Name: Misurare le densità di vetri acquosi a temperature criogeniche (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-06-28T14:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 50 s
Description: Scopri come determinare le densità di vetri acquosi a temperature criogeniche per campioni biologici. Questo metodo consente misurazioni rapide e accurate delle proprietà fisiche di soluzioni crioprotette.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

Questo lavoro è stato supportato dal NSF sotto il premio MCB-1330685. DWM riconosce un sostegno parziale dalla Grant di Formazione Molecolare Biofisica dell&#39;Università Cornell (NIH T32GM0082567).

ATTENZIONE: Prima dell&#39;utilizzo, consultare tutti i fogli di sicurezza relativi ai materiali di sicurezza (MSDS). Utilizzare tutte le pratiche di sicurezza appropriate quando si utilizzano gas compressi, inclusi regolatori e valvole di manipolazione del gas calibrati e tubi approvati del gas. Il contatto con criogenici liquidi può causare gravi lesioni o necrosi. Utilizzare adeguati dispositivi di protezione individuale (scudo a faccia, guanti, cappotto di laboratorio, pantaloni lunghi, scarpe chiuse) che devono essere impermeabili all&#39;azoto liquido. Rimanere in piedi e assicurare un percorso di uscita senza ostacoli dall&#39;apparecchio quando si utilizzano criogenici liquidi. Prestare attenzione ai pericoli di asfissia quando si utilizzano gas compressi e criogenici liquidi e lavorano in un&#39;area ben ventilata con aria adeguata (un cappuccio o una stanza ad alta velocità di rotazione dell&#39;aria). 1. Preparazione di soluzioni acquose per misure di densità NOTA: Poiché i pesi sono più facilmente misurati ad un&#39;alta precisione di volUm, le concentrazioni di soluzione sono misurate in unità w / w. Tutte le densità e le temperature di fusione o di ebollizione assumono una pressione atmosferica di ~ 100 kPa. Le seguenti fasi descrivono la preparazione di una soluzione al glicerolo al 35% in peso. La stessa procedura può essere utilizzata per altre concentrazioni e soluti. <ol><li> Per ogni tipo di soluto e concentrazione di interesse, stimare approssimativamente la massa soluta richiesta per ottenere la concentrazione finale desiderata ( es . Fra il 25% w / w e il 100% w / w) per un volume totale di soluzione, V tot = 10 ml di volume di soluzione . Ad esempio, per una soluzione al glicerolo al 35% in peso ( ρ s = 1,26 g / mL), la massa solida, m s è: <img alt="Equazione" src="/files/ftp_upload/55761/55761eq1.jpg" /> Dove x è la frazione di massa soluto (0,35) e ρ w = 1 g / mL è la densità dell&#39;acqua. </li><li> Inserire un tubo di centrifuga da 15 ml (o altro contenitore impermeabile calibrato in volume) sul tegameDi un microbalance analitico. Dispensare la massa desiderata di soluto / crioprotectante ( es . 3,77 g di glicerolo per una soluzione al 35% w / w) nel tubo e registrare la massa soluta effettiva. </li><li> Aggiungere acqua di deionizzazione ad alta purezza (&gt; 18 MΩ) per portare la massa totale fino a 10.0 g </li><li> Vorticare il contenitore per 30 s (per soluti liquidi) o 5 minuti (per solidi solidi), finché la soluzione è otticamente omogenea. </li><li> Misurare e registrare la massa finale della soluzione. Sigillare il contenitore con un tappo a tenuta stagna e conservare a temperatura costante (293-298 K). </li></ol> 2. Preparazione della camera di raffreddamento del campione <ol><li> Posizionare l&#39;apparecchio sperimentale descritto di seguito in un contenitore e scorrere l&#39;aria secca (&gt; 5% di umidità relativa (rh)) nel contenitore. NOTA: L&#39;involucro può essere un semplice telaio in metallo con i suoi tre e tre lati sigillati con foglio di plastica trasparente e con accesso esperimento tramite un quarto lato rivestito con foglio di plastica flessibile. IndossareScudi a faccia e copertura completa per ridurre al minimo l&#39;umidità introdotta dall&#39;esperto. La condensa di umidità e la formazione di ghiaccio possono interferire con le misurazioni della densità di temperatura criogenica in diversi modi e quindi deve essere minimizzata. </li><li> Posizionare un disco di gomma al neoprene sulla base di un pallone di vetro da 4,5 L di Dewar, per proteggere il pallone Dewar da danni. </li><li> Inserire con cautela un&#39;alta camera di rame di conducibilità termica (un cilindro cavo con fondo sigillato) nel pallone fino a quando si appoggia sul disco di gomma. Regolare i supporti che sporgono verso l&#39;esterno dalla camera alle pareti Dewar in modo che la camera sia centrata e non abbia alcuna tendenza alla roccia. NOTA: Il pallone Dewar manterrà l&#39;azoto liquido e la camera di rame di volume molto più piccola avrà una miscela liquida N 2 -Ar. L&#39;azoto liquido fornisce un bagno termico che mantiene la camera di rame ei suoi contenuti ad una temperatura costante di 77 K e riduce le perdite di ebollizione e evaporativi nella camera. La Camera&amp;#Il piccolo diametro impedisce le onde superficiali che possono interferire con le misurazioni della galleggiabilità e aiuta a isolare il liquido all&#39;interno della camera dal gelo e dal ghiaccio formati altrove nell&#39;apparato. </li><li> Inserire l&#39;uscita di un tubo di gas con gas N2 secco che scorre a ~ 2 L / min fino alla parte inferiore della camera di rame e spurgare la camera d&#39;aria umida. </li><li> Versare lentamente l&#39;azoto liquido nel pallone Dewar, al di fuori della camera di rame, lasciando il tempo per l&#39;ebollizione dell&#39;azoto. NOTA: il livello finale di riempimento, dopo la cottura, è interrotto entro circa 4 cm dalla parte superiore della camera di rame. </li><li> Coprire la parte esterna del pallone Dewar con un coperchio isolante in schiuma anulare. Rimuovere il tubo di spurgo del gas N2 secco dalla camera di rame e inserire in un&#39;apertura corrispondente nel coperchio. NOTA: La combinazione del gas N2 dal boil-off nel pallone Dewar e dal flusso di spurgo esclude qualsiasi aria umida e impedisce la condensazione e la cristallizzazione oN superfici fredde. </li><li> Versare lentamente l&#39;azoto liquido nella camera di rame. Il livello finale di riempimento, dopo la bollitura, è interrotto, dovrebbe essere di circa 4 cm dalla parte superiore della camera di rame. </li><li> Posizionare un foglio di plastica sottile e trasparente sull&#39;apertura centrale o sfiato nel coperchio e ridurre la portata di gas N 2 a ~ 0,2 L / min, lasciando una leggera sovrapressione del gas N2 all&#39;interno degli spazi di gas sopra i liquidi criogenici. NOTA: fintanto che i liquidi criogenici sono presenti nel Dewar e nella camera, continuare a regolare il flusso del gas N 2 , come necessario per mantenere questa sovrapressione e impedire l&#39;ingresso dell&#39;acqua nel Dewar e formare ghiaccio. </li></ol> 3. Determinazione del volume e della densità della massa di prova a T = 298 K e T = 77 K <ol><li> Determinare la massa apparente di una massa di prova di PTFE da 1 a 0.4 mL ( Tabella dei materiali ) in aria a T = 298 K, posizionandola sulla padellaDi un microbalance analitico calibrato. </li><li> Determinare il volume V (298 K) della massa di prova a T = 298 K utilizzando un picnometro a gas o per misure dimensionali con caliper. Se si utilizzano misure dimensionali, la massa di prova deve avere una forma semplice e precisa (senza fori o angoli arrotondati) e deve essere determinato il volume del foro passante (per la linea di sospensione). </li><li> Calcolare la massa m della massa di prova correggendo la massa apparente misurata per la forza di galleggiamento esercitata dall&#39;aria secondo quanto segue: <img alt="Equazione" src="/files/ftp_upload/55761/55761eq2.jpg" /> Dove ρ aria = 1,23 g / L (correzione ~ 0,1%). </li><li> Posizionare il microbalance su una piattaforma stabile circa 10 cm sopra il pallone Dewar e verificarne la taratura. Sospendere la massa di prova usando una linea monofilamento da 2 mil (50 μm) attaccata dal gancio sul lato inferiore del microbalance (progettato per misurare le misure di massa) e lanciareUn foro nella massa di prova. Determinare la massa apparente in aria e confrontare con la misurazione nel punto 3.3, correggendola come necessario per la massa della linea. </li><li> Determinare il volume V (77 K) della massa di prova a T = 77 K misurando la sua massa apparente in azoto liquido puro, m in LN2 . Abbassare la massa di prova nell&#39;azoto liquido all&#39;interno della camera di rame finché non sia completamente sommersa. Quando la bollitura è cessata, misurare la massa apparente. NOTA: Se l&#39;azoto liquido nella camera di rame è fermo e le correnti d&#39;aria tra il microbalance e la superficie liquida sono minime, questa massa può essere misurata con una precisione superiore a ± 0,0002 g. </li><li> Valutare la forza di galleggiamento sulla parte sommersa della linea e verificare che sia piccola rispetto agli errori di misura. </li><li> Calcolare il volume e la densità della massa di prova a 77 K utilizzando la relativa massa m nota e la massa apparente misurata in LN2 a 77 K, m app iN LN2, secondo quanto segue: <img alt="Equazione" src="/files/ftp_upload/55761/55761eq3.jpg" /> Dove ρ LN2 ( 77 K) = 0.807 g / mL. </li></ol> 4. Preparazione della Miscela Liquida N 2 -Ar iniziale <ol><li> Flusso Ar gas ad una portata di ~ 2 L / min attraverso un tubo avvolto a sua uscita. Posizionare il tubo avvolto sopra le guide superiori che stabilizzano la posizione della camera di rame, appena sopra il livello dell&#39;azoto liquido e sotto la superficie superiore del Dewar. Gas freddi N 2 e Ar si accumuleranno sopra i liquidi criogenici, e la conduzione termica, la convezione e la radiazione raffreddano il tubo e il gas Ar all&#39;interno. </li><li> Dopo aver lasciato raffreddare il tubo avvolto per 5 minuti, posizionare l&#39;uscita del tubo nella camera di rame, almeno 10 cm sotto la superficie dell&#39;azoto liquido. Quindi coprire il Dewar con il coperchio anulare e il foglio trasparente. </li><li> Regolare la portata Ar fino ad aumentare le bolle di ArDalla presa del tubo alla superficie superiore dell&#39;azoto liquido. Quindi ridurre la portata fino a quando le bolle si formano all&#39;uscita, ma si dissolvono o liquefatti appena prima di rompere la superficie dell&#39;azoto liquido. NOTA: Quando aumenta la concentrazione di Ar nella camera di rame, regolare periodicamente la velocità di flusso Ar per mantenere la formazione di bolle. Se la portata Ar è troppo bassa, l&#39;Ar può bloccarsi all&#39;interno del tubo e bloccare il flusso. </li><li> Aggiungere l&#39;azoto liquido come necessario per mantenere il suo livello nel Dewar circostante. Rimuovere il ghiaccio mentre si accumula sulle superfici fredde. </li><li> Mescolare periodicamente il liquido inserendo un sottile foglio di fogli di rame ( ad esempio , 35 micron), circondato da un sottile strato isolante nella camera di rame e spostandolo lentamente verso l&#39;alto e verso il basso come un pistone. Ciò ridurrà i gradienti di concentrazione e la tendenza ad Ar di cristallizzarsi fuori dalla soluzione. </li></ol> 5. Misurazione e regolazione della densità della miscela iniziale N 2 -Artura <ol><li> Calcolare la densità di bersaglio per la miscela N 2 -Ar misurando la densità T = 77 K del campione da misurare, ad esempio , misure a concentrazioni più elevate del componente non acquoso del campione. </li><li> Fissare la massa di prova utilizzando la linea monofilamento al gancio sul lato inferiore della vaschetta di misurazione del microbalance, misurare la sua massa apparente in aria e confermare l&#39;accordo con la misura nel punto 3.1. </li><li> Mescolare la soluzione N 2 -Ar per eliminare gradienti di concentrazione e densità come al punto 4.5. </li><li> Portare la massa di prova a T = 77 K abbassandola nell&#39;azoto liquido al di fuori della camera di rame. Sollevare la massa di prova nello strato freddo di gas azotato sopra l&#39;azoto liquido, aspettare che l&#39;azoto liquido residuo venga evaporato dalla massa di prova e quindi abbassare la massa di prova fredda e secca nella miscela N2 -Ar finché non sia completamente sommersa Entro 2 cm dalla superficie liquida. </li><li&gt; Dopo che le onde di ebollizione e di superficie sono scomparse, misurare la massa apparente della massa di prova. Calcolare la densità della soluzione usando la sua vera massa m e T = 77 K volume V (77K) dal punto 3.7 come segue: <img alt="Equazione" src="/files/ftp_upload/55761/55761eq4.jpg" /></li><li> Aumenta la densità della soluzione scorrendo Ar supplementare fino a ottenere la densità iniziale desiderata. Le gocce di campione che il lavandino possono facilmente essere perse, quindi la densità iniziale dovrebbe essere almeno un paio di percentuale superiore alla densità di campione prevista. Il campione sarà quindi fluttuante, rendendolo più facile da tenere traccia e la densità di miscela N 2 -Ar sarà quindi solo necessaria per essere regolata verso il basso aggiungendo liquido N 2 . </li><li> Rimuovere il tubo avvolgibile di precarica Ar e lasciare che si riscaldi e asciughi prima dell&#39;uso successivo. </li></ol> 6. Gocce di raffreddamento di soluzione campione <ol><li> Immediatamente prima di erogare l&#39;erogazione e raffreddare, ripetere il passo 1.5 a miX il liquido criogenico dell&#39;azoto / argon. Fare attenzione a non introdurre bolle. </li><li> Rimuovere il cappuccio ermetico del tubo di campionamento. Usando una siringa pulita da 1 ml, estrarre fino a 1 ml di soluzione e sostituire il tappo. Fissare un ago da 27 a 33 G sulla siringa e quindi spingere una piccola quantità di campione attraverso l&#39;ago per espellere l&#39;aria e tutti i residui della precedente erogazione. </li><li> Due metodi possono essere utilizzati per proiettare gocce di campioni nella miscela N 2 -Ar. <ol><li> Per i campioni con grandi concentrazioni di componenti non acquose (&gt; 45% w / w) che possono essere vitrificate con modeste velocità di raffreddamento, premere leggermente la siringa per spostare un diametro piccolo (da 250 μm a 1 mm), ~ 10 nL a una goccia di 1 μl Che appende dalla punta dell&#39;ago per tensione superficiale. Toccare delicatamente l&#39;ago per staccare e proiettare la goccia verso la miscela liquida N 2 -Ar. </li><li> Per i campioni che richiedono un raffreddamento più veloce per la vitrificazione, posizionare l&#39;uscita di un tubo di gas collegato ad un generatore di vuotoO (fornito da aria compressa in laboratorio) nello spazio del gas sopra la miscela liquida N 2 -Ar e aspira delicatamente lo strato di gas freddo che forma. Ciò aumenta i tassi di raffreddamento per piccoli campioni 11 . <ol><li> Toccare con cautela la punta dell&#39;ago a una striscia di polimero trasparente di 25-75 μm per distribuire un piccolo volume (&lt;10 nL, corrispondente a un diametro di goccia &lt;200 μm) di campione. NOTA: per ottenere le gocce più piccole, quasi sferiche e facilmente rimosse, immergere la striscia in una soluzione di rivestimento idrofoba per 10 min e lasciare asciugare prima dell&#39;erogazione del campione. </li><li> Afferrare la striscia usando una barra di plastica o di legno attaccata e immergere manualmente l&#39;asta più la striscia nella miscela liquida N 2 -Ar. </li><li> Una volta che la goccia è solidificata e la bollitura è cessata, afferrare il bordo della striscia di fronte all&#39;asta utilizzando le pinzette. Fissare la striscia, mantenendola immersa nel liquido N 2 -Ar, finché la goccia di campione scompare e galleggia al surfasso. </li></ol></li></ol></li></ol> 7. Valutazione dello stato del campione <ol><li> Utilizzando una lunga distanza di lavoro (5-10 cm) di microscopio binoculare e un&#39;illuminazione luminosa e fresca da un LED o da un illuminatore a fibre ottiche, esaminare attentamente la goccia mantenendola immersa nel liquido N 2 -Ar. Le gocce vitrificate devono apparire chiare 12 , 13 . Rifiutare le gocce nocive o nuvolose (probabilmente contenenti più di una fase) e / o che mostrano imperfezioni ottiche, incluse le crepe (che possono essere associate a vuoti che modificano la densità media). NOTA: la verniciatura della superficie interna della camera di rame per fornire uno sfondo nero può facilitare l&#39;identificazione delle imperfezioni del campione. </li></ol> 8. Determinazione della densità del campione <ol><li> La goccia dispensata inizialmente gallegherà, sprofonda o (raramente) sarà neutrale in galleggiante nella miscela N 2 -Ar.A volte le gocce galleggianti possono essere tese da tensioni superficiali, piccole bolle o particelle di ghiaccio aderenti. Ispezionare l&#39;intera superficie di goccia con il microscopio. Spostare la goccia verso il basso dalla superficie del liquido usando una piccola plastica o legno in legno pre-refrigerato (2-3 mm di diametro, 10 cm) e osservare la sua risposta. </li><li> Se la goccia scende, aumentare la densità del liquido N 2 -Ar utilizzando la procedura nel punto 4 finché la goccia diventa neutrale o galleggia. </li><li> Se la goccia fluttua, diminuire la densità del liquido N 2 -Ar aggiungendo l&#39;azoto liquido usando un cryovial da 1,8 ml. A grandi densità di miscela iniziali (1,2-1,3 g / mL), l&#39;aggiunta di N2 in incrementi di 1 mL dà notevoli cambiamenti di densità, ma questo dovrebbe essere aumentato verso 5 mL a bassa densità (0,8-0,9 g / mL). Mescolare delicatamente il N 2 -Ar (in modo da non perdere la traccia della goccia di campione) usando la sottile fogli di foglio di rame perforata in alto e in basso nella camera di rame. </li><li> Dopo ogni aggiunta di N 2, Utilizzare una piccola barra pre-raffreddata per spostare delicatamente la goccia fluttuante verso il basso nel liquido e osservare la sua velocità tornando alla superficie. </li><li> Quando la densità della soluzione è stata regolata in modo che la goccia sembri essere neutrale o ascenda molto lentamente (&lt;50 μm / s garantirà una precisione di densità dello 0,1% o superiore per gocce con volumi fino a 50 pL) Ar come descritto al passaggio 5. Quindi aggiungere liquido addizionale N 2 fino a quando la goccia inizia innanzitutto a scendere lentamente e misurare nuovamente la densità della miscela N 2 -Ar. Queste due misure forniranno limiti alla densità di goccia. </li></ol>

<ol><li>Fahy, G. M., Wowk, B. <a target="_blank" href="https://link.springer.com/protocol/10.1007%2F978-1-4939-2193-5_2">Principles of Cryopreservation by Vitrification.</a> Cryopreservation and Freeze-Drying Protocols. , 21-82 (2015).</li>
<li>Nagy, Z. P., Nel-Themaat, L., Chang, C. -C., Shapiro, D. B., Berna, D. P. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/24782022">Cryopreservation of eggs.</a> Human Fertility: Methods and Protocols. , 439-454 (2014).</li>
<li>Kriminski, S., Caylor, C. L., Nonato, M. C., Finkelstein, K. D., Thorne, R. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Flash+cooling+and+annealing+of+protein+crystals%5BTitle%5D)+AND+%22Acta+Cryst+Sect+D%22%5BJournal%5D)">Flash cooling and annealing of protein crystals.</a> Acta Cryst Sect D. 58 (3), 459-471 (2002).</li>
<li>Juers, D. H., Matthews, B. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Reversible+lattice+repacking+illustrates+the+temperature+dependence+of+macromolecular+interactions%5BTitle%5D)+AND+%22J+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">Reversible lattice repacking illustrates the temperature dependence of macromolecular interactions.</a> J Mol Biol. 311 (4), 851-862 (2001).</li>
<li>Juers, D. H., Matthews, B. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cryo-cooling+in+macromolecular+crystallography%3A+advantages%2C+disadvantages+and+optimization%5BTitle%5D)+AND+%22Q+Rev+Biophys%22%5BJournal%5D)">Cryo-cooling in macromolecular crystallography: advantages, disadvantages and optimization.</a> Q Rev Biophys. 37 (2), 105-119 (2004).</li>
<li>Alcorn, T., Juers, D. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Progress+in+rational+methods+of+cryoprotection+in+macromolecular+crystallography%5BTitle%5D)+AND+%22Acta+Cryst+Sect+D%22%5BJournal%5D)">Progress in rational methods of cryoprotection in macromolecular crystallography.</a> Acta Cryst Sect D. 66 (4), 366-373 (2010).</li>
<li>Warkentin, M., Sethna, J., Thorne, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Critical+Droplet+Theory+Explains+the+Glass+Formability+of+Aqueous+Solutions%5BTitle%5D)+AND+%22Phys+Rev+Lett%22%5BJournal%5D)">Critical Droplet Theory Explains the Glass Formability of Aqueous Solutions.</a> Phys Rev Lett. 110 (1), 15703(2013).</li>
<li>Kriminski, S., Kazmierczak, M., Thorne, R. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Heat+transfer+from+protein+crystals%3A+implications+for+flash-cooling+and+X-ray+beam+heating%5BTitle%5D)+AND+%22Acta+Cryst+Sect+D%22%5BJournal%5D)">Heat transfer from protein crystals: implications for flash-cooling and X-ray beam heating.</a> Acta Cryst Sect D. 59 (4), 697-708 (2003).</li>
<li>Loerting, T., Bauer, M., Kohl, I., Watschinger, K., Winkel, K., Mayer, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cryoflotation%3A+Densities+of+amorphous+and+crystalline+ices%5BTitle%5D)+AND+%22J+Phys+Chem+B%22%5BJournal%5D)">Cryoflotation: Densities of amorphous and crystalline ices.</a> J Phys Chem B. 115 (48), 14167-14175 (2011).</li>
<li>Shen, C., Julius, E. F., Tyree, T. J., Moreau, D. W., Thorne, R. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Thermal+contraction+of+aqueous+glycerol+and+ethylene+glycol+solutions+for+optimized+protein-crystal+cryoprotection+Thermal+contraction+of+aqueous+glycerol+and+ethylene+glycol+solutions+for+optimized+protein-crystal+cryoprotection%5BTitle%5D)+AND+%22Acta+Cryst+Sect+D%22%5BJournal%5D)">Thermal contraction of aqueous glycerol and ethylene glycol solutions for optimized protein-crystal cryoprotection Thermal contraction of aqueous glycerol and ethylene glycol solutions for optimized protein-crystal cryoprotection.</a> Acta Cryst Sect D. 72 (6), 742-752 (2016).</li>
<li>Warkentin, M., Berejnov, V., Husseini, N. S., Thorne, R. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hyperquenching+for+protein+cryocrystallography%5BTitle%5D)+AND+%22J+Appl+Cryst%22%5BJournal%5D)">Hyperquenching for protein cryocrystallography.</a> J Appl Cryst. 39 (6), 805-811 (2006).</li>
<li>McFerrin, M. B., Snell, E. H. <a target="_blank" href="http://scripts.iucr.org/cgi-bin/paper?S0021889802009238">The development and application of a method to quantify the quality of cryoprotectant solutions using standard area-detector X-ray images.</a> J Appl Cryst. 35 (5), 538-545 (2002).</li>
<li>Chinte, U., Shah, B., DeWitt, K., Kirschbaum, K., Pinkerton, A. A., Schall, C. <a target="_blank" href="http://scripts.iucr.org/cgi-bin/paper?S0021889805005029">Sample size: An important parameter in flash-cooling macromolecular crystallization solutions.</a> J. Appl. Cryst. 38 (3), 412-419 (2005).</li>
<li>Bosart, L. W., Snoddy, A. O. <a target="_blank" href="http://pubs.acs.org/doi/abs/10.1021/ie50228a032">Specific gravity of glycerol.</a> Ind Eng Chem. 20 (12), 1377-1379 (1928).</li>
<li>Rodrigues, M., Francesconi, A. Z. <a target="_blank" href="https://link.springer.com/article/10.1007/s10953-011-9756-5">Experimental study of the excess molar volumes of binary and ternary mixtures containing water + (1,2-ethanediol, or 1,2-propanediol, or 1,3-propanediol, or 1,2-butanediol) + (1-n-butyl-3-methylimidazolium bromide) at 298.15 K and atmospheric pressure.</a> J Solution Chem. 40 (11), 1863-1873 (2011).</li>
<li>Berejnov, V., Husseini, N. S., Alsaied, O. A., Thorne, R. E. <a target="_blank" href="http://scripts.iucr.org/cgi-bin/paper?do5023">Effects of cryoprotectant concentration and cooling rate on vitrification of aqueous solutions.</a> J Appl Cryst. 39 (2), 244-251 (2006).</li>
<li>Meisburger, S. P., Warkentin, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Breaking+the+Radiation+Damage+Limit+with+Cryo-SAXS%5BTitle%5D)+AND+%22Biophys+J%22%5BJournal%5D)">Breaking the Radiation Damage Limit with Cryo-SAXS.</a> Biophys J. 104 (1), 227-236 (2013).</li>
</ol>

Gli autori non hanno nulla da rivelare.

Gli attuali apparecchi e metodi, sviluppati principalmente da studenti universitari con accesso limitato a strumenti e macchine per la costruzione di strumenti, forniscono tuttavia misurazioni di densità estremamente accurate per singole gocce di liquidi minori di 50 pL. Nel campo di concentrazione vicino e al di sopra del 50% in peso, dove piccoli tassi di raffreddamento sono sufficienti per ottenere campioni vetrificati, le densità sono d&#39;accordo con quelle ottenute nelle precedenti misurazioni sui campioni di mas...

Le proprietà fisiche dell&#39;acqua e delle miscele acquose nelle loro varie fasi sono di interesse fondamentale e sono importanti per la comprensione in vivo e in vitro dei sistemi biologici. Nella criobiologia contemporanea e nella crioconservazione biologica sono particolarmente interessanti le fasi vitreose o amorfe di miscele crioprotectanti acquose 1 , 2 . La nucleazione e la crescita dei cristalli di ghiaccio possono interrompere le cellule e i tessuti e promuovere la denaturazione e l&#39;aggregazione delle proteine, per cui i protocolli di crioconservazione che vitrificano il solvente sono diventati sempre più popolari. Nella cristallografia biomolecolare, la cristallizzazione del solvente nei canali tra biomolecole distrugge i cristalli di cristallo e degrada le proprietà di diffrazione. La vitrificazione viene ottenuta attraverso una combinazione di rapido raffreddamento, disidratazione e aggiunta di solventi crioprotettori quali glicerolo, glicole etilenico, glicoli polietilenici (PEG),Alcoli e sali. Vitrificazione limita la cristallizzazione e la crescita del ghiaccio, ma non elimina tutti i danni provenienti dal raffreddamento. Per esempio, la mosaicità di cristallo (una misura della distribuzione degli orientamenti del piano di cristallo) aumenta regolarmente di un fattore da 10 a 100 quando i cristalli proteici vengono raffreddati in uno stato vitrificato 3 e i tassi di sopravvivenza post-dissolti delle cellule spermatiche e degli ovociti vitrificati variano ampiamente . Un meccanismo di danno è la contrazione differenziale del solvente e del materiale circostante durante il raffreddamento 3 , 4 , 5 . Il solvente di equilibrio e le concentrazioni di soluto all&#39;interno di un cristallo, di una cellula o di un tessuto dipendono dalla temperatura e il solvente più il soluto e il materiale circostante possono contrattare per quantità diverse. Il raffreddamento rapido può impedire la ridistribuzione del solvente e del soluto prima della vitrificazione e dei contratti differenziali<html> Può provocare grandi sollecitazioni inhomogenei e non equilibri che causano danni al campione. Gli approcci razionali per la riduzione dei danni causati dal raffreddamento potrebbero quindi beneficiare della conoscenza delle densità dipendenti dalla temperatura delle miscele acquose liquide e vetrificate. A concentrazioni di solventi superiori al 50% del soluto al peso della soluzione (w / w), la maggior parte delle miscele crioprotectanti acquose possono essere vitrificate con modesti tassi di raffreddamento di 10 K / s o meno, permettendo la produzione e la misurazione di densità utilizzando grandi campioni di vitreo 6 . La densità può quindi essere determinata usando il principio di Archimede, misurando il peso apparente del campione quando sospeso in un criogenico liquido come l&#39;azoto. Tuttavia, poiché la concentrazione del soluto diminuisce, i tassi di raffreddamento richiesti per la vitrificazione aumentano rapidamente: i tassi di raffreddamento per le miscele acquose di glicole aumentano da &lt;10 K / s al 50% di soluto in g al volume di soluzione in ml (v / v) a&gt; 1.000 K / s al 25% in pesoAss = &quot;xref&quot;&gt; 7. Il trasferimento di calore diventa limitato per i livelli di confine, in modo che raggiungere grandi velocità di raffreddamento richiedano campioni più piccoli e minori 8 . Le misure della densità dell&#39;acqua e del ghiaccio puro sono state ottenute depositare gocce di diametro del micrometro (volume femtolitore) in un vuoto su una superficie criogenica raffreddata in modo da costruire un campione macroscopico (massa grammaticale). La densità di questo campione è stata determinata mediante crioflotazione in una miscela di azoto-argon liquido in cui è stata regolata la densità del liquido criogenico fino a quando il campione è diventato neutrale 9 . Tuttavia, generare grandi campioni da un gran numero di piccole gocce in modo da ridurre al minimo i volumi vuoti - una fonte importante di errore nelle precedenti misurazioni di densità di fase in vitreo - non è banale. Per miscele acquose, l&#39;evaporazione differenziale dei componenti della soluzione durante l&#39;aerosolizzazione e la deposizione in un vuoto può portare aConsistenti incertezze nelle concentrazioni depositate. Abbiamo sviluppato un metodo basato su crioflotazione che consente una precisa determinazione della densità di miscele acquose utilizzando singole gocce minori di 50 pL 10 . Queste gocce possono essere rapidamente raffreddate pur mantenendo le loro concentrazioni originali e il loro stato di temperatura criogenica (vetrificato o cristallino) può essere valutato utilizzando un semplice test visivo correlato alle misure di diffrazione del raggio X. Questo metodo è ampiamente applicabile a miscele acquose e non acquose e può essere esteso ad una varietà di campioni biologici, incluse le cellule ( ad es . Stelo e uovo), campioni di tessuto e cristalli proteici aventi densità a bassa temperatura tra 0,8 e 1,4 g / mL.

<table><tbody><tr><td>provetta da centrifuga</td><td>Falcon</td><td>6029236</td><td>15 mL provetta da centrifuga conica</td></tr><tr><td>glicerolo, >99,5%</td><td>Sigma&nbsp;</td><td>G9012-100 mL</td><td></td></tr> di <tr><td>glicole etilenico, >99,8%</td><td>Sigma</td><td>324558-100 mL</td><td></td></tr> di <tr><td>microbilancia analitica</td><td>Mettler</td><td>AE240</td><td>Bilancia analitica, risoluzione 0,01 mg, con gancio sul fondo per pesare sotto la bilancia&nbsp;</td></tr><tr><td>vortexer</td><td>Scientific Industries</td><td>SI-0236</td><td>Vortex-Genie 2</td></tr><tr><td>Apparecchio intelaiatura della custodia</td><td>Unistrut&nbsp;</td><td>1-5/8" intelaiatura in metallo</td><td>48" di larghezza x 24" di profondità x 40" di altezza&nbsp;</td></tr><tr><td>Barriera d'aria per l'armadio dell'apparecchio</td><td></td><td></td><td>qualsiasi foglio di plastica trasparente disco</td></tr><tr><td>di gomma</td><td></td><td></td> in neoprene diametro 4", pallone dewar <td>da 1/8" di spessore</td></tr><tr><td></td><td>Scilogix Dilvac</td><td>SS333</td><td>pallone dewar da 4,5 litri con custodia in acciaio e coperchio a morsetto</td></tr><tr><td>camera</td><td></td><td></td> <td>in rameQuesta parte fabbricata è composta da un tubo di rame da 1,43" di diametro, 0,017" di spessore della parete con una solida base cilindrica in rame saldata per sigillare un'estremità. La base in rame è alta 0,87" e l'altezza complessiva della camera è di 7".</td></tr><tr><td>gas azoto</td><td>Airgas</td><td>NI HP300</td><td>99.998% puro gas N2</td></tr><tr><td>gas argon Airgas</td><td></td><td>AR HP300</td><td>99.998% puro Ar</td></tr><tr><td>gas rotametro</td><td>Omega</td><td>FL3692ST</td><td>2.52 L/min portata max portata</td></tr><tr><td>schiuma coperchio</td><td></td><td></td> isolante <td>Questa parte è fabbricata da 4 lb/ft3 schiuma di polietilene reticolato (fornita da Technifab, 1355 Chester Industrial Parkway, Avon, OH), e ha un diametro esterno di 2,42", e un diametro interno di 1,52", e uno spessore di 0,79". &nbsp; &nbsp; &nbsp;</td></tr><tr>Massa <td></td><td></td><td>di prova in PTFE</td><td>Questa parte fabbricata è un cilindro di 0,246" di diametro, alto 0,580" con un foro di 0,060" di diametro che corre perpendicolarmente e interseca l'asse del cilindro ~0,10" da un'estremità.</td></tr><tr><td>Piattaforma microbalance</td><td>Unistrut</td><td>1-5/8" telaio</td><td>metallico 11" di larghezza x 24" di lunghezza x 24" di altezza telaio rettangolare con un foglio di alluminio superiore contenente un foro per il monofilamento e la massa di prova sospesa</td></tr><tr><td>2 mil (50 um) linea monofilamento</td><td>Berkley</td><td>NF1502-CM</td><td>Nanofil lenza</td></tr><tr><td>Tubo della bobina di preraffreddamento dell'argon</td><td>VWR</td><td>60985-512</td><td>1/8" ID x 1/4" OD Tubo</td></tr> <tr><td>in PVCMiscelatore</td><td></td><td></td> di fogli di rame perforati <td>Diametro 1,4", disco di rame spesso 35 micron, tagliato da 1 oncia/ft2 foglio di rame e perforato con fori utilizzando un punteruolo o un altro strumento appuntito. Inserire al centro un'asta rigida termoisolante (plastica o legno) di 1-2 mm di diametro e fissarla con resina epossidica secondo necessità.</td></tr><tr><td>siringa</td><td>BD</td><td>309628</td><td>1 mL Luer-Lok tip siringa</td></tr><tr><td>generatore di vuoto</td><td>Gast</td><td>VG-015-00-00</td><td>aria compressa venturi monostadio</td></tr> generatore <tr><td>di vuoto spray per rivestimento idrofobico</td><td>RainX</td><td>620036</td><td>plastica idrorepellente</td></tr><tr><td>lunga lunghezza focale stereomicroscopio</td><td>Bausch and Lomb Stereozoom 6</td><td></td><td>0,67-4 x zoom pod con oculari 20X, distanza di lavoro di 10 cm& nbsp;</td></tr><tr><td>Illuminatore anulare a LED</td><td>Amscope</td><td>LED144S</td><td></td></tr><tr><td>Illuminatore spot a LED</td><td>Newhouse Lighting</td><td>NHCLP-LED</td><td>3W LED a collo d'oca clamp lampada</td></tr><tr><td>1,8 ml fiala criogenica</td><td>Nunc</td><td>V7634-500EA</td><td>Qualsiasi crioviale da 1,8 o 2 mL è adeguato</td></tr></tbody></table>

misurare le densità di vetri acquosi a temperature criogeniche

Measuring the Densities of Aqueous Glasses at Cryogenic Temperatures

Abbiamo dimostrato un metodo per determinare le densità di temperatura criogenica a fase vitrea di miscele acquose e altri campioni che richiedono un raffreddamento rapido, per preparare la fase di temperatura criogenica desiderata. I microlitri a gocce di dimensioni del picoliter vengono raffreddate proiettando in una miscela di azoto liquido (N 2 -Ar). La fase di temperatura criogenica della goccia viene valutata usando un test visivo correlato alle misure di diffrazione del raggio X. La densità della miscela liquida N 2 -Ar viene regolata aggiungendo N 2 o Ar finché la goccia diventa neutrale. La densità di questa miscela e quindi della goccia è determinata usando una massa di prova e il principio di Archimede. Con la cura appropriata nella preparazione della goccia, la gestione del gas sopra la miscela criogenica liquida per ridurre al minimo la gelosia e la miscelazione regolare della miscela criogenica per prevenire la stratificazione della densità e la separazione di fase, le densità accurate a &lt;0,5% di gocce minori di 50 pLFacilmente determinato. Le misurazioni sulle miscele crioprotettanti acquose permettono di conoscere l&#39;azione crioprotrattante e fornire dati quantitativi per facilitare la corrispondenza della contrazione termica nella crioconservazione biologica.

Le misure di densità a T = 77 K per le gocce vitrificate di glicerolo acquoso e di glicole etilenico rispetto alla concentrazione di crioprotectant sono riportate rispettivamente in Figura 1 A e Figura 1 B e la corrispondente variazione del volume specifico tra T = 298 K e 77 K, calcolata utilizzando precedentemente Determinato T = 298 K densità, è mostrato in <strong ...

Viene descritto un protocollo per la determinazione delle densità di fase vitrea di gocce di dimensioni micro-pico-litri di miscele acquose a temperature criogeniche.

Misurare le densità di vetri acquosi a temperature criogeniche

We demonstrate a method for determining the vitreous phase cryogenic temperature densities of aqueous mixtures, and other samples that require rapid ...

L'obiettivo generale di questo esperimento è determinare le densità allo stato vetroso o vetreo di soluzioni acquose a temperature criogeniche. Questo metodo può contribuire a rispondere a domande fondamentali nei campi della criobiologia e della criocristallografia, ad esempio quanto si contraggono o si espandono le miscele acquose crioprotette quando vengono raffreddate fino a raggiungere uno stato vetreo a temperature criogeniche. Il principale vantaggio di questa tecnica è che sia la densità del campione a temperatura criogenica sia la fase possono essere determinate utilizzando campioni di piccole dimensioni che possono essere raffreddati rapidamente.Sebbene questo metodo sia stato sviluppato per soluzioni crioprotettive, può essere utilizzato anche per determinare le densità criogeniche di tessuti, aggregati cellulari e altri campioni biologici. Ebbi per la prima volta l'idea di questo metodo quando appresi da Thomas Lutin come preparare un liquido criogenico con densità regolabile nell'intervallo compreso tra 0,9 e 1,3 grammi per millilitro. Per iniziare questa procedura, posizionare un disco di gomma neoprenica sul fondo di un matraccio in vetro da 4,5 litri, per proteggere

measuring-the-densities-of-aqueous-glasses-at-cryogenic-temperatures

Research

Ricerca

JoVE Journal

Engineering

Ingegneria

In questo video, dimostriamo un metodo di crio-vetrificazione ultra-rapido per la conservazione di campioni biologici. Il metodo prevede l'uso di una combinazione di crioprotettori per proteggere il tessuto biologico dai danni da congelamento prevenendo la formazione intracellulare di cristalli di ghiaccio.

Crioconservazione basata sulla vetrificazione: una tecnica di raffreddamento ultrarapido per conservare campioni biologici a temperature molto basse per la conservazione a lungo termine

Il Cold Plantar Assay (CPA) misura la risposta al freddo tra 30 °C e 5 °C e può anche misurare l'adattamento al freddo. Questo protocollo descrive come utilizzare il CPA per misurare l'ipersensibilità al freddo, l'analgesia e l'adattamento nei topi.

Un metodo semplice e poco costoso per la determinazione fredda sensibilità e adattamento nei topi

Qui, presentiamo un protocollo per velocità di raffreddamento esperimenti dipendenti ellissometria, che possono determinare la temperatura di transizione vetrosa (Tg), dinamica media, fragilità e il coefficiente di dilatazione del liquido super-raffreddato e vetro per una varietà di materiali vetrosi.

Raffreddamento Vota dipendenti Misure ellissometria per determinare la dinamica dei Thin Films Glassy

Viene descritto un semplice apparato Dewar/criostato ad azoto liquido composto da un piccolo Dewar ottico in silice fusa, una termocoppia e uno spettrografo con dispositivo ad accoppiamento di carica (CCD). Gli esperimenti per i quali è stato progettato questo Dewar/criostato richiedono un rapido caricamento, congelamento e allineamento del campione, temperature del campione accurate e stabili e dimensioni/portabilità ridotte.

A Simple Dewar / criostato per equilibrare termicamente i campioni a temperature criogeniche noti accurate misurazioni di luminescenza

Qui, presentiamo un protocollo per descrivere le indagini ex situ ed in situ delle trasformazioni strutturali in vetri metallici. Abbiamo impiegato metodi analitici basati su nucleare che ispeziona interazioni hyperfine. Dimostriamo che l'applicabilità della spettrometria di Mössbauer e dispersione avanti nucleare di radiazione di sincrotrone durante gli esperimenti basati sulla temperatura.

Metodi di Ex Situ ed In Situ indagini sulle trasformazioni strutturali: il caso di cristallizzazione dei vetri metallici

Questo protocollo presenta una procedura dettagliata per preparare criocampioni biologici per esperimenti di spettroscopia di assorbimento dei raggi X basati su sincrotrone. Descriviamo tutti i passaggi necessari per ottimizzare la preparazione del campione e la crioconservazione con esempi del protocollo con cellule tumorali e fitoplancton. Questo metodo fornisce uno standard universale di crio-preparazione del campione.

Preparazione di campioni biologici per la speciazione a temperatura criogenica mediante spettroscopia di assorbimento a raggi X ad alta risoluzione

Il presente protocollo descrive la cristallizzazione di microscopici cristalli di ghiaccio e clatrati idrati in dispositivi microfluidici, consentendo lo scambio di liquidi attorno ai cristalli formati. Ciò fornisce possibilità senza precedenti per esaminare il processo di cristallizzazione e i meccanismi di legame degli inibitori.

Un approccio microfluidico per lo studio della cristallizzazione di ghiaccio e clatrato idrato

I nanocompositi CdSe-SnSe sono prodotti consolidando particelle di SnSe ingegnerizzate in superficie. Una semplice sintesi acquosa viene impiegata per produrre particelle di SnSe. Il rivestimento di particelle di SnSe con complessi molecolari di CdSe consente di controllare la granulometria e aumentare il numero di difetti presenti nel nanocomposito, abbassando così la conducibilità termica.

CdSe-SnSe policristallino processato in soluzione, ingegnerizzato in superficie, con bassa conducibilità termica

L'obiettivo generale di questo metodo è quello di determinare la bassa energia struttura elettronica dei solidi a ultra-bassa temperatura con angolo-Resolved spettroscopia di fotoemissione con radiazione di sincrotrone.

Angolo-spettroscopia di fotoemissione risolta A ultra-basse temperature

Il laser riscaldata cella ad incudine di diamante unita sincrotrone tecniche di micro-diffrazione permette ai ricercatori di esplorare la natura e le proprietà delle nuove fasi della materia a estrema pressione e temperatura condizioni (PT). Campioni eterogenei possono essere...

Sintesi e microdiffrazione a pressioni e temperature estreme

Scopri come determinare le densità di vetri acquosi a temperature criogeniche per campioni biologici. Questo metodo consente misurazioni rapide e accurate delle proprietà fisiche di soluzioni crioprotette.

Misurare le densità di vetri acquosi a temperature criogeniche

Esplora altri video