In Vitro Differenziazione delle cellule staminali mesenchimali umane in funzionale del Cardiomyocyte-come le cellule

L'obiettivo generale di questa procedura sperimentale è quello di indurre e osservare l'induzione cardiomiogenica di cellule staminali mesenchimali. Questo metodo può aiutare a rispondere a domande chiave nel campo delle cellule staminali mesenchimali, come ad esempio, quali rimedi possono essere indotti da segnali ambientali per generare cardiomiociti funzionali. Il vantaggio principale di questa tecnica è che applica la formazione di aggregati e strati fetali cardiaci, invece di agenti farmacologici o materiale genetico.

Le implicazioni di questa tecnica si estendono alla terapia delle malattie cardiovascolari perché elabora il potenziale cardiomiogenico delle cellule staminali mesenchimali. A dimostrare questa procedura con me saranno la signorina Farwah Iqbal, una dottoranda del nostro laboratorio, Max Librach e Nadav Gasner, entrambi tirocinanti del nostro laboratorio. Dopo aver isolato le parti del cucciolo di ratto secondo il protocollo di testo, tagliare i ventricoli a metà e trasferirli in un piatto di 10 centimetri con 10 millilitri di PBS e gessare su ghiaccio, per far uscire il sangue.

Quindi, usando le forbici curve, taglia le pareti ventricolari in piccoli pezzi con un diametro di due o tre millimetri. Utilizzando una pipetta sierologica, trasferire i pezzi di cuore da 10 a 12 animali in una provetta da 50 millilitri e lasciarli riposare. Rimuovi il più possibile il PBS P/S, senza rimuovere alcun pezzo di cuore.

Quindi aggiungere 10 millimetri di PBS P/S fresco. Per isolare i cardiomiociti, dopo che i pezzi di cuore si sono depositati, utilizzare lo 0,15% di tripsina nel PBS, per sostituire il PBS P/S e incubare il tessuto a 37 gradi Celsius con agitazione, per 10 minuti. Scartare il surnatante.

Quindi, ripetere la digestione della tripsina altre tre volte, ad eccezione dei surnatanti del decanter in provette di raccolta da 50 millilitri contenenti 10 millilitri di FBS al 100%. Quindi, centrifugare le provette delle cellule e aspirare il surnatante. Quindi utilizzare DMEM-F12 con il 10% di FBS e l'1% di P/S per risospendere le cellule e seminarle su una piastra a sei pozzetti.

Una volta che le cellule si sono attaccate, sostituire il terreno con due millilitri di terreno fresco. Per preparare le MSC pre-colorate, rimuovere il terreno dalle colture di MSC che hanno raggiunto il 70%-80% di confluenza in piastre di 10 centimetri e aggiungere tre millilitri di soluzione di dissociazione cellulare. Incubare i piatti a 37 gradi Celsius e 5% di anidride carbonica per cinque minuti.

Trasferire le cellule dissociate in una provetta da 15 millilitri e centrifugare a 400 x G per cinque minuti. Aspirare il surnatante senza interrompere il pellet cellulare e risospendere le cellule. Quindi utilizzare un contatore di celle automatizzato per contare le cellule.

Diluire le cellule a una concentrazione di 1 x 10 al sesto MSC per millilitro, in DMEM-F12 contenente il 10% di FBS e l'1% di P/S. Quindi, alle cellule in provette da centrifuga da 1,5 millilitri, aggiungere un colorante fluorescente vitale e non trasferibile e incubare le MSC per mezz'ora. Dopo aver centrifugato le provette a 400 x G per cinque minuti, aspirare il surnatante e risospendere il pellet a una concentrazione di 1 x 10 al sesto MSC per millilitro.

Quindi trasferire le MSC sui cardiomiociti a una concentrazione di 10 x 10 fino alla quarta cellula per pozzetto della piastra a sei pozzetti. Per effettuare co-colture aggregate, preparare una sospensione cellulare singola di MSC in alfa MEM, integrata con un 10% di FBS e 1% P/S. Avviare la formazione dell'aggregato, posizionando 25 gocce da microlitro di sospensione cellulare sulla superficie interna dei coperchi di piastre di coltura tissutale da 10 centimetri.

Posizionare i coperchi sulle loro controparti inferiori contenenti PBS P/S. Incubare le piastre a 37 gradi Celsius e 5% di anidride carbonica. Al microscopio stereoscopico, osservare la formazione di aggregati nelle gocce dopo tre giorni.

Se oltre l'80% delle gocce conteneva aggregati formati, utilizzare una micropipetta da un millilitro per raccogliere le gocce dai coperchi e trasferire gli aggregati direttamente su monostrati primari di cardiomiociti di ratto. Incubare le co-colture aggregate per un massimo di due settimane. Cambio del volume completo del fluido ogni 72 ore.

Su base giornaliera, utilizzare la microscopia a campo chiaro per osservare gli aggregati che si attaccano agli strati di cellule fetali. Registra gli aggregati di contrattazione quando osservati. Gli aggregati attivi si contraggono in modo sincronizzato, suggeriamo una conduttanza tra di loro in tutto lo strato fetale, che non ha attività fisica.

Aspirare il terreno e aggiungere due millilitri di PBS per pozzetto del piatto a sei pozzetti. Quindi rimuovere il PBS e aggiungere due millilitri di soluzione di dissociazione per pozzetto. Incubare le piastre a 37 gradi Celsius e 5% di anidride carbonica per tre minuti.

Come mostrato qui, gli HMSC di tre diversi tipi hanno mostrato abbondanza e aspetto simili nelle co-colture dirette. Due o tre giorni dopo il trasferimento di gocce sospese su cellule cardiache in co-colture aggregate, FTM e PBC a termine sono apparsi in aggregati più grandi rispetto a quelli osservati dalle BMSC. In questo esperimento, l'analisi citofluorimetrica dell'espressione di CD49F in MSC indifferenziate ha mostrato che il 96% delle PBC di FTM huck, denominate 89% delle PBC di huck e il 53% delle BMSC, erano positive per la superficie cellulare CD49F.

citometria a flusso su TRA ha vinto 85 cellule, ha mostrato l'upregolazione del marcatore associato ai cardiomiociti, SIRPA nelle PBC di FTM huck e nelle PBC di huck a termine, ma non nelle BMSC da co-colture dirette di cardiomiociti. Come si vede qui, l'upregulation di cx43 era significativamente più alta nelle PBC di FTM huck rispetto alle PBC di term huck o nelle BMSC nelle co-colture dirette. L'analisi al microscopio a fluorescenza ha rivelato che la differenziazione di FTM e PBC a termine huck, entrambi sovraregolati cx43.

Con il termine huck PBC a una porzione più alta rispetto agli FTM. Tuttavia, la microscopia a fluorescenza ha rivelato che i punti cx43 positivi sono stati osservati nella membrana cellulare delle PBC di FTM huck ed erano prevalentemente citoplasmatici nelle cellule a termine. Infine, come si vede qui, la microscopia a fluorescenza ad alto ingrandimento è stata eseguita su cellule umane selezionate, dopo co-coltura ed è stata confermata l'elevata abbondanza di cx43 nella membrana plasmatica.

Una volta padroneggiati, i passaggi chiave di questa procedura possono essere eseguiti in un'ora ciascuno, se eseguiti correttamente. Quando si tenta questa procedura, è importante mantenere precauzioni asettiche. Tessuti animali primari coinvolti che, se non gestiti correttamente, possono introdurre contaminazione.

Seguendo questa procedura, è possibile eseguire altri metodi, come l'ulteriore coltura di aggregati contraenti, per rispondere a ulteriori domande, come la longevità di queste strutture. Dopo il suo sviluppo, questa tecnica consente ai ricercatori nel campo delle MSC di esplorare il potenziale di differenziazione delle fonti più giovani di cellule staminali mesenchimali, come i tessuti extraembrionali. Dopo aver visto questo video, dovresti avere una buona comprensione di come preparare aggregati di MSC e combinarli con strati fetali di tessuto primario diretto, in modo da fornire un'induzione adeguata per la differenziazione cardiomiogenica.

Non dimenticare che lavorare con BRDU può essere estremamente pericoloso e precauzioni come la corretta gestione dei rifiuti citotossici dovrebbero sempre essere prese durante l'esecuzione di questa procedura.