Name: In Vitro Differenziazione delle cellule staminali mesenchimali umane in funzionale del Cardiomyocyte-come le cellule (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-08-09T12:30:00.000+00:00
Duration: 9 min 5 s
Description: Scopri la differenziazione cardiomiogenica delle cellule staminali mesenchimali umane in vitro mediante segnali ambientali e formazione di aggregati. Questo metodo offre un'alternativa funzionale alle tecniche farmacologiche per la terapia delle malattie cardiovascolari.

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Gli autori ringraziare i seguenti membri del personale e personale per i loro contributi di ricerca: Matthew Librach, Leila Maghen, Tanya A. Baretto, Shlomit Kenigsberg e Andrée Gauthier-Fisher. Questo lavoro è stato supportato dal fondo di ricerca The Ontario - l'eccellenza della ricerca (ORF-RE, Round #7) e creare programma Inc.

Tutti gli studi sugli animali sono stati condotti e riportati secondo le linee guida ARRIVED48. Tutti gli studi sono stati condotti con l'approvazione del comitato etico della ricerca istituzionale (REB numero 454-2011, Sunnybrook Research Institute; REB 29889, Università di Toronto, Toronto, Canada). Tutte le procedure per gli animali sono state approvate dal Comitato per la cura degli animali della University Health Network (Toronto, Canada) e tutti gli animali hanno ricevuto cure umane in conformità con la Guida per la cura e l'uso degli animali da laboratorio, 8a edizione (National Institutes of Health 2011).
1. Coltura dei tessuti
<ol>
	<li>Coltura FTM HUCPVCs, termine HUCPVCs (precedentemente stabilito, n ≥ 3 linee indipendenti per ciascuna)42 e BMSC disponibili in commercio in terreno alfa-minimo essenziale (MEM) integrato con il 10% di siero fetale bovino (FBS) e un cocktail di penicillina/streptomicina (P/S) all'1%. Coltura di cardiomiociti primari di ratto e co-colture MSC-cardiomiociti nel terreno Eagle modificato di Dulbecco: miscela di nutrienti F-12 (DMEM-F12) contenente il 10% di FBS e l'1% di P/S. 
	NOTA: Sterilizzare il mezzo utilizzando un filtro da 0,2 μm. Conservare le soluzioni di terreno preparate a 4 °C per un massimo di 3 settimane.</li>
	<li>Mantenere le colture cellulari in incubatori umidificati (95% di umidità relativa, 37 °C e 5% di CO2) e il passaggio al 70-80% di confluenza, determinato mediante microscopia a contrasto di fase. Utilizzare volumi di terreno adeguati alle dimensioni della piastra di coltura tissutale utilizzata (ad esempio, 10 mL in una piastra da 10 cm e 2 mL per pozzetto in una piastra di coltura tissutale a 6 pozzetti). Utilizzare queste condizioni di cultura per la durata del protocollo.</li>
	<li>Dissociare i monostrati di MSC per il passaggio o l'instaurazione della co-coltura di MSC-cardiomiociti utilizzando una soluzione di enzima di dissociazione (2 mL/pozzetto in una piastra a 6 pozzetti) e incubare a 37 °C per 4 minuti.</li>
	<li>Trasferire le cellule dissociate in una provetta da 15 mL e centrifugare a 400 x g per 5 minuti.</li>
	<li>Aspirare il surnatante senza interrompere il pellet cellulare e risospendere le cellule in 1 mL di un terreno di coltura appropriato per il conteggio utilizzando un contatore di cellule automatizzato. Semina le celle come descritto nelle seguenti sezioni del protocollo.</li>
</ol>
2. Preparazione di co-colture primarie di cardiomiociti di ratto-MSC
<ol>
	<li>Ottenere il tessuto cardiaco per l'isolamento primario dei cardiomiociti.
	<ol>
		<li>Eutanasia dei cuccioli di ratto (5-6 giorni dopo la nascita) utilizzando l'asfissia da CO2. Impostare le camere di CO2 al 20% di sostituzione del gas (portata = 0,2 x volume della camera al minuto). Confermare l'exitus con l'assenza del riflesso di pizzicamento.</li>
		<li>Rimuovere gli atri con i principali vasi sanguigni di collegamento utilizzando strumenti sterilizzati (ad esempio, pinze e forbici curve)41. Trasferire i cuori in provette da 50 ml contenenti PBS sterile con 1% P/S (PBS-P/S) su ghiaccio.</li>
		<li>Tagliare i ventricoli a metà e lasciare che il sangue venga lavato in un piatto di 10 cm con 10 ml di PBS-P/S con ghiaccio. Tagliare le pareti ventricolari in piccoli pezzi (diametro = 2-3 mm) utilizzando le forbici curve.</li>
		<li>Trasferire i pezzi di cuore di 10-12 animali in una provetta da 50 ml utilizzando una pipetta sierologica e lasciarli riposare.</li>
		<li>Rimuovere quanto più PBS-P/S possibile senza rimuovere alcun pezzo di cuore. Aggiungere 10 mL di nuovo PBS-P/S.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Digerire il tessuto cardiaco per isolare i cardiomiociti.
	<ol>
		<li>Lascia che i pezzi del cuore si depositino. Sostituire il PBS-P/S con 10 mL di tripsina allo 0,15% in PBS e agitare a 37 °C per 10 minuti.</li>
		<li>Scartare il surnatante. Ripetere la digestione descritta al punto 2.2.1 altre tre volte, ma travasare i surnatanti in provette di raccolta da 50 mL contenenti 10 mL di FBS al 100%.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Centrifugare le cellule (400 x g, 5 min) e aspirare il surnatante. Risospendere le cellule in DMEM-F12 contenenti il 10% di FBS e l'1% di P/S e seminare su una piastra a 6 pozzetti (1 x 105 cellule/cm2, 2 mL di terreno per pozzetto).</li>
	<li>Dopo 1 ora, trasferire il terreno contenente le cellule non attaccate in una provetta da 50 ml ed eliminare le cellule attaccate. Contare le cellule in sospensione e ripiastarle in nuove piastre a 6 pozzetti (1 x 10,5 cellule/cm2, 2 mL di DMEM-F12 contenente il 10% di FBS e l'1% di P/S per pozzetto).</li>
	<li>Inibire la proliferazione cellulare con la bromodeossiuridina (BrdU). 
	Attenzione: BrdU è un forte teratogeno e sospetto mutageno. Assicurarsi che venga fornita una formazione adeguata e fare riferimento alla scheda di sicurezza prima dell'uso.
	<ol>
		<li>Una volta che le cellule si sono attaccate, sostituire il terreno nella piastra a 6 pozzetti con DMEM-F12 contenente il 10% di FBS, l'1% di P/S (2 mL di terreno per pozzetto) e 5 μM di BrdU. Incubare per 16 ore (37 °C, 5% CO2).</li>
		<li>Rimuovere il terreno contenente BrdU e sostituirlo con DMEM-F12 contenente il 10% di FBS e l'1% di P/S (2 mL di terreno per pozzetto).</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Preparare MSC pre-colorate.
	<ol>
		<li>Una volta che le colture di MSC hanno raggiunto la confluenza del 70-80% in piastre da 10 cm, rimuovere il terreno di coltura e aggiungere 3 mL di soluzione di dissociazione cellulare. Incubare la capsula a 37 °C e 5% di CO2 per 5 minuti.</li>
		<li>Trasferire le cellule dissociate in una provetta da 15 mL e centrifugare a 400 x g per 5 minuti.</li>
		<li>Aspirare il surnatante senza interrompere il pellet cellulare e risospendere le cellule in 1 mL di DMEM-F12 contenente il 10% di FBS e l'1% di P/S per il conteggio utilizzando un contatore di cellule automatizzato.</li>
		<li>Diluire le cellule a una concentrazione di 1 x 106 MSC/mL di DMEM-F12 contenente il 10% di FBS e l'1% di P/S.</li>
		<li>Incubare le MSC con un colorante fluorescente vitale e non trasferibile (5 μM, 30 min, 37 °C, 5% CO2) in provette da centrifuga da 1,5 mL per 1 ora.</li>
		<li>Centrifugare le provette a 400 x g per 5 minuti. Aspirare il surnatante e risospendere il pellet in DMEM-F12 contenente il 10% di FBS e l'1% di P/S per una concentrazione cellulare di 1 x 106 MSC/mL. Ripeti l'operazione per un totale di 3 volte.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Trasferire le MSC sui cardiomiociti (passaggio 2.5.2) a una concentrazione di 10 x 104 cellule per pozzetto della piastra a 6 pozzetti.</li>
</ol>
3. Preparazione di Co-culture Aggregate
<ol>
	<li>Preparare una sospensione unicellulare di MSC (2 x 10,4 cellule/mL di terreno, passaggio # ≤ 6) in alfa-MEM, addizionata con il 10% di FBS e l'1% di P/S (vedere il passaggio 2.6). 
	NOTA: Fare riferimento alla sezione 1 del protocollo per il passaggio delle celle. In alternativa, pre-colorare le MSC come indicato al punto 2.6.</li>
	<li>Avviare la formazione degli aggregati posizionando 25 μl di gocce di sospensione cellulare (500 cellule) sulla superficie interna dei coperchi di piastre di coltura tissutale da 10 cm (fino a 50 gocce per coperchio). Posizionare i coperchi sulle controparti inferiori contenenti PBS-P/S. Incubare a 37 °C e 5% CO2. 
	NOTA: Inserire 5-7 ml di PBS-P/S nel piatto di coltura sotto le gocce pendenti per evitare l'evaporazione delle gocce.</li>
	<li>Osservare la formazione di aggregati nelle gocce dopo 3 giorni utilizzando uno stereomicroscopio. Se più di 40 gocce su 50 contengono aggregati formati, raccogliere le gocce dai coperchi utilizzando una micropipetta da 1 ml e trasferire gli aggregati direttamente su monostrati primari di cardiomiociti di ratto (preparati nei passaggi 2.1-2.7; 10 gocce/pozzetto). Evitare il pipettaggio energico per preservare l'integrità dell'aggregato.</li>
	<li>Conservare le co-colture aggregate negli incubatori per un massimo di 2 settimane, cambiando l'intero volume del terreno (2 mL di DMEM-F12 contenente il 10% di FBS e l'1% di P/S per pozzetto) ogni 72 ore.
	<ol>
		<li>Osserviamo quotidianamente gli aggregati che si attaccano agli strati di cellule di alimentazione utilizzando la microscopia a campo chiaro. Registra gli aggregati di contrattazione quando osservati.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Preparare gli aggregati per l'analisi.
	<ol>
		<li>Rimuovere il terreno e aggiungere 2 mL di PBS per pozzetto di una piastra di coltura tissutale a 6 pozzetti. Rimuovere il PBS e aggiungere 2 mL di soluzione di dissociazione per pozzetto. Incubare per 3 minuti a 37 °C e 5% CO2.</li>
		<li>Centrifugare a 400 x g per 5 min fino ad ottenere un pellet di cella. Risospendere in terreno, come specificato per le applicazioni descritte nei passaggi successivi (vedere i passaggi 4.1, 5.1 e 6.1) e passare attraverso un filtro a celle da 70 μm.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
4. Citometria a flusso (FC) e selezione cellulare attivata da fluorescenza (FACS)
<ol>
	<li>Incubare sospensioni cellulari (1 x 105 cellule in 200 μl di PBS contenente il 3% di FBS) con anticorpi primari fluoroforo-coniugati (FITC o APC) (ad es. CD49f, Cx43, TRA-1-85, HLA-A, HLA-G e SIRPA per FC o TRA-1-85 per FACS; 1:40) a 4 °C per 30 minuti, al riparo dalla luce.</li>
	<li>Centrifugare (400 x g, 5 min) e risospendere le cellule in 1 mL di PBS con FBS al 3% per FC o PBS con FBS allo 0,5% per FACS. 
	NOTA: La FC delle MSC è stata ottimizzata da Hong et al.41.</li>
	<li>Mantenere le celle a 4 °C al buio fino a quando non sono pronte per essere analizzate da FC (almeno 1 x 104 eventi) o FACS. Ordina le celle come descritto41. Ripiastrella le cellule selezionate ad alta positività TRA-1-85 in piastre a 6 pozzetti (1 x 104 cellule/pozzetto, 2 mL di DMEM-F12 contenente il 10% di FBS e l'1% di P/S) entro 1 h. 
	NOTA: Per la strategia di gating dell'antigene di superficie cellulare umana TRA-1-85, vedere la figura supplementare.</li>
</ol>
5. Immunocitochimica (ICC) e microscopia
<ol>
	<li>Ri-placcare le sospensioni cellulari ottenute dalle co-colture (passaggio 3.5.2) o FACS (sezione 4) su vetrini da camera (1 x 104 cellule/pozzetto, 2 mL di DMEM-F12 contenente il 10% di FBS e l'1% di P/S per pozzetto). Lasciare che le cellule si attacchino per una notte in un incubatore per colture tissutali (vedere paragrafo 1 per le condizioni).</li>
	<li>Fissare le cellule utilizzando 3 mL di paraformaldeide (PFA) al 4% in PBS per 15 minuti a temperatura ambiente. Lavare 3 volte con 3 ml di PBS contenente l'1% di albumina sierica bovina (BSA; PBS-BSA) per 5 minuti per lavaggio. 
	Attenzione: Indossare dispositivi di protezione individuale adeguati quando si maneggiano PFA.</li>
	<li>Permeabilizzare le cellule in 3 mL di PBS-BSA con Triton X-100 allo 0,1%. Incubare a temperatura ambiente per 10 minuti per gli antigeni intracellulari (ad es. actinina alfa sarcomerica (aSarc) e Cx43) o 25 minuti per gli antigeni intranucleari (ad es. Mef2c e antigene nucleare umano (HuNu)). Lavare 3 volte con 3 ml di PBS-BSA per 5 minuti per lavaggio.</li>
	<li>Bloccare i campioni contro le reazioni anticorpali non specifiche con 3 mL di PBS contenente il 5% di siero di capra normale (NGS) e l'1% di BSA per 15 minuti a temperatura ambiente. Lavare 3 volte con 3 ml di PBS-BSA per 5 minuti per lavaggio.</li>
	<li>Incubare le cellule negli anticorpi primari (cioè Mef2c, aSarc, Cx43 e HuNu) diluiti 1:200 in 3 mL di PBS-BSA a 4 °C durante la notte.</li>
	<li>Lavare 3 volte con 3 mL di PBS-BSA per 5 minuti per lavaggio e incubare con anticorpi secondari per 30 minuti a temperatura ambiente. Lavare 3 volte con 3 ml di PBS-BSA per 5 minuti per lavaggio.</li>
	<li>Conservare i campioni colorati in 3 mL di terreno di montaggio.</li>
	<li>Acquisizione di immagini utilizzando un microscopio a fluorescenza. Utilizzare un obiettivo 10X (NA = 0,3) e un obiettivo 20X (NA = 0,45) per immagini con ingrandimento inferiore. Utilizzare cubi filtranti a fluorescenza e lunghezze d'onda per GFP (ex = 470/22 nm, em = 525/50 nm) e RFP (ex = 531/40 nm, em = 593/40 nm) per gli anticorpi secondari utilizzati (vedere la tabella dei materiali e delle apparecchiature).</li>
	<li>Quantificare le immagini utilizzando il software di imaging (vedere la tabella dei materiali e delle attrezzature per il software consigliato). Normalizza le letture dell'intensità della fluorescenza per le acquisizioni di controllo secondario.</li>
</ol>
6. Isolamento dell'RNA e RT-PCR quantitativa
<ol>
	<li>Preparare campioni di RNA da colture di MSC indifferenziate o MSC selezionate da co-colture utilizzando l'isolamento dell'RNA basato su colonna, secondo le istruzioni del produttore. Preparare da 1 x 104 a 1 x 106 cellule in 0,7 mL di tampone di lisi cellulare (fornito con il kit di isolamento dell'RNA) per campione.</li>
	<li>Preparare il cDNA da un massimo di 2 μg di RNA per reazione RT da 100 μL.</li>
	<li>Eseguire la qPCR utilizzando 10 ng di cDNA per reazione (40 cicli, temperatura di ricottura/estensione a 60 °C).
	<ol>
		<li>Utilizzare primer per MY6H e cTnT umani in una concentrazione di 500 nM e 1-100 ng di cDNA per reazione (vedere la tabella dei materiali e delle attrezzature). Utilizzare GAPDH, ACTB e HPRT come normalizzatori interni per la gestione delle pulizie. Utilizzare cardiomiociti derivati da cellule staminali pluripotenti indotte dall'uomo disponibili in commercio come controllo positivo. 
		NOTA: Esprimere il fold-change di espressione rispetto ai campioni di cDNA indifferenziati derivati da MSC.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>

Dr. Clifford L. Librach è contitolare del brevetto: metodi di isolamento e di uso di cellule derivate da tessuti di cordone ombelicale primo acetonide, concessa in Canada e in Australia.

La differenziazione delle cellule staminali cardiaca è stato in sviluppo per oltre 2 decenni, con diverse strategie diverse, viene utilizzate per generare del cardiomyocyte-come le cellule da fonti di MSC. Molte di queste strategie, tuttavia, sono inefficienti, e le condizioni utilizzate spesso non sono rappresentative dell'ambiente trapiantate cellule incontro in vivo.
In contrasto con i metodi esistenti, il protocollo presentato qui utilizza una combinazione di strati di alimentator...

Insufficienza cardiaca congestizia (CHF) persiste come delle cause principali di morbilità e mortalità in tutto il mondo. Il CHF accade spesso seguendo la perdita massiccia di cardiomiociti e lo sviluppo del tessuto di cicatrice senza cellula come risultato patologico di un infarto miocardico (MI)1. Mentre il cuore è un organo parzialmente autorinnovabile, piscina di cella residente, staminali e progenitrici, responsabile per l'esecuzione di rigenerazione tissutale significativamente diminuisce in abbondanza e la funzione in pazienti invecchiati, diventando spesso insufficiente per un recupero ottimale dopo la ferita. Così, c'è grande interesse nello sviluppo di trattamenti sperimentali che coinvolgono il trapianto delle cellule del donatore sano nel miocardio danneggiato. È imperativo che le cellule del donatore non solo ripristino la struttura del tessuto, ma anche realizzare il recupero funzionale del miocardio interessato.
Cuore natale impiega cuore tessuto residenti e cellule staminali endogene del midollo osseo-originario di alberino-ferita riparazione2,3,4. Donatore-derivati rigenerativa e di cellule-host allo stesso modo, deve avere la capacità di ottenere il fenotipo appropriato e funzione nel microambiente del miocardio che ritocco, insieme alla capacità di efficienza e sicurezza sostituire le cellule perse. Metodi di differenziazione in vitro sono stati ampiamente utilizzati per realizzare dei cardiomiociti ad alta efficienza, basati su cellule staminali produzione5,6. Il profilo di espressione di marcatori di linea cardiaca viene utilizzato per definire il processo di differenziazione delle cellule staminali verso la linea cardiaca7. Marcatori di precoce differenziazione, quali NKX 2.5, fattore di rinforzatore del miocita 2C (Mef2c) e GATA48,9, può essere un'indicazione dell'inizio del processo di cardiomiogenici. Marcatori del cardiomyocyte maturo comunemente usati per valutare l'efficacia di differenziazione sono segnale proteina regolatrice α (SIRPA)10, troponina cardiaca T (cTnT)11, catena pesante della miosina cardiaca (MYH6)8,12,13e connessina 43 (Cx43)14,15,16. I metodi di utilizzo di cellule staminali embrionali (ESCs) e cellule staminali pluripotenti (PSC) sono stati accuratamente ottimizzati e discussi per quanto riguarda i dettagli di fattori induttivi, ossigeno e nutrienti gradienti e l'esatta tempistica di azione5,6,7,17,18. Ciò nonostante, tecnologie basate su ESC e PSC presentano ancora più preoccupazioni etiche e sicurezza, insieme non ottimali caratteristiche elettrofisiologiche ed immunologiche19,20. Padroni di casa trapiantati con queste cellule spesso esperienza immunorejection e richiedono l'immunosoppressione permanente. Ciò è dovuto principalmente molecole di istocompatibilità (MHC) complesse nell'ospite ed il donatore e il risultante della T-cellula risposta21di disadattamento. Mentre singoli MHC di classe I di corrispondenza è una possibile soluzione, una pratica clinica più accessibile richiederebbe una fonte di cellule che universalmente è nuova per superare la preoccupazione del rifiuto.
Come fonte alternativa cellulare per l'uso in applicazioni cliniche, MSCs e in particolare, BMSC, sono stati studiati per l'uso nella rigenerazione del tessuto dalla loro descrizione iniziale nel 199522. MSCs sono creduti per essere cellule rigenerative residenti che possono essere trovate in quasi qualsiasi tessuto vascolarizzato23. Isolamento dalla sorgente desiderata, MSCs possono essere facilmente espanse in coltura, hanno capacità estesa paracrine e possiedono spesso nuova o immunomodulatori proprietà24,25. Loro sicurezza ed efficacia hanno già dimostrati in parecchi studi pre-clinici, in particolare per la rigenerazione cardiaca3,26.
Molte strategie di differenziazione di MSC utilizzano agenti farmacologici, quali 5-azacytidine22 e DMSO27e crescita o fattori morfogenetici, come BMPs5,7,28,29 o dell'angiotensina-II30, con efficienza variabile. Queste strategie, tuttavia, non sono basate sugli ostacoli che una cella rigenerativa ingenuo è probabile incontrare dopo homing o recapitati al sito della lesione in vivo. Strategie più fisiologicamente rilevanti, mentre più difficile da definire e manipolare, si basano sulla premessa che MSC differenziazione può essere indotta attraverso segnali dal microambiente del tessuto stesso. Gli studi precedenti hanno dimostrato che l'esposizione alla cellula cardiaca lisati31 o miocardio ventricolare32,33, o diretto contatto con primaria cardiomiociti in vitro15,34, può aumentare l'espressione di marcatori cardiaci in MSCs. Gli altri hanno dimostrato cardiomiogenesi spontanea dopo trattamento di lesioni cardiache con MSCs35,36,37,38, anche se in parte, la fusione di BMSC e cardiomiociti39,40 generato il miocardio nascente. A nostra conoscenza, non sono ancora stati segnalati cardiomiociti funzionali, spontaneamente contraenti da MSCs umane (hMSCs) di qualsiasi origine di tessuto.
Il consenso corrente è che tutti i MSCs derivano da perivascolari cellule23. MSCs giovane con proprietà Pericita può essere isolato dalla regione perivascolare del cordone ombelicale umano tessuto41,42,43. Rispetto alle BMSCs, HUCPVCs possiedono una maggiore differenziazione potenziale e diversi altri vantaggi rigenerative, entrambi in vitro41,44 ed in vivo45,46,47. In particolare, la fonte che è l'interfaccia materno-fetale, HUCPVCs le immunogenicità significativamente più basso rispetto alle fonti di adulti di MSCs. La nostra ricerca si concentra sulla caratterizzazione e applicazioni pre-cliniche di FTM HUCPVCs, la fonte più giovane di MSCs studiato, che precedentemente abbiamo indicato sono aumentati multilineage proliferative e superiore capacità di differenziazione, tra cui nel lignaggio cardiomiogenici41.
Qui, presentiamo un protocollo che unisce formazione aggregata e strati dell'alimentatore primario delle cellule cardiache come forze induttive per raggiungere la differenziazione di cardiomiogenici completa di MSCs. aggregati forniscono un ambiente 3D, che modelle migliori condizioni in vivo rispetto al 2D culture aderente. Utilizzando livelli cardiaci alimentatore fornisce un ambiente che è rappresentante del sito ultimate trapianto per MSCs. Dimostriamo che più giovane fonti di cellule staminali mesenchimali isolate da cordone ombelicale pre- o post-natali hanno una maggiore capacità di formare aggregati e raggiungere il fenotipo cardiaco rispetto al BMSCs adulto, mantenendo comunque il loro privilegio immunitario. Oltre la ripida elevazione dei geni marcatori di linea cardiaca e l'espressione indotta di intracellulare (cioè, cTnT e MYH6) e proteine di superficie cellulare (vale a dire, SIRPA e Cx43) specifico per cardiomiociti, indichiamo che il potenziale di differenziazione di FTM HUCPVCs possa essere imbrigliato con questo metodo e che possono dare origine a spontaneamente contraenti del cardiomyocyte-come le cellule.

<table><tbody><tr><td>0,25% Tripsina/EDTA</td><td>Gibco</td><td>25200056</td><td>Per la dissociazione cellulare</td></tr><tr><td>Alpha-MEM</td><td>Gibco</td><td>12571071</td><td>Per terreni di coltura HUCPVC e BMSC.</td></tr><tr><td>Anticorpo CD49f anti-umano/topo coniugato PE</td><td>Biolegend</td><td>313612</td><td>Marcatore di integrina per l'anticorpo</td></tr><tr><td>umano Cx43/GJA1 coniugato FC APC</td><td>R& D Systems</td><td>FAB7737A</td><td>marcatore Connexin 43 per</td></tr><tr><td>l'anticorpo HLA-A2 coniugato FC FITC</td><td>Genway Biotech Inc.</td><td>GWB-66FBD2</td><td>Marcatore di immunogenicità per</td></tr><tr><td>l'anticorpo FC FITC-coniugato anti-HLA-G [MEM-G/9]</td><td>Abcam</td><td>ab7904</td><td>Marcatore di immunogenicità per</td></tr><tr><td>l'anticorpo FC SIRPA/CD172a di topo coniugato con FC FITC anticorpo umano SIRPA/CD172a</td><td>AbD Serotec/Bio-Rad</td><td>MCA2518F</td><td>Marcatore cardiaco per</td></tr><tr><td>l'anticorpo umano coniugato FC APC TRA-1-85/CD147</td><td>R& D Systems</td><td>FAB3195A</td><td>Marcatore cellulare umano per FC e FACS</td></tr><tr><td>FITC-coniugato TRA-1-85/CD147 anticorpo</td><td>R& D Systems</td><td>FAB3195F</td><td>Marcatore cellulare umano per FC e FACS</td></tr><tr><td>Anticorpo anti-connessina 43/GJA1</td><td>Abcam</td><td>ab11370</td><td>Cx43. Per</td></tr><tr><td>l'anticorpo secondario ad assorbimento incrociato IgG (H+L) anti-coniglio di capra ICC, Alexa Fluor 555</td><td>Life Technologies</td><td>A-21428</td><td>Per l'anticorpo anti-alfa</td></tr><tr><td>acticina [EA-53] anti-sarcomerico</td><td>ICC Abcam</td><td>ab9465</td><td>aSARC. Per</td></tr><tr><td>l'anticorpo secondario ad assorbimento incrociato a catena pesante IgM anti-topo ICC Goat, Alexa Fluor 555</td><td>Life Technologies</td><td>A-21426</td><td>per</td></tr><tr><td>l'anticorpo di coniglio ICC Mef2C (D80C1) XP</td><td>New England BioLabs Ltd.</td><td>5030S</td><td>Per ICC</td></tr><tr><td>Asino anti-coniglio Anticorpo IgG (H+L) anticorpo, Alexa Fluor 488</td><td>Life Technologies</td><td>A-21206</td><td>Per ICC</td></tr><tr><td>Anti-nuclei (HuNu) (clone 235-1) Anticorpo</td><td>EMD Millipore</td><td>MAB1281</td><td>Per ICC</td></tr><tr><td>MZ9.5 Stereomicroscopio</td><td>Leica</td><td></td><td>Per aggregati di imaging.</td></tr><tr><td>Microprovette da centrifuga da 1,5 ml</td><td>Axygen</td><td>MCT-150-C</td><td>Per la colorazione di MSC con colorante fluorescente.</td></tr><tr><td>ImageJ</td><td></td><td></td><td>Software open source per l'elaborazione delle immagini.</td></tr><tr><td>Aria II&nbsp;</td><td></td><td>Struttura BD</td><td>UHN SickKids FC. Per lo smistamento cellulare.</td></tr><tr><td>Cellule stromali mesechimali del midollo osseo</td><td>Lonza</td><td>PT-2501</td><td>BMSC Albumina</td></tr><tr><td>sierica bovina</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A7030-100G</td><td>BSA. Per preparare le soluzioni per ICC</td></tr><tr><td>BrdU</td><td>EMD Millipore</td><td>MAB3424</td><td>Attenzione: BrdU è un forte teratogeno e sospetto mutageno. Assicurarsi di garantire una formazione adeguata e fare riferimento alla SDS prima dell'uso.</td></tr><tr><td>Canto II</td><td>BD</td><td></td><td>UHN SickKids FC Facility. Per citometria a flusso.</td></tr><tr><td>cDNA EcoDry Premix</td><td>Clontech/Takara</td><td>639570</td><td>Per la preparazione di cDNA per qPCR</td></tr><tr><td>CellTracker Green CMFDA Dye</td><td>Life Technologies</td><td>C7025</td><td>Imaging fluorescente del citoplasma cellulare</td></tr><tr><td>Contatore cellulare automatizzato Countess</td><td>Invitrogen Inc.</td><td>C10227</td><td>Per la conta cellulare</td></tr><tr><td>DMEM-F12</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D6421</td><td>Per il terreno di coltura primaria di cardiomiociti di ratto.</td></tr><tr><td>Gibco</td> <td>salino tamponato con fosfato di Dulbecco</td><td>10010023</td><td>D-PBS, senza Ca2+, Mg2+</td></tr><tr><td>EVOS</td><td>Life Technologies</td><td></td><td>Microscopio fluorescente interno</td></tr><tr><td>FACSCalibur</td><td>BD</td><td></td><td>In-house. Per citometria a flusso.</td></tr><tr><td>Siero fetale bovino (Hyclone)</td><td>GE Healthcare</td><td>SH3039603</td><td>FBS. Componente del terreno di coltura cellulare.</td></tr><tr><td>Sonde qPCR IDT Prime Time</td><td>Tecnologie dati integrate Fluoroforo</td><td>FAM</td><td>http://www.idtdna.com/pages/products/gene-expression/primetime-qpcr-assays-and-primers</td></tr><tr><td>Lab Vision PermaFluor Terreno di montaggio acquoso</td><td>ThermoScientific</td><td>TA-030-FM</td><td>Per la conservazione di cellule da sottoporre a ICC</td></tr><tr><td>LSR II&nbsp;</td><td></td><td>Struttura BD</td><td>UHN SickKids FC. Per citometria a flusso.</td></tr><tr><td>MoFlo Astrios</td><td>Beckman Coulter</td><td></td><td>UHN SickKids FC Facility. Per lo smistamento cellulare.</td></tr><tr><td>Siero di capra normale</td><td>Tecnologia di segnalazione cellulare</td><td>5425S</td><td>NGS. Utilizzato nella soluzione di blocco per ICC</td></tr><tr><td>Nunc Lab-Tek II Chamber Coverglass, 8 pozzetti</td><td>Thermo Scientific Nunc</td><td></td><td>155409 Per preparare campioni per ICC</td></tr><tr><td>OmniPur Triton X-100 Tensioattivo</td><td>EMD Millipore</td><td>9410-OP</td><td>Come componente della soluzione permeabilizzante durante la preparazione di celle per ICC</td></tr><tr><td>Paraformaldeide, soluzione al 16%,</td><td>Microscopia elettronica</td> di grado EM <td>Scienze 15710</td><td>Per il fissaggio di celle per ICC.</td></tr><tr><td>Penicillina/streptomicina</td><td>Gibco</td><td>15140122</td><td>Componente del terreno di coltura cellulare.</td></tr><tr><td>Primer</td><td>Sigma</td><td>Custom Standard DNA Oligos, Dissalato, 0.2 &mu; mol</td><td>CTnT_F: GGC AGC GGA AGA GGA TGC A; CTnT_R: GAG GAG CCA AGT TGG GCA TGA ACG A; MYH6 F: GCA AAG TAC TGG ATG ACA CGC T; MYH6 R: GTC ATT GCT GAA ACC GAG</td></tr><tr><td>Quorum Disco rotante confocale</td><td>Zeiss</td><td></td><td>SickKids Imaging Facility</td></tr><tr><td>ReproCardio Cardiomiociti derivati da cellule hiPS</td><td>ReproCell</td><td>RCD001N</td><td>Controllo positivo per qPCR</td></tr><tr><td>RNeasy mini kit</td><td>Qiagen</td><td>74106</td><td>Per isolare l'RNA per qPCR</td></tr><tr><td>Rotor-Gene SYBR Green PCR Kit</td><td>Qiagen</td><td>204074</td><td>Per qPCR con master mix</td></tr><tr><td>RPMI 1640</td><td>Gibco</td><td>A1049101</td><td>Per MSC, terreno di cocoltura di monociti.</td></tr><tr><td>Saggi di primer TaqMan qPCR</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>4444556</td><td>Per qPCR</td></tr><tr><td>Trypan Blue</td><td>Life Technologies</td><td>T10282</td><td>Colorazione delle cellule per la vitalità e il conteggio</td></tr><tr><td>Tripsina</td><td>Gibco</td><td>272500108</td><td>Per la dissociazione cellulare</td></tr><tr><td>Volocity</td><td>Perkin-Elmer</td><td>Volocity 6.3</td><td>Software di imaging</td></tr><tr><td>0,2 &mu; filtro a pori</td><td>m Thermo Fisher Scientific</td><td>566-0020</td><td>Per la sterilizzazione di terreni di coltura tissutale</td></tr><tr><td>HERAcell 150i CO2 Incubatore</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>51026410</td><td>Per l'incubazione di cellule</td></tr><tr><td>Soluzione salina tamponata con fosfato di Dulbecco</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D8537</td><td>PBS. 1X, Senza cloruro di calcio e cloruro di magnesio</td></tr><tr><td>Pinze</td><td>Almedic</td><td>7727- A10-704</td><td>Per la consegna del cuore di topo. Può usare qualsiasi pinza simile.</td></tr><tr><td>Forbici</td><td>Fine Science Tools</td><td>14059-11</td><td>Per tritare il cuore di topo. Si consigliano forbici curve.</td></tr><tr><td>Provetta da 50 mL</td><td>BD Falcon</td><td>352070</td><td>Per la raccolta durante la raccolta di cardiomiociti e le procedure generali di coltura tissutale</td></tr><tr><td>Tubo da 15 mL</td><td>BD Falcon</td><td>352096</td><td>Per le procedure generali di coltura tissutale</td></tr> piastre a <tr><td>6 pozzetti</td><td>Thermo Scientific Nunc</td><td>CA73520-906</td><td>Per la coltura tissutale</td></tr><tr><td>Piastre per colture tissutali da 10 cm</td><td>Corning</td><td>25382-428</td><td>Per la formazione di aggregati</td></tr><tr><td>Microscopio Axiovert 40C</td><td>Zeiss</td><td></td><td>Per l'imaging in campo chiaro attraverso la coltura dei tessuti e il resto del protocollo</td></tr><tr><td>70 &mu; filtro per cellule m</td><td>Fisherbrand</td><td>22363548</td><td>Per garantire una sospensione di una singola cellula prima della citometria a flusso o della selezione</td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>EMD Millipore</td><td>9410-1L</td><td>Utilizzato nella soluzione di permeabilizzazione per ICC</td></tr><tr><td>Hoechst 33342</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>H1399</td><td>Colorante utilizzato durante la visualizzazione della localizzazione Cx43</td></tr></tbody></table>

in vitro differenziazione delle cellule staminali mesenchimali umane in funzionale del cardiomyocyte-come le cellule

In Vitro Differentiation of Human Mesenchymal Stem Cells into Functional Cardiomyocyte-like Cells

Infarto miocardico e la successiva cascata ischemica causare la vasta perdita di cardiomiociti, che porta a insufficienza cardiaca congestizia, la principale causa di mortalità in tutto il mondo. Cellule staminali mesenchimali (MSCs) sono un'opzione di promessa per le terapie basate sulle cellule sostituire tecniche attuali, invasive. MSCs possono differenziare in lignaggi mesenchymal, inclusi i tipi di cellule cardiache, ma completa differenziazione in cellule funzionali non è ancora stato raggiunto. Metodi precedenti di differenziazione sono stati basati su agenti farmacologici o fattori di crescita. Tuttavia, le strategie più fisiologicamente pertinenti anche possono abilitare MSCs per subire la trasformazione cardiomiogenici. Qui, presentiamo un metodo di differenziazione utilizzando MSC aggregati sugli strati dell'alimentatore del cardiomyocyte per produrre del cardiomyocyte-come le cellule contraenti.
Cellule perivascolari del cordone ombelicale umano (HUCPVCs) sono state indicate per avere una maggiore differenziazione potenziale più comunemente studiato tipi di MSC, quali midollo osseo (BMSC) MSCs. Come fonte di ontogeneticamente più giovane, abbiamo studiato il potenziale di cardiomiogenici di HUCPVCs di primo-acetonide (FTM) rispetto alle più vecchie fonti. HUCPVCs FTM sono una romanzo, ricca fonte di MSCs che mantengono la loro nell'utero nuova proprietà una volta coltivate in vitro. Utilizzando questo protocollo di differenziazione, FTM e termine HUCPVCs raggiunto cardiomiogenici significativamente maggiore differenziazione rispetto alle BMSCs, come indicato da aumentata espressione di marcatori dei cardiomiociti (cioè, il fattore di rinforzatore del miocita 2C, troponina cardiaca T, miosina cardiaca catena pesante, segnale proteina regolatrice α e connexin 43). Mantennero anche significativamente più bassa immunogenicità, come dimostrato dalla loro espressione di HLA-A più bassa e più alta espressione di HLA-G. L'applicazione basata su aggregazione differenziazione, FTM HUCPVCs ha mostrato formazione aumentata aggregata potenziale e generato contraenti cluster di cellule entro 1 settimana di co-coltura su livelli cardiaci alimentatore, diventando il primo tipo MSC a farlo.
I nostri risultati dimostrano che questa strategia di differenziazione può sfruttare efficacemente il potenziale cardiomiogenici di giovani cellule staminali mesenchimali, quali HUCPVCs FTM e suggerisce che in vitro pre-differenziazione potrebbe essere una strategia potenziale per aumentare la loro efficacia rigenerativa in vivo.

I livelli di espressione di CD49f e il potenziale di formazione di aggregati risultano più elevati negli HUCPVC rispetto ai BMSC:
Per indurre la differenziazione delle hMSCs (vale a dire FTM HUCPVCs, HUCPVCs a termine e BMSCs), sospensioni cellulari singole di MSCs indifferenziate o gocce sospese contenenti MSCs (Tabella 1) sono state trasferite su monoculti di cardiomiociti primari di ...

Qui, presentiamo un metodo per sfruttare in modo efficiente il potenziale di differenziazione cardiache di giovane fonti di cellule staminali mesenchimali umane al fine di generare cellule funzionali, contraenti, del cardiomyocyte-come in vitro.

In Vitro Differenziazione delle cellule staminali mesenchimali umane in funzionale del Cardiomyocyte-come le cellule

Myocardial infarction and the subsequent ischemic cascade result in the extensive loss of cardiomyocytes, leading to congestive heart failure, the leading ...

L'obiettivo generale di questa procedura sperimentale è indurre e osservare l'induzione cardiomiogenica di cellule staminali mesenchimali. Questo metodo può contribuire a rispondere a domande fondamentali nel campo delle cellule staminali mesenchimali, come ad esempio quali rimedi possono essere indotti da segnali ambientali per generare cardiomiociti funzionali. Il principale vantaggio di questa tecnica consiste nell'utilizzo della formazione di aggregati e di strati cardiaci fetali, invece di agenti farmacologici o materiale genetico.Le implicazioni di questa tecnica si estendono alla terapia delle malattie cardiovascolari poiché approfondiscono il potenziale cardiomiogenico delle cellule staminali mesenchimali. A dimostrare questa procedura insieme a me ci saranno la signorina Farwah Iqbal, studentessa di dottorato del nostro laboratorio, Max Librach e Nadav Gasner, entrambi ricercatori in formazione presso il nostro laboratorio. Dopo aver isolato le parti di ratto neonato seguendo il protocollo descritto, tagliare i ventricoli a metà e trasferirli in una piastra da 10 centimetri contenente 10 millilitri di PBS, ponendola su ghiaccio per favorire il lavaggio del sangue.Quindi, utilizzando forbici curve, tagliare le pareti ventricolari in piccoli pezzi con un diametro di due-tre millimetri. Utilizzando una pipetta serologica, trasferire i pezzi di cuore di 10-12 animali in un tubo da 50 millilitri e lasciarli sedimentare. Rimuovere il maggior quantitativo possibile di PBS P/S, senza rimuovere alcun pezzo di cuore.Quindi aggiungere 10 millimetri di PBS P/S fresco. Per isolare i cardiomiociti, dopo che i pezzi di cuore si sono depositati, utilizzare tripsina 0,15% in PBS per sostituire il PBS P/S e incubare il tessuto a 37 gradi Celsius con agitazione per 10 minuti. Scartare il soprannatante.Quindi, ripetere la digestione con tripsina altre tre volte, versando però i soprannatanti in provette di raccolta da 50 millilitri contenenti 10 millilitri di FBS al 100%. Successivamente, centrifugare le provette con le cellule ed aspirare il soprannatante. Poi, utilizzare DMEM-F12 con FBS al 10% e P/S all'1% per risospendere le cellule e seminarle in una piastra a sei pozzetti.Una volta che le cellule si sono attaccate, sostituire il mezzo con due millilitri di mezzo fresco. Per preparare le MSC pre-marcate, rimuovere il mezzo da colture di MSC che hanno raggiunto una confluenza del 70% al 80% in piatti da 10 centimetri e aggiungere tre millilitri di soluzione di dissociazione cellulare. Incubare i piatti a 37 gradi Celsius e 5% di anidride carbonica per cinque minuti.Trasferire le cellule dissociate in una provetta da 15 millilitri e centrifugare a 400 x G per cinque minuti. Aspirare il soprannatante senza disturbare il pellet cellulare e risospendere le cellule. Quindi utilizzare un contatore cellulare automatico per contare le cellule.Diluire le cellule a una concentrazione di 1 x 10 alla sesta MSC per millilitro, in DMEM-F12 contenente 10% di FBS e 1% di P/S. Successivamente, aggiungere alle cellule in provette da centrifuga da 1,5 millilitro un colorante fluorescente vitale non trasferibile e incubare le MSC per mezz'ora. Dopo aver centrifugato le provette a 400 x G per cinque minuti, aspirare il soprannatante e risospendere il pellet a una concentrazione di 1 x 10 alla sesta MSC per millilitro.Quindi trasferire le MSC sui cardiomiociti a una concentrazione di 10 x 10 alla quarta cellule per pozzetto della piastra a sei pozzetti. Per ottenere colture co-aggregate, preparare una sospensione cellulare singola di MSC in MEM alfa, integrato con 10% di FBS e 1% di P/S. Avviare la formazione di aggregati, posizionando gocce da 25 microlitri di sospensione cellulare sulla superficie interna dei coperchi delle piastre per colture cellulari da 10 centimetri.Posizionare i coperchi sulle rispettive basi contenenti PBS P/S. Incubare le piastre a 37 gradi Celsius e 5% di anidride carbonica. Al microscopio stereoscopico, osservare la formazione di aggregati nelle gocce dopo tre giorni.Se oltre l'80% delle gocce contiene aggregati formati, utilizzare una micropipetta da un millilitro per raccogliere le gocce dai coperchi e trasferire direttamente gli aggregati su monocapati di cardiomiociti primari di ratto. Incubare le colture in co-coltura con gli aggregati per un massimo di due settimane, sostituendo l'intero volume di mezzo ogni 72 ore.Osservare quotidianamente mediante microscopia in campo chiaro l'adesione degli aggregati agli strati cellulari fetali. Registrare gli aggregati contrattili quando vengono osservati. Gli aggregati attivi si contraggono in modo sincronizzato, suggerendo una conduzione tra di essi attraverso l'intero strato fetale, che non presenta attività fisica.Aspirare il mezzo e aggiungere due millilitri di PBS per pozzetto della piastra a sei pozzetti. Rimuovere quindi il PBS e aggiungere due millilitri di soluzione di dissociazione per pozzetto. Incubare le piastre a 37 gradi Celsius e 5% di anidride carbonica per tre minuti.Come mostrato qui, le HMSC di tre tipi diversi hanno mostrato abbondanza e aspetto simili nelle colture co-adiacenti dirette. Due o tre giorni dopo il trasferimento delle gocce sospese su cellule cardiache in colture co-organizzate in aggregati, le FTM e le huck PBC termine sono apparse in aggregati più grandi rispetto a quelli osservati nei BMSC. In questo esperimento, l'analisi citofluorimetrica dell'espressione di CD49F nelle MSC indifferenziate ha mostrato che il 96% delle huck PBC da FTM, il 89% delle huck PBC e il 53% dei BMSC erano positivi per il marcatore di superficie cellulare CD49F.La citometria a flusso su cellule TRA won 85 ha mostrato un'upregolazione del marcatore associato ai cardiomiociti, SIRPA, nei PBC di huck FTM e nei PBC di huck a termine, ma non nelle BMSC provenienti da co-colture dirette. Come mostrato qui, l'upregolazione di cx43 era significativamente più elevata nei PBC di huck FTM rispetto ai PBC di huck a termine o alle BMSC nelle co-colture dirette. L'analisi mediante microscopia fluorescente ha rivelato che sia i PBC di huck FTM in differenziamento sia quelli di huck a termine upregolavano cx43.Con PBC di huck a termine in proporzione maggiore rispetto ai FTM. Tuttavia, la microscopia a fluorescenza ha rivelato che le puncta positive per cx43 erano osservate nella membrana cellulare dei PBC di huck FTM, mentre erano prevalentemente citoplasmatiche nelle cellule a termine. Infine, come mostrato qui, è stata eseguita una microscopia a fluorescenza ad alto ingrandimento su cellule umane ordinate, dopo co-coltura, confermando l'elevata abbondanza di cx43 nella membrana plasmatica.Una volta acquisita padronanza, i passaggi chiave di questa procedura possono essere eseguiti ciascuno in un'ora, se svolti correttamente. Quando si esegue questa procedura, è fondamentale mantenere precauzioni asettiche. I tessuti animali primari coinvolti potrebbero introdurre contaminazioni, se non manipolati correttamente.Al termine di questa procedura, è possibile eseguire altri metodi, come la coltura prolungata di aggregati contrattili, per rispondere a ulteriori domande, ad esempio sulla longevità di queste strutture. Una volta sviluppata, questa tecnica consente ai ricercatori nel campo delle cellule staminali mesenchimali (MSC) di esplorare il potenziale differenziativo di fonti più giovani di cellule staminali mesenchimali, come i tessuti extra-embrionali. Dopo aver visionato questo video, si dovrebbe avere una buona comprensione di come preparare aggregati di MSC e combinarli con strati fetali primari diretti, in un modo che fornisca un'adeguata induzione alla differenziazione cardiomiogenica.Non dimenticare che lavorare con BRDU può essere estremamente pericoloso e che precauzioni, come la corretta gestione dei rifiuti citotossici, devono sempre essere adottate durante l'esecuzione di questa procedura.

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Questo video mostra come condurre differenziamento in vitro di cellule staminali embrionali di topo di corpi embrionali usando il metodo goccia pendente.

La differenziazione in vitro di staminali embrionali di topo (MES) Cellule con il metodo goccia

Abbiamo stabilito un protocollo per l'induzione della cardioblasts pluripotenti direttamente da cellule staminali embrionali umane conservati in condizioni definite con piccole molecole, che permette la derivazione di una grande quantità di risorse umane progenitori cardiaci e funzionale cardiomiociti per la riparazione cardiovascolare.

Derivazione efficiente dei diritti dell&#39;uomo e precursori cardiaci e cardiomiociti pluripotenti da cellule staminali embrionali umane con induzione piccole molecole

Le cellule staminali pluripotenti, sia staminali (iPS), le cellule embrionali pluripotenti o indotto, costituiscono una preziosa fonte di cellule differenziate umani, tra cardiomiociti. Qui, ci si concentrerà sulla induzione cardiaco di cellule iPS, che mostra come usarli per ottenere cardiomiociti umani funzionali attraverso un protocollo embryoid corpi-based.

Generazione di cardiomiociti umani: Un protocollo di differenziazione da alimentatore-Free umani cellule staminali pluripotenti indotte

L'articolo descrive la metodologia dettagliata per differenziare efficacemente le cellule staminali pluripotenti umane in cardiomiociti selettivamente modulando la via di Wnt, seguita da analisi citofluorimetrica di marcatori di riferimento per valutare l'omogeneità e l'identità della popolazione.

Alta efficienza differenziazione delle cellule staminali pluripotenti umane di cardiomiociti e Caratterizzazione mediante citometria di flusso

In questo protocollo, verrà illustrata la derivazione di cellule progenitrici cardiache da cellule staminali embrionali sia di topo che umane. Una delle principali strategie di questo protocollo consiste nell'arricchire le cellule progenitrici cardiache con la citometria a flusso utilizzando reporter fluorescenti ingegnerizzati nelle linee di cellule staminali embrionali.

Derivazione di cellule cardiache progenitrici di cellule staminali embrionali

Qui, descriviamo un robusto protocollo per la derivazione di cardiomiociti umani che combina la differenziazione cardiaca modulata da piccole molecole e la purificazione dei cardiomiociti mediata dalla privazione di glucosio, consentendo la produzione di cardiomiociti purificati ai fini della modellazione delle malattie cardiovascolari e dello screening dei farmaci.

Derivazione di Cardiomyocytes altamente purificato da cellule staminali umane pluripotenti indotte utilizzando piccoli Differenziazione Molecola-modulato e successiva glucosio Starvation

Questo manoscritto descrive la creazione di tessuti cardiaci ingegnerizzati definiti utilizzando l'espressione di marcatori di superficie e la selezione cellulare. I tessuti definiti possono quindi essere utilizzati in un bioreattore multi-tessuto per studiare i meccanismi della terapia cellulare cardiaca al fine di fornire un sistema modello funzionale, ma controllato, del cuore umano.

Costruzione di Engineered Definito umani cardiache tessuti per studiare i meccanismi della terapia cellulare cardiaca

La generazione di cardiomiociti da cellule staminali pluripotenti in vitro consente l'accesso a grandi quantità di tessuto cardiaco in vitro per la scienza di base e le applicazioni cliniche.  Questo protocollo utilizza il fattore atrializzante Grem2 sia per aumentare il numero di cardiomiociti ottenuti sia per generare cardiomiociti con un fenotipo atriale.

Differenziazione dei atriale cardiomiociti dalle cellule staminali pluripotenti utilizzando la BMP Antagonista Grem2

La caratterizzazione elettrofisiologica dei cardiomiociti derivata da cellule staminali pluripotenti umane (hPSC-CM) è fondamentale per la modellizzazione delle malattie cardiache e per la determinazione delle risposte di farmaco. Questo protocollo fornisce le informazioni necessarie per dissociare e piastrare hPSC-CM su matrici multi-elettrodi, misurare il loro potenziale di campo e un metodo per analizzare gli intervalli QT e RR.

Analisi elettrofisiologica dei cardiomiociti derivanti da cellule staminali pluripotenti umane (hPSC-CMs) Utilizzando matrici multi-elettrodo (MEAs)

Qui descriviamo e convalidiamo un metodo per generare costantemente robusti cardiomiociti derivati da cellule staminali derivate da cellule staminali indotte dall'uomo e caratterizzano la loro funzione. Queste tecniche possono aiutare a sviluppare informazioni meccanicistiche sui percorsi di segnalazione, fornire una piattaforma per lo screening farmacologico su larga scala e modellare in modo affidabile le malattie cardiache.

Generazione di Cardiomiociti Ventricular-Like HiPSC-Derived e preparati cellulari di alta qualità per la caratterizzazione della movimentazione del calcio

Qui, presentiamo un protocollo per generare ed espandere in modo robusto i cardiomiociti umani dalle cellule mononucleate del sangue periferico del paziente.

Generazione ed espansione di cardiomiociti umani da cellule mononucleate del sangue periferico del paziente

Scopri la differenziazione cardiomiogenica delle cellule staminali mesenchimali umane in vitro mediante segnali ambientali e formazione di aggregati. Questo metodo offre un'alternativa funzionale alle tecniche farmacologiche per la terapia delle malattie cardiovascolari.

In Vitro Differenziazione delle cellule staminali mesenchimali umane in funzionale del Cardiomyocyte-come le cellule

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