Name: Tecniche di laboratorio utilizzate per mantenere e differenziare i biotipi di Vibrio cholerae Isolati clinici ed ambientali (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-05-30T13:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 58 s
Description: Scopri le tecniche di laboratorio per mantenere e differenziare i biotipi di Vibrio cholerae clinici e ambientali. Questi saggi biochimici offrono un approccio sistematico alternativo ai metodi costosi e laboriosi.

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Ricerca sostenuta da New Hampshire-INBRE attraverso un Premio di Sviluppo Istituzionale (IDeA), P20GM103506, presso l&#39;Istituto Nazionale delle Scienze Mediche Generali del NIH.

Nota: le considerazioni di tempo per ogni dosaggio devono essere effettuate poiché le singole preparazioni per i supporti richiedono tempi diversi. Ad esempio, i supporti a lastre di agarro solido devono essere abbassati e asciugati (1-2 giorni). Ulteriori considerazioni di tempo ( cioè la colonia singola e la crescita della coltura durante la notte) sono specificate in ciascun protocollo e si trovano nella tabella 2 . 1. Preparazione dei supporti <ol><li> 1x salina a tampone fosfato (PBS) <ol><li> Pesare 4,0 g NaCl, 0,1 g KCl, 0,72 g Na 2 HPO 4 e 0,12 g KH 2 PO 4 . Combinare i costituenti in un pallone Erlenmeyer da 1 L, regolare il volume a 500 mL con acqua deionizzata, regolare il pH a 7,2 utilizzando un misuratore di pH e aggiungere HCl in goccia alla soluzione e sterilizzare con autoclave o filtro usando un filtro da 0,22 μm. 1x PBS può essere conservato a temperatura ambiente a tempo indeterminato. ATTENZIONE: HCl è un acido concentrato e deve essere manipolato secondoAlle norme istituzionali, locali, statali e federali. Per le linee guida appropriate per la manipolazione fare riferimento alla scheda di dati di sicurezza fornita dal produttore. </li></ol></li><li> Luria-Bertani (LB) brodo <ol><li> Pesare 5,0 g di tryptone, 2,5 g di estratto di lievito e 2,5 g di NaCl. Combinare i componenti in una bottiglia da 1 L, regolare il volume a 500 mL con acqua deionizzata, autoclave e conservare a temperatura ambiente fino a 6 mesi. Per le condizioni indotte da virulenza classica biotipo, regolare il pH a 6,5 ​​con HCl prima dell&#39;autoclavamento. </li></ol></li><li> AKI Medium contenente 0,03% (w / v) NaHCO 3 <ol><li> Per il componente 1 (medium AKI): pesare 7,5 g di peptone, 2,0 g di estratto di lievito e 2,5 g di NaCl. Combinare i componenti in una bottiglia da 1 L, regolare il volume a 450 mL con acqua deionizzata e autoclave. Il mezzo AKI può essere conservato a temperatura ambiente fino a 6 mesi. </li><li> Per il componente 2 (NaHCO 3 ): pesare 1,5 g di NaHCO 3 e regolare il volumeA 50 mL con acqua deionizzata in una vescicola sterile. Filtro sterilizzare NaHCO 3 utilizzando un filtro da 0,22 μm. NaHCO3 deve essere preparato immediatamente prima dell&#39;uso. </li><li> Asepticamente combinare i due componenti creando un rapporto 1:10 filtrando il componente 2 nella componente 1 prima dell&#39;uso. </li></ol></li><li> Luria-Bertani (LB) piatti di agar <ol><li> Pesare 5,0 g di tryptone, 2,5 g di estratto di lievito, 2,5 g di NaCl e 7,5 g di agar. Combinare i componenti in un pallone Erlenmeyer da 1 L, regolare il volume a 500 mL con acqua deionizzata, autoclave e preparare in piatti standard Petri di 100 mm x 15 mm sterili. I supporti placcati possono essere immagazzinati in plastica per un massimo di 6 mesi, con coperchio fino a 4 ° C. </li></ol></li><li> LB Agar Piatti Supplementati con Polymyxin B <ol><li> Per il componente 1 (agar LB): pesare 5,0 g di tryptone, 2,5 g di estratto di lievito, 2,5 g di NaCl e 7,5 g di agar. Combinare i costituenti in un pallone Erlenmeyer da 1 L, regolare il volume a 500 mL wiL&#39;acqua deionizzata e l&#39;autoclave. </li><li> Per il componente 2 (polimicina B): sciogliere la polimicina B in acqua deionizzata in un tubo sterile di microcentrifuga da 2 ml a una concentrazione di 50.000 UI / μl e sterilizzare con filtro utilizzando un filtro da 0,22 μm. </li><li> Una volta che il componente 1 è fresco al tocco, ma non ancora solidificato, aggiungere asetticamente 500 μL di componente 2 al componente 1 creando una concentrazione finale di 50 UI / μL e mescolare accuratamente. Preparare piatti standard Petri di 100 mm x 15 mm versando agar mischiati nei piatti di Petri. I supporti placcati possono essere immagazzinati in plastica per un massimo di 3 mesi, con coperchio fino a 4 ° C. </li></ol></li><li> Piatti minimi di agar di citrato <ol><li> Per il componente 1 (agar con blu bromotimolo): pesare 7,5 g di agar e 0,02 g di bromotimolo blu. Combinare i costituenti in un pallone Erlenmeyer da 1 L, regolare il volume a 450 mL con acqua deionizzata e autoclave la miscela. </li><li> Per il componente 2 (10x VBMM): pesare 10,1 g di MgSO 4 7H 2 O, 10,0 g di acido citrico acido H 2 O, 50,0 g di K 2 HPO 4 anidro e 17,5 g di NaNH 4 HPO 4 4 H 2 O. Combinare i costituenti in un pallone Erlenmeyer da 1 L, regolare il volume a 500 ml Con acqua deionizzata e sterilizzazione autoclave o filtro usando un filtro da 0,22 μm. 10x VBMM può essere conservato a temperatura ambiente fino a 6 mesi. </li><li> Aggiungere 50 ml di componente 2 al componente 1 e preparare in piatti standard Petri da 100 mm x 15 mm versando agar mischiati nei piatti di Petri. I supporti placcati possono essere immagazzinati in plastica per un massimo di 6 mesi, con coperchio fino a 4 ° C. </li></ol></li><li> Piatti di Agar Milk <ol><li> Per il componente 1 (latte): pesare 8,0 g di latte secco non grasso istantaneo in un pallone Erlenmeyer da 1 L, regolare il volume a 200 ml con acqua deionizzata e autoclave. </li><li> Per il componente 2 (agar con infusione cerebrale-cuore): pesare 3,68 g di infusione cerebrale-cuore e 6,0 g di agar. Combina il conIn un pallone Erlenmeyer da 500 mL, regolare il volume a 200 mL con acqua deionizzata e autoclave. </li><li> Combinate i due componenti versando il componente 2 nella componente 1, dopo aver autoclavato e mescolato accuratamente. Preparare in piatti di Petri sterili da 150 mm x 15 mm. Le piastre di latte possono essere conservate fino a una settimana avvolte in plastica, con coperchio verso il basso a 4 ° C. Preparare in piatti di Petri sterili da 150 mm x 15 mm versando agar mischiati nei piatti di Petri. </li></ol></li><li> Piastre di agaricità <ol><li> Per il componente 1 (LB agar): pesare 5,0 g di tryptone, 2,5 g di estratto di lievito, 2,5 g di NaCl e 2,0 g di agar. Combinare i costituenti in un pallone Erlenmeyer da 1 L, regolare il volume a 500 mL con acqua deionizzata e autoclave. </li><li> Per il componente 2 (1% (w / v) cloruro di trifeniltetrazolium; TTC): pesare 0,25 g di TTC. Regolare il volume a 25 ml con acqua deionizzata in una vescicola sterile e sterilizzare con filtro utilizzando un filtro da 0,22 μm. Conservare fino a 6 mesi a temperatura ambiente avvoltoIn foglio per minimizzare l&#39;esposizione alla luce. </li><li> Aggiungere 2,5 ml di 1% (w / v) TTC sterile ai supporti autoclavati. </li><li> Versare il mezzo più spesso possibile (≥50 mL / piastra) in grandi piatti di Petri sterili 150 mm x 15 mm. I supporti placcati possono essere immagazzinati in plastica fino a una settimana, con coperchio fino a 4 ° C. Preparare in piatti di Petri sterili da 150 mm x 15 mm versando agar mischiati nei piatti di Petri. </li></ol></li><li> Voges-Proskauer (VP) <ol><li> Per il componente 1 (Methyl Red-Voges-Proskauer broth; MR-VP): pesare 1,7 g di supporto MR-VP in un pallone Erlenmeyer da 500 ml, regolare il volume a 100 ml con acqua deionizzata e autoclave. Il brodo sterile MR-VP può essere conservato a temperatura ambiente fino a 6 mesi. </li><li> Per il componente 2 (5% (w / v) alfa (α) naphtolo): pesare 1,0 g di α-naftolo in una vescicola sterile e regolare il volume a 20 ml con 95% etanolo. L&#39;α-naftolo può essere conservato a temperatura ambiente fino a 1 settimana avvolto in fogli per ridurre al minimo la luceosure. </li><li> Per il componente 3 (40% (w / v) idrossido di potassio; KOH): pesare 20,0 g di KOH in una vescicola sterile, regolare il volume a 50 ml con acqua sterile deionizzata. KOH può essere conservato fino a 6 mesi a temperatura ambiente in un recipiente di plastica. </li></ol></li></ol> 2. Manutenzione e crescita di V. Ceppi di colera <ol><li> Preparazione e utilizzo di colture congelate <ol><li> Pellet 1.8 ml di coltura di notte per 2 min per centrifugazione (≥8.600 xg) in un tubo sterile di microcentrifuga da 2 ml, rimuovere il surnatante e riposizionare il pellet cellulare in 900 μL di brodo fresco di LB pipettando. </li><li> Aggiungere 900 μL di glicerolo sterile al 60% (v / v) alla coltura e mescolare mediante vortexing. </li><li> Trasferire la miscela in un tubo criogenico sterile da 2 ml e conservare a tempo indeterminato a -80 ° C. </li><li> Per utilizzare, rimuovere una piccola quantità di stock congelata usando un ciclo inoculatore sterile e una striscia per singole colonie su LB agAr. Immediatamente rimettere a magazzino congelato a -80 ° C dopo l&#39;uso per evitare che le culture si scongiurino completamente. Incubare le piastre con il coperchio lungo il basso per 12 a 16 ore a 37 ° C. </li></ol></li><li> Crescita di culture di overnight in liquido medio <ol><li> Striature per colonie singole (secondo la sezione 2.1.4) da scorte surgelate su piastre LB agar. Incubare le piastre con il coperchio laterale per 12 a 16 ore a 37 ° C. </li><li> Inoculare 4 ml di liquido LB liquido in un tubo di coltura sterile da 10 ml con una singola colonia toccando la superficie della singola colonia con un bastone applicatore sterile e trasferendo la colonia nel brodo liquido. </li><li> Incubare con aerazione in un incubatore a scuotitore a 225 giri / min per 12 a 16 h a 37 ° C. </li></ol></li><li> Curva di crescita <ol><li> Preparare la coltura durante la notte in brodo LB liquido come precedentemente indicato nel protocollo 2.2. </li><li> Fai una diluizione 1: 100 di coltura durante la notte trasferendo 250 μL di coltura overnight a 25 ml di brodo fresco di LB in un pallone Erlenmeyer da 250 ml sterile. </li><li> Misurare la densità ottica delle colture liquide a 600 nm (OD 600 ) ogni ora a partire dall&#39;inoculazione (T 0 ). </li><li> Incubare una diluizione 1: 100 di coltura durante la notte con aerazione in un incubatore a scuotitore a 225 giri / min fino a 30 h a 37 ° C o fino a raggiungere la massima densità della coltura. </li><li> Grafico OD 600 vs. tempo e utilizzare regressione lineare per determinare il tempo di raddoppio approssimativo per ogni ceppo. </li></ol></li><li> El Tor Biotipo Virulenza Induzione delle Condizioni <ol><li> Striata per singole colonie da scorta congelata su piastre LB agar. Incubare le piastre verso il basso con coperchio, per 12 a 16 ore a 37 ° C. </li><li> Inoculare 10 mL di mezzo AKI contenente 0,03% (w / v) NaHCO 3 con una sola colonia. </li><li> Incubare la coltura senza aerazione a 37 ° C per 3,5 ore. </li><li> Rimuovere 7 mL di coltura e incubare le restanti 3 mL di cultuCon aerazione in un incubatore a scuotitore a 225 giri / min per altri 4 h. </li></ol></li><li> Condizioni di inducimento della virulenza di biotipo classico <ol><li> Striata per singole colonie da scorta congelata su piastre LB agar. Incubare le piastre con il coperchio laterale per 12 a 16 ore a 37 ° C. </li><li> Inoculare 4 mL di liquido LB liquido (pH 6,5) con una singola colonia. </li><li> Incubare con aerazione in un incubatore a scuotitore a 225 giri / min per 12 a 16 h a 30 ° C. </li></ol></li><li> Pellet cella di lavaggio in 1x PBS <ol><li> Pellet 1.8 ml di coltura durante la notte per 2 min per centrifugazione (≥8.600 xg) in un tubo sterile di microcentrifuga da 2 ml e rimuovere il surnatante usando una pipetta. Riposizionare il pellet di cellula in 1,8 ml di 1x PBS pipettando. </li><li> Ripetere la procedura di lavaggio tre volte seguita da una resuspensione finale in 1,8 mL di 1x PBS. </li></ol></li></ol> 3. Caratterizzazione V. Biotipi del colera <ol><li> PSchermate genetiche basate su CR utilizzando ctxB e tcpA <ol><li> Progettare un insieme di primer, che annealizzano circa 50-70 bp a monte ea valle degli start e stop di traslazione di ctxB e tcpA. </li><li> Preparare la coltura durante la notte in brodo LB liquido come precedentemente indicato nel protocollo 2.2. </li><li> Isolare il DNA cromosomico utilizzando un kit commercialmente disponibile per i batteri Gram-negativi. Il DNA cromosomico purificato può essere immagazzinato indefinitamente a -20 ° C. L&#39;isolamento cromosomico del DNA usando i kit disponibili in commercio richiede generalmente circa 4 h. </li><li> Utilizzare un spettrofotometro a micro-volume per assicurare che il campione del DNA cromosomico sia di alta qualità (A 260/280 &gt; 1,8). </li><li> Per ciascun isolamento cromosomico del DNA, preparare le reazioni di polimerasi (PCR) su ghiaccio nel tubo sterile di 200 μl di PCR e amplificare le regioni di ctxB e tcpA usando componenti standard PCR: Taq polimerasi e buFfer (o equivalenti), soluzione dNTP e primer avanti / indietro. Utilizzare parametri standard PCR (~ 3 h). Ad esempio, utilizzare il seguente protocollo: <ol><li> Denatura iniziale a 95 ° C per 120 s. </li><li> Denatura a 95 ° C per 60 s. </li><li> Applicare primer a 60 ° C per 45 s. </li><li> Estendere a 72 ° C per 90 s. </li><li> Ripetere i passaggi da 3.1.5.2 a 3.1.5.4 per 34 cicli. </li><li> Estensione finale 72 ° C per 600 s. </li><li> Tenuta infinita a 4 ° C. </li></ol></li><li> Dye 5 μL di rispettivi prodotti PCR usando un colorante di caricamento a gel di DNA standard 6x e caricare circa 10 μL di scala 1 kb e 10 μL di prodotto PCR su un gel agarosico al 1% in 1x Tris-Borato-EDTA (TBE) buffer. </li><li> Eseguire l&#39;elettroforesi a gel a 130 V finché il frontale del colorante non raggiunge la fine, ma non fuori, del gel (circa 90 minuti). Si consiglia di monitorare costantemente come tensione e tempi di funzionamento possono variare a seconda dell&#39;apparecchiatura. </li><li> Alla verifica delUna amplificazione PCR di successo alla dimensione prevista, purificare il restante 45 μl di prodotto PCR usando un kit di pulizia e concentratore del DNA disponibili in commercio. </li><li> Sequenza di prodotti PCR puliti utilizzando gli stessi primer utilizzati per l&#39;amplificazione PCR e prepararsi secondo le linee guida locali di sequenziamento. </li><li> Confronta il formato FASTA di sequenze di gene da ogni isolato alla sequenza pubblicata disponibile sul sito NCBI (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/gene/), cercando i seguenti numeri di accesso nella casella della query di ricerca. </li><li> CtxB : regione (classica) tra VC0395_A1059 a VC0395_A1060 (El Tor) VC_1456 </li><li> TcpA : (classico) VC0395_A0353 (El Tor) VC_0828 </li></ol></li><li> Analisi fenotipiche per la classificazione di biotipo mediante spotting <ol><li> Preparare la coltura durante la notte in brodo LB liquido come precedentemente indicato nel protocollo 2.2. </li><li> Lavare le pellicole di cellule come specificato nel protocollo 2.6. </li><li> Usare una pipetta aSpot 1 μl di coltura lavata in corrispondente mezzo. Per le specifiche di selezione e incubazione medio, fare riferimento alla Tabella 2. </li></ol></li><li> Analisi della carenza <ol><li> Preparare la coltura durante la notte in brodo LB liquido come precedentemente indicato nel protocollo 2.2. </li><li> Lavare le pellicole di cellule come specificato nel protocollo 2.6. </li><li> Inoculare le piastre di agarità agarico inserendo l&#39;inoculazione dello straccio nella coltura liquida lavata e &quot;pungere&quot; verticalmente nei supporti. In mezzo a ogni inoculazione, sterilizzare il coltello con un bruciatore di Bunsen e, quando pigiate l&#39;agar, assicurati che il pungo inoculato non si piega, in quanto ciò può alterare i risultati. </li><li> Incubare le piastre con il coperchio verso l&#39;alto per 14 a 24 ore a 37 ° C. Dopo 14 ore, controllare le piastre di movimento per evitare la crescita eccessiva di culture. </li></ol></li><li> Analisi Voges-Proskauer (VP) <ol><li> Preparare la coltura durante la notte in brodo LB liquido come precedentemente indicato nel protocollo 2.2. </li><li> Inoculare 4Ml di Voges-Proskauer rosso o rosso di metile, o brodo MR-VP, pipettando 10 μL di coltura overnight in precedenza preparata in 4 mL di brodo MR-VP in un tubo di coltura sterile e incubato con aerazione in un incubatore a scuotitore a 225 giri / min per 12 a 16 H a 37 ° C. </li><li> Aggiungere 150 μl di α-naftolo al 5% (w / v) e 50 μl 40% (w / v) KOH in 1 ml aliquote di coltura overnight di MR-VP in tubi di coltura sterile rispettivamente. </li><li> Brevemente vortice e lasciate stare a temperatura ambiente fino a 4 h fino a quando non cambia colore. </li></ol></li></ol>

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</ol>

Gli autori non hanno niente da rivelare.

Dei oltre 200 identificati V. Colerae, solo O1 e O139 hanno un potenziale epidemico. Il serogroup di O1 può essere suddiviso in due biotipi: classici e El Tor. Tuttavia, sono emersi i ceppi ibridi, denominati varianti El Tor 13 , 17 , che possiedono il background Biotipo El Tor e le caratteristiche classiche del porto 8 , 9 , 10 , 1...

Il colera è una malattia dell&#39;intestino tenue distale causata dal consumo di alimenti contaminati o di acqua contenente il batterio Gram-negativo acquatico Vibrio cholerae . I sintomi del colera includono vomito e diarrea acquosa incontrollabile, portando ad una grave disidratazione che, se non trattata correttamente, provocherà la morte. V. Il colerae può essere diviso in oltre 200 serogruppi basati sulla struttura del lipopolysaccharide O-antigene della superficie cellulare. Tuttavia, solo 2 serogruppi, O1 e O139, hanno mostrato potenziale epidemico o pandemico 1 , 2 . Inoltre, il serogroup O139 è stato principalmente isolato per l&#39;Asia sud-orientale 3 , 4 , mentre il sierogruppo O1 è distribuito in tutto il mondo. Inoltre, il serogroupo O1 può essere diviso in 2 biotipi principali: classici e El Tor. Il biotipo classico era responsabile delle prime 6 pandemie del coleraTra il 1817 e il 1923. La peggiorata settima pandemia è il risultato del biotipo El Tor, che ha spostato globalmente il biotipo classico nell&#39;ambiente 5 , 6 , 7 . Sono stati recentemente presentati ceppi che contengono caratteristiche distintive di biotipi classici e El Tor 8 , 9 , 10 , 11 , 12 , 13 , 14 , 15 , 16 , 17 e da allora sono stati denominati varianti El Tor 13 , 17 . Alcune varianti di El Tor hanno dimostrato elevate capacità di virulenza con una progressione più rapida e grave della malattia rispetto a quanto precedentemente osservato, sottolineandoLa necessità di un approccio più completo all&#39;identificazione degli agenti e alla prevenzione e trattamento delle malattie 8 , 9 , 18 . Mentre l&#39;identificazione del biotipo non impone immediatamente il trattamento, ulteriori progressi nello sviluppo del vaccino e nei futuri agenti terapeutici possono beneficiare della distinzione tra biotipo. La prima serie di protocolli elencati qui consentirà agli investigatori di mantenere correttamente V. Ceppi di colera in un ambiente di laboratorio. La coerenza e l&#39;analisi successiva richiedono la preparazione e la crescita degli stock di isolati, che non dipendono dal biotipo. Tuttavia, per indurre in modo ottimale l&#39;espressione genica di virulenza, sono necessarie tecniche indipendenti di coltura biotipo 19 . Inoltre, la preparazione per diversi dosaggi genetici e biochimici è descritta in questo manoscritto. Tossina del colera (CT) e la tossina co-re(TCP) sono due principali fattori di virulenza controllati dal regolatore master ToxT in entrambi i biotipi del V. Il colerae O1 sierogruppo 20 . CT è una tossina bipartita composta da cinque CtxB Subunità che circondano una singola subunità CtxA ed è responsabile della rapida perdita di elettroliti associata al colera. Il TCP è un pilone di tipo IV codificato dal tcp operon ( tcpABQCRDSTEF ) ed è coinvolto nell&#39;attaccamento e nella colonizzazione dell&#39;intestino tenue distale. TcpA è il primo gene dell&#39;operone tcp che codifica le singole subunità piline essenziali per la costruzione del pilus 8 . La sequenza genica per ctxA è completamente conservata tra biotipi classici e El Tor, mentre ctxB e tcpA si differenziano tra i due biotipi ma sono conservati all&#39;interno di ciascun biotipo 8 . CtxB è completamente conservato tra i biotipi ad eccezione di due posi base(115 e 203). Nel biotipo El Tor, la timina risiede nelle posizioni base 115 e 203, mentre il biotipo classico contiene citosina a queste basi. TcpA è completamente conservato all&#39;interno di ogni biotipo, ma differisce da molteplici basi tra biotipi. Queste distinzioni genetiche servono come marcatori di identificazione biotipo primari, e dopo la sequenza del prodotto di amplificazione della reazione di polimerasi (PCR), inclusi questi siti, le sequenze di isolamento possono essere confrontate con il classico O395 o WT El Tor N16961 di tipo wild (WT) per determinare lo sfondo del biotipo Di CT e TCP rispettivamente, in un dato isolamento di V. cholerae . Numerosi protocolli sono stati sviluppati per caratterizzare le distinzioni fenotipiche tra i biotipi classici e El Tor 21 , 22 , 23 . Polimicina B è un antibiotico peptidico che compromette l&#39;integrità della membrana cellulare esterna in bacTeria e la resistenza alla polimicina B possono essere visualizzati attraverso il saggio di resistenza della polimigina B 21 . Il citrato è un substrato primario del ciclo di Kreb, e la capacità di metabolizzare il citrato come fonte di carbonio unica può essere determinata usando il saggio del metabolismo citrato 22 . HapR codifica un regolatore globale e il regolatore di sensori quorum master in V. cholerae, HapR, che si lega a varie regioni del promotore e regola l&#39;espressione del gene e dell&#39;operone 24 . Alcuni ceppi patogeni di V. cholerae hanno una mutazione in movimento naturale nel gene hapR che ha causato la perdita di questa regolazione dipendente dalla densità dell&#39;espressione genetica di virulenza 24 , 25 . La misurazione dell&#39;attività di proteasi regolata da HapR utilizzando il supporto agarico del latte permette al ricercatore di identificare se un particolare isolato contiene un HapR 23 funzionale. IlI test di hemolysis per una capacità del ceppo di secernere enzimi emolitici che lissano i globuli rossi; Il grado di emolisi può essere visualizzato sulle piastre di agar sangue 23 . La motilità è spesso associata alla virulenza di V. cholerae e può essere analizzata usando le piastre agarico agar 23 . Il test Voges-Proskauer esamina la capacità di uno strain di fermentare il glucosio come una sola fonte di carbonio e produrre l&#39;acetoina sottoprodotto 21 . Con l&#39;emergere di varianti di El Tor, è difficile prevedere i risultati di un determinato dosaggio fenotipico senza estesa screening genotipica e prima di dedurre lo sfondo biotipo di V. Isolati di colerae, si raccomanda di eseguire questo insieme di dosaggi 23 e confrontare i risultati con i ceppi di riferimento come nella tabella 2 . In questo contesto, abbiamo avanzato una serie di protocolli, utilizzando collettivamente l&#39;aforemeI test genotipici e fenotipici per un approccio più completo alla caratterizzazione di V. Biotipi di colera. Inoltre, abbiamo descritto le distinzioni genotipiche e fenotipiche del V noto. Varianti del colerae El Tor (MQ1795 e BAA-2163), rispetto ai ceppi di riferimento di biotipo comunemente usati (WT classico O395, WT El Tor C6706 e WT El Tor N16961, Tabella 1 ). L&#39;emergere di varianti El Tor ha presentato sfide all&#39;affidabilità dei protocolli di individuazione biotipo di singolo dosaggio precedentemente impiegati; Tuttavia, questo sistema di identificazione multipla consentirà una caratterizzazione più affidabile dei criteri clinici e ambientali. Isolati di colera .

<table><tbody><tr><td>1 kb Scala del DNA</td><td>New England Biolabs</td><td>N3232S</td><td>https://www.neb.com/products/n3232-1-kb-dna-ladder</td></tr><tr><td>60% Glicerolo</td><td>Calbiochem</td><td>356352</td><td>http://www.emdmillipore.com/US/en/product/Glycerol%2C-Molecular-Biology-Grade---CAS-56-81-5---Calbiochem,EMD_BIO-356352</td></tr><tr><td>Agar</td><td>Becto, Dickinson e Co.</td><td>214030</td><td></td></tr><tr><td>http://catalog.bd.com/nexus-ecat/getProductDetail?productId=214030&parentCategory=&parentCategoryName=&categoryId=&categoryName=&searchUrl=%2FsearchResults%3Fkeyword%3D214030%26typeOfSearch%3DproductSearch Agar con infuso cervello-cuore</td><td>Becto, Dickinson and Co.</td><td>237500</td><td>http://catalog.bd.com/nexus-ecat/getProductDetail?productId=237500&parentCategory=&parentCategoryName=&categoryId=&categoryName=&searchUrl=%2FsearchResults%3Fkeyword%3D237500%26typeOfSearch%3DproductSearch</td></tr><tr><td>Agarosio</td><td>Peqlab</td><td>732-2789</td><td>https://de.vwr.com/store/catalog/product.jsp?catalog_number=732-2789&_DARGS=/store/cms/de.vwr.com/de_DE/header_2016111711383215.jsp_AF&_dynSessConf=1766917479792147141&targetURL=/store/catalog/product.jsp%3Fcatalog_number%3D732-2789&lastLanguage=en&/vwr/userprofiling/EditPersonalInfoFormHandler.updateLocale=&_D%3AcurrentLanguage=+&currentLanguage=en&_D%3AlastLanguage=+&_D%3A/vwr/userprofiling/EditPersonalInfoFormHandler.updateLocale=+</td></tr><tr><td>Anidro K2HPO4</td><td>Fisher Scientific</td><td>P288-500</td><td>https://www.fishersci.com/shop/products/potassium-phosphate-dibasic-anhydrous-crystalline-powder-certified-acs-fisher-chemical-5/p288500?searchHijack=true&searchTerm=P288500&searchType=RAPID</td></tr><tr><td>Piastre di agar sangue</td><td>Remel</td><td>R01200</td><td>Conservare a 4 gradi C;&nbsp; http://www.remel.com/Catalog/Item.aspx?name=Blood+Agar</td></tr><tr><td>Acido Borico</td><td>Fisher Scientific</td><td>A73-500</td><td>https://www.fishersci.com/shop/products/boric-acid-crystalline-certified-acs-fisher-chemical-6/a73500?searchHijack=true&searchTerm=A73500&searchType=RAPID</td></tr><tr><td>Bromotimolo Blu</td><td>Fisher Scientific</td><td>B388-10</td><td>https://www.fishersci.com/shop/products/bromothymol-blue-certified-acs-fisher-chemical/b38810?searchHijack=true&searchTerm=B38810&searchType=RAPID</td></tr><tr><td>Acido cirtrico &middot; Kit di soluzioni H2O</td><td>Fisher Scientific</td><td>S72836-3</td><td>https://www.fishersci.com/shop/products/citric-acid-monohydrate-4/s728363#?keyword=s728363</td></tr><tr><td>Deossinucleotide (dNTP) New</td><td>England Biolabs</td><td>N0446S</td><td>Conservare a -20 &deg; C;&nbsp; https://www.neb.com/products/n0446-deoxynucleotide-solutionset</td></tr><tr><td>disodico EDTA</td><td>Fisher Scientific</td><td>S311-500</td><td>https://www.fishersci.com/shop/products/ethylenediaminetetraacetic-acid-disodium-salt-dihydrate-crystalline-certified-acs-fisher-chemical-7/s311500?searchHijack=true&searchTerm=S311500&searchType=RAPID</td></tr><tr><td>DNA pulito e Concentratore&commercio; -25 Kit</td><td>Zymo Research</td><td>D4007</td><td>http://www.zymoresearch.com/dna/dna-clean-up/zymoclean-gel-dna-recovery-kit</td></tr><tr><td>GelGreen Colorazione Acido Nucleico</td><td>Biotium</td><td>41005</td><td>https://biotium.com/product/gelgreentm-nucleic-acid-gel-stain-10,000x-in-water/</td></tr> <tr><td>Spettrofotometro Genesys 10SUV-VIS</td><td>Thermo Scientific</td><td>840-208100</td><td>https://www.thermofisher.com/order/catalog/product/840-208100?ICID=search-840-208100</td></tr><tr><td>Gentra Puregene Lievito/Bact. Kit</td><td>Qiagen</td><td></td><td>158567 https://www.qiagen.com/us/shop/sample-technologies/dna/dna-preparation/gentra-puregene-yeastbact-kit/#orderinginformation</td></tr><tr><td>HCl</td><td>Fisher Scientific</td><td>A144-212</td><td>Corrosivo; &nbsp; https://www.fishersci.com/shop/products/hydrochloric-acid-certified-acs-plus-fisher-chemical-10/a144212?searchHijack=true&searchTerm=A144212&searchType=RAPID</td></tr><tr><td>KCl</td><td>Fisher Scientific</td><td>P217-500</td><td>https://www.fishersci.com/shop/products/potassium-chloride-crystalline-certified-acs-fisher-chemical-4/p217500?searchHijack=true&searchTerm=P217500&searchType=RAPID</td></tr><tr><td>KH2PO4</td><td>Fisher Scientific</td><td>P285-500</td><td>https://www.fishersci.com/shop/products/potassium-phosphate-monobasic-crystalline-certified-acs-fisher-chemical-5/p285500?searchHijack=true&searchTerm=P285500&searchType=RAPID</td></tr><tr><td>KOH</td><td>Fisher Scientific</td><td>P250-500</td><td>https://www.fishersci.com/shop/products/potassium-hydroxide-pellets-certified-acs-fisher-chemical-5/p250500?searchHijack=true&searchTerm=P250500&searchType=RAPID</td></tr><tr><td>Le Loop</td><td>Decon Labs Inc.</td><td>MP190-25</td><td>http://deconlabs.com/products/leloop/</td></tr> <tr><td>Le Stab</td><td>Decon Labs Inc.</td><td>MP186-5</td><td>http://deconlabs.com/products/lestab/</td></tr> <tr><td>MgSO4&middot; 7H2O</td><td>Fisher Scientific</td><td>M63-500</td><td>https://www.fishersci.com/shop/products/magnesium-sulfate-heptahydrate-crystalline-certified-acs-fisher-chemical-3/m63500?searchHijack=true&searchTerm=M63500&searchType=RAPID</td></tr><tr><td>Mini-Sub Cell GT Sistema di elettroforesi orizzontale</td><td>Bio Rad Labs</td><td>1704406</td><td>http://www.bio-rad.com/en-us/product/mini-sub-cell-gt-cell?WT.srch=1&WT.mc_id=aw-cbb-NA-sub_cell_systems_brand_gold&WT.knsh_id=7eb1981f-a011-42a3-aece-1236ff453373</td></tr><tr><td>MR-VP Brodo</td><td>Difco</td><td>216300</td><td>http://catalog.bd.com/nexus-ecat/getProductDetail?productId=216300&parentCategory=&parentCategoryName=&categoryId=&categoryName=&searchUrl=%2FsearchResults%3Fkeyword%3Dmr-vp%2Bmedium%26typeOfSearch%3DproductSearch</td></tr><tr><td>Na2HPO4</td><td>Fisher Scientific</td><td>S374-500</td><td>https://www.fishersci.com/shop/products/sodium-phosphate-dibasic-anhydrous-granular-powder-certified-acs-fisher-chemical-5/s374500?searchHijack=true&searchTerm=S374500&searchType=RAPID</td></tr><tr><td>NaCl</td><td>Fisher Scientific</td><td>S271-10</td><td>https://www.fishersci.com/shop/products/sodium-chloride-crystalline-certified-acs-fisher-chemical-6/s27110?searchHijack=true&searchTerm=S27110&searchType=RAPID</td></tr><tr><td>NaHCO3</td><td>Fisher Scientific</td><td>S233-500</td><td>https://www.fishersci.com/shop/products/sodium-bicarbonate-powder-certified-acs-fisher-chemical-5/s233500?searchHijack=true&searchTerm=S233500&searchType=RAPID</td></tr><tr><td>NaNH4HPO4&middot; 4H2O</td><td>Fisher Scientific</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Spettroptometro https://www.fishersci.com/shop/products/sodium-ammonium-phosphate-tetrahydrate-crystalline-certified-fisher-chemical/s218500?searchHijack=true&searchTerm=S218500&searchType=RAPID NanoDrop Lite</td><td>Thermo Scientific</td><td>ND-LITE-PR</td><td>https://www.thermofisher.com/order/catalog/product/ND-LITE-PR?ICID=search-ND-LITE-PR</td></tr><tr><td>Latte scremato in polvere</td><td>Nestlé Garofano</td><td>N/A</td><td>N/A</td></tr><tr><td>Peptone</td><td>Becto, Dickinson and Co.</td><td>211677</td><td>http://catalog.bd.com/nexus-ecat/getProductDetail?productId=211677&parentCategory=&parentCategoryName=&categoryId=&categoryName=&searchUrl=%2FsearchResults%3Fkeyword%3D211677%26typeOfSearch%3DproductSearch</td></tr><tr><td>Piastre di Petri (100 mm x 15 mm)</td><td>Fisher Scientific</td><td>FB0875712</td><td>https://www.fishersci.com/shop/products/fisherbrand-petri-dishes-clear-lid-12/fb0875712#?keyword=FB0875712</td></tr><tr><td>Piastre di Petri (150 mm x 15 mm)</td><td>Fisher Scientific</td><td>FB0875714</td><td>https://www.fishersci.com/shop/products/fisherbrand-petri-dishes-clear-lid-12/fb0875714?searchHijack=true&searchTerm=FB0875714&searchType=RAPID</td></tr><tr><td>Sale solfato di polimixina B</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P1004-10MU</td><td>Conservare a 2-4 gradi C; http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/sial/p1004?lang=en&region=US</td></tr><tr><td>Taq DNA polimerasi</td><td>New England Biolabs</td><td>M0273S</td><td>Negozio a -20 gradi; C; https://www.neb.com/products/m0273-taq-dna-polymerase-with-standard-taq-buffer</td></tr><tr><td>Taq Buffer di reazione</td><td>New England Biolabs</td><td>M0273S</td><td>Negozio a -20 gradi; C;&nbsp; https://www.neb.com/products/m0273-taq-dna-polymerase-with-standard-taq-buffer</td></tr><tr><td>Termociclatore Bio-Rad C1000 Touch&trade; &nbsp;</td><td>Bio Rad Labs</td><td>1840148</td><td>http://www.bio-rad.com/evportal/evolutionPortal.portal?_nfpb=true&_pageLabel=search_page&sfMode=search&sfStartNumber=1&clearQR=true&js=1&searchString=1840148&database=productskus+productcategories+productdetails+abdProductDetails+msds+literatures+inserts+faqs+downloads+webpages+assays+genes+pathways+plates+promotions&tabName=DIVISIONNAME</td></tr><tr><td>Cloruro di trifeniltetrazolio</td><td>Alfa Aesar</td><td>A10870</td><td>https://www.alfa.com/en/catalog/A10870/</td></tr> <tr><td>Tris Base</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP152-1</td><td>https://www.fishersci.com/shop/products/tris-base-white-crystals-crystalline-powder-molecular-biology-fisher-bioreagents-7/bp1521?searchHijack=true&searchTerm=BP1521&searchType=RAPID</td></tr><tr><td>Triptone</td><td>Becto, Dickinson e Co.</td><td>211705</td><td>http://catalog.bd.com/nexus-ecat/getProductDetail?productId=211705&parentCategory=&parentCategoryName=&categoryId=&categoryName=&searchUrl=%2FsearchResults%3Fkeyword%3D211705%26typeOfSearch%3DproductSearch</td></tr><tr><td>Estratto di lievito</td><td>Becto, Dickinson e Co.</td><td>212750</td><td>http://catalog.bd.com/nexus-ecat/getProductDetail?productId=212750&parentCategory=&parentCategoryName=&categoryId=&categoryName=&searchUrl=%2FsearchResults%3Fkeyword%3D212750%26typeOfSearch%3DproductSearch</td></tr><tr><td>&alfa;-naftolo</td><td>MP Biomedicals</td><td>204189</td><td>http://www.mpbio.com/product.php?pid=05204189</td></tr></tbody></table>

tecniche di laboratorio utilizzate per mantenere e differenziare i biotipi di<em&gt; vibrio cholerae</em&gt; isolati clinici ed ambientali

Laboratory Techniques Used to Maintain and Differentiate Biotypes of Vibrio cholerae Clinical and Environmental Isolates

Il batterio Gram-negativo acquatico Vibrio cholerae è l&#39;agente etiologico del colera della malattia gastrointestinale infettiva. A causa della prevalenza e gravità globali di questa malattia, V. Il colera è stato ampiamente studiato sia in ambito ambientale che in laboratorio, che richiede una corretta manutenzione e tecniche di coltura. Classici e El Tor sono due biotipi principali che compongono il V. Colerae O1, ognuno dei quali presenta caratteristiche uniche genotipiche e fenotipiche che forniscono meccanismi affidabili per la caratterizzazione del biotipo e richiedono condizioni distintive di coltura che inducono la virulenza. Indipendentemente dal biotipo del ceppo causale per qualsiasi infezione o focolaio, il trattamento standard per la malattia comprende terapia di reidratazione integrata con un regime di antibiotici. Tuttavia, la classificazione di biotipo può essere necessaria per studi di laboratorio e può avere impatti più ampi nel campo biomedico.Nei primi anni 2000 sono stati identificati isolati clinici che presentano tratti genotipici e fenotipici sia dai biotipi classici che da El Tor. Gli ibridi di nuova identificazione, chiamati El Tor, hanno causato l&#39;identificazione clinica e ambientale del biotipo di isolamento a diventare più complessi rispetto ai precedenti protocolli tradizionali di identificazione singola. Oltre a descrivere V. Le tecniche di mantenimento e tecniche di coltura del colerae, questo manoscritto descrive una serie di schermati genetici basati su PCR basati su gene ( ctxB e tcpA ) e saggi fenotipici (resistenza alla polimicina B, metabolismo citrato, attività proteolitica, attività emolitica, motilità e metabolismo del glucosio tramite Voges- Proskauer) utilizzati collettivamente per caratterizzare e / o distinguere tra biotipi classici e El Tor. Insieme, questi dosaggi forniscono un approccio sistematico efficiente da utilizzare come alternativa o, in aggiunta, a costosi esercizi di intensità lavorativa nella caratterizzazioneDi V. Cholerae isolati clinici (e ambientali).

Per una corretta manutenzione e l&#39;uso di qualsiasi ceppo batterico, è consigliabile conoscere il tempo di raddoppiamento dei ceppi di interesse. Qui, i tassi di crescita variabili dei V comunemente usati. I ceppi del colerae sono stati dimostrati attraverso una curva di crescita e sono stati calcolati approssimativi tempi di raddoppio utilizzando la regressione lineare. Il WT El Tor N16961 e la variante El Tor MQ1795 hanno dimostrato tempi di raddoppio più brevi (~ ...

Questo manoscritto descrive le appropriate tecniche di manutenzione Vibrio cholerae oltre ad una serie di dosaggi biochimici, utilizzati collettivamente per una differenziazione rapida e affidabile tra la clinica e l&#39;ambiente V. Biotipi di colera in un ambiente di laboratorio.

Tecniche di laboratorio utilizzate per mantenere e differenziare i biotipi di<em&gt; Vibrio cholerae</em&gt; Isolati clinici ed ambientali

The aquatic Gram-negative bacterium Vibrio cholerae is the etiological agent of the infectious gastrointestinal disease cholera. Due to the global ...

L'obiettivo generale di questa tecnica è fornire una serie di protocolli semplici da eseguire e in grado di aiutare qualsiasi ricercatore a caratterizzare un isolato clinico o ambientale di Vibrio cholerae. Questo metodo può contribuire a rispondere a domande fondamentali nel campo della batteriologia, come le caratteristiche genotipiche e fenotipiche specifiche di un qualsiasi isolato di Vibrio cholerae, in particolare quelli di rilevanza clinica. Il principale vantaggio di questa tecnica è che consente a qualsiasi ricercatore di utilizzare questa serie di saggi per caratterizzare e distinguere in modo affidabile isolati di Vibrio cholerae di origine clinica o ambientale.Nel complesso, questi saggi forniscono un approccio sistematico da utilizzare come alternativa o in aggiunta a esperimenti costosi e laboriosi, nonché per la caratterizzazione di isolati clinici e ambientali di Vibrio cholerae. Sebbene questo metodo possa fornire informazioni utili per la caratterizzazione dei biotipi di Vibrio cholerae, può essere applicato anche per studiare le capacità biochimiche e metaboliche di altri batteri enterici. In generale, le persone alle prime armi con questa tecnica potrebbero inco

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Quando si lavora con i media e dei reagenti utilizzati per i microrganismi cultura, tecnica asettica deve essere praticato per garantire la contaminazione è ridotto al minimo. Una varietà di metodi di placcatura sono abitualmente utilizzati per isolare, propagare o batteri enumerare e fago, tutte che incorporano procedure che consentono di mantenere la sterilità dei materiali sperimentali.

Tecniche di laboratorio asettico: Metodi Placcatura

Un metodo rapido per modificare il genoma...

TransFLP - un metodo per modificare geneticamente<em&gt; Vibrio cholerae</em&gt; Sulla base di trasformazione naturale e FLP-ricombinazione

Fonte: Yeung, M., et al. Sviluppo di un terreno cromogenico agar più sensibile e specifico per la rilevazione di Vibrio parahaemolyticus e di altre specie di Vibrio . J. Vis. Exp. (2016)Questo video mostra un metodo basato sulla coltura per identificare le specie di Vibrio , evidenziando l'agar cromogenico come un'alternativa più accurata all'agar comunemente usato tiosolfato-citrato-sali biliari-saccarosio o TCBS. L'agar cromogenico fornisce una differenziazione superiore dei ceppi di Vibrio...

Un nuovo mezzo cromogenico per la rilevazione rapida delle specie di vibrioni

Fonte: Brumfield, K. D. et al., Tecniche di laboratorio utilizzate per mantenere e differenziare i biotipi di isolati clinici e ambientali di Vibrio cholerae . J. Vis. Esp. (2017)Questo video mostra la crescita delle colture batteriche in un mezzo liquido. Lo scuotimento favorisce l'aerazione e distribuisce i nutrienti in modo uniforme, supportando una crescita esponenziale e risultando in una sospensione uniforme e metabolicamente attiva, adatta alle applicazioni a valle.

Generazione di colture batteriche pure in un mezzo liquido

Fonte: Brumfield, K. D., et al. Tecniche di laboratorio utilizzate per mantenere e differenziare i biotipi degli isolati clinici e ambientali di Vibrio cholerae . J. Vis. Esp. (2017)Questo video mostra un saggio sull'agar morbido utilizzando cloruro di trifeniltetrazolio per valutare e confrontare la motilità dei ceppi di Vibrio cholerae visualizzando l'attività metabolica attraverso la formazione della red zone attorno alle cellule attivamente migratorie.

Test di motilità per confrontare ceppi di Vibrio cholerae utilizzando cloruro di trifeniltetrazolio

Fonte: Brumfield, K. D., et al., Tecniche di laboratorio utilizzate per mantenere e differenziare i biotipi degli isolati clinici e ambientali di Vibrio cholerae . J. Vis. Esp. (2017).Questo video dimostra il test Voges-Proskauer (VP) per differenziare tra tre biotipi di Vibrio cholerae: classico, tipo selvatico El Tor e variante El Tor. Ogni coltura viene inoculata in un mezzo contenente glucosio, incubata e trattata con α-naftolo e idrossido di potassio per rilevare la presenza di acetoina.

Saggio Voges-Proskauer per la differenziazione dei biotipi di Vibrio cholerae

Fonte: Nag, D., et al. Quantificazione della colonizzazione e della diarrea da Vibrio cholerae nel modello adulto di pesci zebra. J. Vis. Esp. (2018)Questo video dimostra un protocollo per quantificare il carico batterico intestinale negli adulti di pesci zebra infettati da un ceppo resistente agli antibiotici di Vibrio cholerae. Dopo l'eutanasia e la dissezione, il tratto intestinale viene isolato, omogeneizzato con perline di vetro e processato per rilasciare i batteri. L'omogeneato...

Quantificazione del carico batterico intestinale nel pesce zebra infettato da Vibrio cholerae

L'elettroporazione è un metodo comunemente impiegato per introdurre DNA in batteri in un processo noto come trasformazione. Protocolli tradizionali per la preparazione di cellule elettrocompetenti sono in termini di tempo e manodopera. Questo articolo descrive un modo alternativo, rapido ed efficiente metodo per la preparazione di cellule elettrocompetenti attualmente impiegati da alcuni laboratori.

Rapid Protocollo per la preparazione di elettrocompetenti<em&gt; Escherichia coli</em&gt; E<em&gt; Vibrio cholerae</em

Il rilevamento e l'isolamento di specie di Vibrio clinicamente rilevanti richiedono terreni di coltura selettivi e differenziali. Questo studio ha valutato la capacità di un nuovo mezzo cromogenico di rilevare e identificare V. parahaemolyticus e altre specie correlate. Il nuovo mezzo è risultato avere una migliore sensibilità e specificità rispetto al mezzo convenzionale.

Sviluppo di un più sensibile e specifica Chromogenic Agar Media per la rilevazione di<em&gt; Parahaemolyticus Vibrio</em&gt; E Altro<em&gt; Vibrio</em&gt; Specie

Questo protocollo permette al lettore di analizzare la formazione di biofilm indotta da sali biliari in patogeni enterici usando un approccio sfaccettato per catturare la natura dinamica del biofilm batterici valutando l'aderenza, formazione di matrice extracellulare sostanza polimerica, e dispersione.

Formazione di Biofilm indotta da sali biliari in patogeni enterici: tecniche di identificazione e quantificazione

Scopri le tecniche di laboratorio per mantenere e differenziare i biotipi di Vibrio cholerae clinici e ambientali. Questi saggi biochimici offrono un approccio sistematico alternativo ai metodi costosi e laboriosi.

Tecniche di laboratorio utilizzate per mantenere e differenziare i biotipi di

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