasporto del microelettrodo ionoforetico rimane stabile per tutto il corso dell'esperimento.Seguendo questa procedura, che caratterizza la diffusione di piccoli cationi nello spazio extracellulare, si può passare all'esecuzione di altre tecniche come il metodo di imaging ottico integrativo che permette di rispondere alla domanda su come si muovono le micromolecole di grandi dimensioni nello spazio extracellulare. Dopo aver visto questo video, dovresti avere una buona comprensione di come eseguire il metodo della ionoforesi in tempo reale per quantificare il volume dello spazio extracellulare del cervello e la tortuosità nel cervello vivente in salute e malattia. Grazie per aver guardato e buona fortuna con i tuoi esperimenti.

real-time-iontophoresis-with-tetramethylammonium-to-quantify-volume

Research

Ricerca

JoVE Journal

Neuroscience

Neuroscienze

Il video mostra la dinamica della concentrazione di ioni potassio evocata sulla stimolazione elettrica di fette di cervello ippocampale coronale di topo. Un elettrodo stimolante bipolare viene inserito nello strato radio della regione CA3 nell'ippocampo e un elettrodo selettivo per ioni potassio viene posizionato nello strato CA1 radio. La stimolazione elettrica provoca un potenziale d'azione, con conseguente rilascio di ioni potassio. Infine, la mancanza di risposta evocata dello ione potassio...

Misurazione della dinamica della concentrazione di ioni potassio evocati nelle fette di ippocampo coronale

Questo video dimostra come caratterizzare lo spazio extracellulare in una fetta di cervello utilizzando microelettrodi iono-selettivi e ionoforesi per misurare e confrontare i segnali elettrici. Questo processo aiuta a determinare la frazione di volume dello spazio e il grado di torsione.

Caratterizzazione dello spazio extracellulare in una fetta di cervello utilizzando microelettrodi iono-selettivi e ionoforesi

Fonte: Moye, S. L., et.al.  Visualizzazione della morfologia degli astrociti utilizzando la ionoforesi gialla di Lucifero. J. Vis. Exp. (2019).  Questo video dimostra l'uso della ionoforesi con colorante fluorescente per studiare la morfologia degli astrociti in fette di cervello fisse. Descrive in dettaglio la perforazione del soma degli astrociti con un elettrodo per rilasciare un colorante anionico e idrofilo nel citoplasma sotto una corrente a bassa tensione, consentendo al colorante di...

Visualizzazione della morfologia degli astrociti utilizzando la ionoforesi con colorante fluorescente in una fetta di cervello di topo fissa

In questo articolo introduciamo veloce micro-ionoforesi di neurotrasmettitori come tecnica per studiare l'integrazione di segnali post-sinaptici con elevata precisione spaziale e temporale.

Veloce micro-ionoforesi di glutammato e GABA: un utile strumento per indagare l&#39;integrazione Synaptic

Dimostriamo la fabbricazione, la calibrazione e le proprietà di due tipi di microelettrodi iono-selettivi (a doppio cilindro e concentrici) per la misurazione delle concentrazioni di ioni nel tessuto cerebrale. Questi vengono poi utilizzati nella preparazione della fetta di ippocampo di topo per dimostrare che l'attività eccitatoria cambia sia le concentrazioni extracellulari di potassio che di sodio.

Microelettrodi doppia canna e concentrico per la misurazione di extracellulare Ion Segnali in tessuto cerebrale

Presentiamo metodi per la costruzione di elettrodi per registrare simultaneamente l'attività neurale extracellulare e rilasciare più sostanze neuroattive in prossimità dei siti di registrazione nei topi svegli. Questa tecnica consente l'analisi dettagliata di input sinaptici locali putativi al neurone di interesse.

Extracellulare La registrazione di un neurone attività combinata con Microiontophoretic applicazione di sostanze neuroattivi nei topi Awake

Qui, descriviamo un metodo per microdialisi in vivo analizzare il rilascio del glutammato e aspartato nell'ippocampo ventrale dei ratti epilettici e non-epilettici, in combinazione con le registrazioni di EEG. Concentrazioni extracellulari di aspartato e glutammato possono essere correlate con le diverse fasi della malattia.

Microdialisi degli aminoacidi eccitanti durante le registrazioni di EEG in liberi di muoversi

Questo articolo viene descritto un metodo semplice per preparare piccoli cervelli animali per l'imaging di micro-CT, in quale le lesioni possono essere quantificate ed elettrodi che si trova con alta precisione nel contesto dell'intero cervello.

Un metodo basati su Micro-CT per la caratterizzazione di lesioni e posizionamento elettrodi nel cervello degli animali piccoli

Gli astrociti sono cellule morfologicamente complesse, esemplificate dai loro molteplici processi e territori cespugliosi. Per analizzare la loro morfologia elaborata, presentiamo un protocollo affidabile per eseguire iontoforesi gialla di Lucifero intracellulare in tessuto leggermente fissato.

Visualizzazione della morfologia degli astrociti utilizzando Lucifero Giallo Iontoresis

Questo protocollo descrive le procedure chirurgiche e tecniche che consentono l'imaging a fluorescenza multifotonica in vivo in tempo reale del cervello dei roditori durante i trattamenti a ultrasuoni e microbolle focalizzati per aumentare la permeabilità della barriera emato-encefalica.

Microscopia multifotonica intravitale in tempo reale per visualizzare trattamenti a ultrasuoni e microbolle focalizzati per aumentare la permeabilità della barriera emato-encefalica

Descriviamo un protocollo per la valutazione delle curve dose-risposta per la stimolazione extracranica in termini di misurazioni del campo elettrico cerebrale e di un rilevante biomarcatore-flusso sanguigno cerebrale. Poiché questo protocollo prevede il posizionamento invasivo di elettrodi nel cervello, è necessaria l'anestesia generale, con la respirazione spontanea preferita alla respirazione controllata.

Posizionamento di elettrodi stimolanti extracranici e misurazione del flusso sanguigno cerebrale e dei campi elettrici intracranici in topi anestetizzati

Impara l'iontoforesi in tempo reale con tetrametilammonio per quantificare la frazione del volume e la tortuosità dello spazio extracellulare cerebrale. Questo metodo consente la caratterizzazione in tempo reale dei parametri ECS nel tessuto cerebrale vivo.

Iontoforesi in tempo reale con tetrametilammonio per quantificare la frazione del volume e la tortuosità dello spazio extracellulare del cervello (Video) | JoVE Journal

Iontoforesi in tempo reale con tetrametilammonio per quantificare la frazione del volume e la tortuosità dello spazio extracellulare del cervello

Esplora altri video