Gli effetti del trapianto Allogeneic Plasma ricco di piastrine (PRP) sul processo di guarigione dei tendini di Achilles sezionato dei ratti: una descrizione metodologica

L'obiettivo generale di questa procedura è osservare gli effetti di una singola iniezione di plasma ricco di piastrine, o PRP, sulla resistenza e sul processo di guarigione dei tendini d'Achille di ratto sezionati chirurgicamente in vari momenti. Questo metodo può aiutare a rispondere a domande rapide sul campo muscolo-scheletrico sulle lesioni tendinee. Il vantaggio principale di questa tecnica è che le procedure chirurgiche, biomeccaniche e di progressione del PRP sono ben standardizzate.

Le implicazioni di queste tecniche si estendono all'uso del PRP nell'uomo, perché questi tipi di lesioni e il processo di guarigione del tendine sono simili tra ratti e umani. Sebbene questo metodo possa fornire informazioni sulla preparazione del PRP per le lesioni muscoloscheletriche, questa tecnica di iniezione può essere applicata anche ad altri sistemi, come le malattie cardiache o della pelle. La dimostrazione visiva del metodo è molto importante, perché le fasi chirurgiche e biomeccaniche richiedono una riproducibilità costante per ottenere risultati ottimali.

Inizia pesando e marcando le orecchie del topo. Dopo aver confermato il livello appropriato di sedazione con un pizzico di punta, applicare gocce d'acqua sulle cornee dell'animale e rimuovere i peli dall'arto posteriore sinistro. Disinfettare la pelle esposta con una diluizione da una a 10 di soluzione di iso-betadina e posizionare l'animale su un termoforo a 20 gradi Celsius sotto un microscopio da dissezione in posizione di decubito laterale, con l'arto posteriore sinistro in posizione superiore.

Afferra la zampa dell'arto posteriore sinistro con una pinza e fai un'incisione cutanea laterale da 20 a 25 millimetri attorno al tendine d'Achille. Usando le forbici sottili, seziona la fascia per esporre il complesso del tendine d'Achille e rimuovere il tendine plantare. Tagliare il tendine d'Achille trasversalmente, cinque millimetri prossimalmente alla sua inserzione calcaneare, e rimuovere una porzione lunga cinque millimetri.

Quindi utilizzare un filato riassorbibile e continuare con i punti di sutura per chiudere la fascia e la pelle, e posizionare il ratto sotto una fonte di calore con monitoraggio fino al completo recupero. Mentre gli animali riceventi si stanno riprendendo, raccogliere 20 millilitri di sangue intero da un cuore di ratto donatore per animale da esperimento in singole provette contenenti il 3,2% di citrato di sodio tamponato. Per ottenere il plasma ricco di piastrine, centrifugare il sangue e utilizzare una pipetta di trasferimento in plastica per raccogliere con cura la fase superiore contenente PRP in una seconda provetta di plastica.

Determinare il volume di PRP raccolto e misurare la conta piastrinica su un analizzatore ematologico. Centrifugare nuovamente il PRP e trasferire con cura il surnatante in una nuova provetta di plastica. Il volume rimanente nella provetta PRP dovrebbe essere circa 2/3 del volume richiesto per raggiungere 2,5 volte 10 al sesto piastrine per microlitro.

Quindi, risospendere delicatamente il pellet piastrinico con il pipettaggio. Misurare la conta piastrinica di questo plasma ricco di piastrine concentrato, aggiungendo nuovamente il volume appropriato di plasma autologo povero di piastrine per raggiungere la concentrazione target, se necessario. Attivare le piastrine con 50 microlitri di cloruro di calcio per millilitro di PRP per circa un'ora a temperatura ambiente.

Quindi caricare le piastrine in una siringa da un millilitro dotata di un ago calibro 21 e iniettare 50 microlitri di piastrine direttamente nel sito di sutura di ciascun animale. Al punto finale sperimentale appropriato, radere l'arto posteriore sinistro dell'animale da esperimento anestetizzato e posizionare il ratto sotto un microscopio da dissezione come appena dimostrato. Tenendo la zampa con le dita, praticare un'incisione di 10 millimetri nel sito chirurgico per esporre il tricipite suralis.

Per rimuovere il tendine d'Achille, tagliare l'osso calcaneare trasversalmente, da cinque a 10 millimetri distalmente al suo attacco e sezionare un pezzo del tricipite suralis abbastanza grande da entrare nella crio-mascella. Utilizzare una pinza per posizionare il campione immediatamente nella mascella superiore della crio-mascella e chiudere lo strumento. Posizionare la crio-mascella verticalmente in una macchina di prova universale e fissare l'osso calcaneare tra i morsetti inferiori.

Per calcolare l'area della sezione trasversale, posizionare le telecamere perpendicolarmente l'una all'altra. Aggiungere azoto liquido in entrambi i bacini della mascella superiore per congelare il muscolo a un ordine di grandezza più rigido del tendine, in modo che non si deformi durante la prova di trazione. Quando la zona di congelamento raggiunge il bordo del morsetto metallico, impostare la velocità di spostamento della macchina a una velocità costante di un millimetro al secondo fino alla rottura e iniziare la prova di trazione, utilizzando un computer per registrare la resistenza alla trazione massima in Newton.

Per tenere conto delle differenze nelle aree della sezione trasversale dei tendini di guarigione, normalizzare la resistenza alla trazione finale in un'area unitaria che rappresenta lo stress meccanico subito dal tessuto. Quindi, quando il tendine si rompe, congelare i campioni di tendine rotto in azoto liquido e conservarli a una temperatura negativa di 80 gradi Celsius fino all'estrazione dell'RNA e all'analisi RTPCR. In questo esperimento rappresentativo, è stata necessaria una forza maggiore per indurre la rottura del tendine nel gruppo iniettato con PRP rispetto al gruppo di controllo trattato con soluzione salina in ogni momento testato, suggerendo un processo di guarigione più robusto o migliori proprietà meccaniche all'interno degli animali trattati con PRP.

Sebbene il gruppo PRP abbia dimostrato una dispersione intra-gruppo più elevata rispetto al gruppo salino, l'area della sezione trasversale dei tendini è risultata essere più grande nel gruppo iniettato con PRP ai giorni 15 e 30 dopo l'induzione della lesione. Inoltre, la colorazione tricromica di Masson ha rivelato una maggiore presenza di collagene fibrillare, un componente chiave nella morfologia e nella forza del tendine, negli animali trattati con PRP nei giorni cinque e 15, con un'intensità di colorazione simile osservata in entrambi i gruppi entro il giorno 30 dopo l'iniezione. Dopo aver visto questo video, dovresti avere una buona comprensione di come indurre lesioni standard di un ratto e campionare il tendine per valutare il loro processo di guarigione dopo un'iniezione di PRP.