Tecniche di laboratorio utilizzate per mantenere e differenziare i biotipi di Vibrio cholerae Isolati clinici ed ambientali

L'obiettivo generale di questa tecnica è quello di fornire una raccolta di protocolli semplici da eseguire e che possano aiutare qualsiasi ricercatore a caratterizzare un determinato isolato clinico o ambientale di Vibrio cholerae. Questo metodo può aiutare a rispondere a domande chiave nel campo della batteriologia, come le caratteristiche genotipiche e fenotipiche specifiche di qualsiasi isolato di Vibrio cholerae, in particolare quelle di rilevanza clinica. Il vantaggio principale di questa tecnica è che consente a qualsiasi ricercatore di utilizzare questa raccolta di saggi per caratterizzare e distinguere in modo affidabile gli isolati di Vibrio cholerae clinici o ambientali.

Insieme, questi saggi forniscono un approccio sistematico da utilizzare in alternativa o in aggiunta a costosi esperimenti ad alta intensità di lavoro e alla caratterizzazione di isolati clinici e ambientali di Vibrio cholerae. Sebbene questo metodo possa fornire informazioni sulla caratterizzazione dei biotipi di Vibrio cholerae, può anche essere applicato per caratterizzare le capacità biochimiche e metaboliche di altri batteri enterici. In generale, gli individui che non conoscono questo metodo avranno difficoltà con la gestione del tempo, poiché i tempi di incubazione necessari per garantire risultati ottimali differiscono tra i saggi biochimici.

Le dimostrazioni visive dei protocolli di spotting e accoltellamento sono fondamentali, poiché gli schizzi possono spesso portare a contaminazione incrociata ed è necessaria la massima spaziatura per evitare la fusione tra le colture. Iniziare il protocollo pellettando 1,8 mL di coltura liquida durante la notte per due minuti mediante centrifugazione a una velocità minima di 8.600 xG in una provetta sterile da microcentrifuga da 2 mL. Dopo la centrifugazione, rimuovere il surnatante e risospendere il pellet cellulare in 900 mcL di brodo fresco Luria-Bertani o LB mediante pipettaggio.

Quindi, aggiungere 900 mcL di glicerolo sterile al 60% da volume a volume alla coltura e mescolare a vortice. Trasferire la miscela in una provetta criogenica sterile da 2 ml e conservare la coltura madre a 80 gradi Celsius. Per utilizzare il brodo, con un ansa di inoculazione sterile, rimuovere una piccola quantità di brodo congelato e striare i batteri per ottenere singole colonie su piastre di agar LB.

Riportare immediatamente il brodo congelato a 80 gradi Celsius dopo l'uso per evitare che le colture si scongelino completamente. Incubare le piastre con il coperchio rivolto verso il basso per 12-16 ore a 37 gradi Celsius. Procurarsi la piastra precedentemente preparata.

Inoculare 4 ml di brodo LB liquido in una provetta di coltura sterile da 10 ml con una singola colonia toccando la superficie della singola colonia con un'ansa sterilizzata e trasferendo la colonia nel brodo liquido. Quindi, incubare la coltura con aerazione in un'incubatrice a 225 giri/min per 12-16 ore a 37 gradi Celsius. Preparare la coltura notturna nel brodo liquido LB.

Il giorno successivo, pellettare la coltura e lavare le cellule rimettendo in sospensione il pellet cellulare in 1,8 mL di soluzione salina tamponata con fosfato 1x o PBS. Ripetere la procedura di lavaggio tre volte. Seguire il terzo lavaggio con una risospensione finale in 1,8 mL di 1x PBS.

Quindi, utilizzare la punta di una pipetta per individuare 1 mcL di coltura lavata sul rispettivo terreno. Lavare il pellet cellulare ottenuto dalla coltura notturna. Inoculare le piastre di agar per motilità inserendo una pugnalata inoculante nella coltura liquida lavata e pugnalare verticalmente nel terreno.

Assicurarsi che la pugnalata di inoculazione non si pieghi durante l'accoltellamento dell'agar. Tra ogni inoculazione, sterilizzare la pugnalata metallica utilizzando un bruciatore Bunsen. Incubare le piastre con il coperchio rivolto verso l'alto per 14-24 ore a 37 gradi Celsius.

Dopo 14 ore, monitorare attentamente le piastre di motilità per prevenire la crescita eccessiva delle colture. Inoculare 4 mL di brodo Methyl Red Voges-Proskauer o MR-VP pipettando 10 mL di coltura notturna precedentemente preparata in 4 mL di brodo MR-VP in una provetta di coltura sterile e incubare con aerazione in un incubatore shaker a 225 giri/min per 12-16 ore a 37 gradi Celsius. Quindi, aggiungere 150 mcL di idrossido di alfa-naftolo al 5% in peso per volume e 50 mcL di idrossido di potassio al 40% in peso per volume alle aliquote da 1 mL di coltura notturna MR-VP in provette sterili, rispettivamente.

Quindi, agitare brevemente i tubi. Lasciare riposare i tubi a temperatura ambiente per un massimo di quattro ore fino a quando non si sviluppa il cambiamento di colore. I ceppi di riferimento del biotipo e le varianti rappresentative di El Tor sono stati inclusi negli screening genetici di base PCR e nei saggi fenotipici per distinguere tra i background biotipici degli isolati clinici e ambientali di V.Cholerae.

L'O395 classico wild-type ha dimostrato le sequenze classiche di ctxB e tcpA. Al contrario, i ceppi wild-type di El Tor N16961 e C6706 hanno dimostrato le sequenze ctxB e tcpA di El Tor. MQ1795 e BAA-2163 contengono la subunità ctxB del biotipo classico paragonabile a 0395.

Eppure entrambe le varianti di El Tor contenevano il tcpA indicativo del background del biotipo di El Tor. Quando coltivato su piastre di agar LB integrate con polimixina B, il ceppo biotipo classico wild-type 0395 ha mostrato sensibilità alla polimixina B, mentre il ceppo biotipo El Tor wild-type ha mostrato resistenza. I ceppi rappresentativi della variante El Tor hanno dimostrato una resistenza simile all'antibiotico.

Dopo aver visto questo video, dovresti avere una buona comprensione di come distinguere tra i biotipi di Vibrio cholerae utilizzando il sistema di identificazione a più saggi delineato in questo manoscritto. Non dimenticare che lavorare con gli agenti patogeni BSL-2 può essere estremamente pericoloso e che la corretta gestione e smaltimento di tutti i materiali e i prodotti di scarto deve essere applicata secondo le normative istituzionali, locali, statali e federali. Oltre ai protocolli elencati in questo manoscritto, un'ulteriore caratterizzazione degli isolati di Vibrio cholerae può essere ottenuta attraverso lo studio di altre proprietà fenotipiche come la formazione di biofilm e l'autoagglutinazione.