Un sistema integrato di attivare remotamente la trasduzione del segnale intracellulare di fotoattivazione Upconversion Nanoparticle-mediata della chinasi

L'obiettivo di questo esperimento è dimostrare la fattibilità di fotoattivare l'enzima utilizzando l'irradiazione nel vicino infrarosso. La proteina-chinasi A ingabbiata è immobilizzata su questa superficie di nanoparticelle di upconversion micro-iniettate nelle cellule e la risposta indotta dalla chinasi nelle cellule viventi si osserva dopo l'irradiazione nel vicino infrarosso. La fotoattivazione tradizionale richiede luce UV fototossica e, inevitabilmente, co-indurrà reazioni chimiche indesiderate e risposte simili, tuttavia, nelle nostre opzioni amichevoli, come l'irradiazione nel vicino infrarosso non può innescare una reazione a causa della sua bassa energia.

La nanoparticella di conversione può efficacemente convertire il fotone IR a bassa energia in fotone UV ad alta energia per innescare una reazione chimica vicino alla superficie della particella senza irradiazione UV diretta. La chinasi svolge un ruolo chiave nell'oncogenesi, questa tecnica può aiutarci a esaminare più informazioni sulla trasduzione del segnale con un rumore interferente molto più basso dalla fototossicità UV e dalla sua reazione collaterale. In generale, le persone nuove in questo campo incontreranno difficoltà nel modificare gli strumenti e la configurazione ottica per l'applicazione di conversione verso l'alto.

Per iniziare, installa una lente dell'obiettivo 4x accanto al supporto della cuvetta del fluorospettrometro, in modo che il laser possa essere messo a fuoco al centro della cuvetta. Posizionare un diodo laser sintonizzabile a 980 nanometri a 90 gradi contro la lente dell'obiettivo. Installare uno specchio a riflettanza completa e l'intersezione del percorso della luce tra la lente dell'obiettivo e il laser.

Non dimenticare di posizionare una piastra metallica anodizzata per bloccare la finestra di eccitazione dello spettrometro per proteggere le parti interne. Quindi posizionare una cuvetta di soluzione di nanoparticelle di conversione rivestita di silice nel supporto. Un raggio luminoso di conversione verso l'alto può essere visualizzato quando il laser si accende.

Commutare la spettroscopia in modalità luminescenza, con la tensione PMT più bassa durante gli allineamenti. Regolare lo specchio e gli stadi laser in modo che il raggio attraversi il centro della cuvetta affinché il PMT raccolga il segnale più forte. Dopo aver installato uno specchio dicroico e un filtro di eccitazione, installare un diodo laser a 980 nanometri nel percorso della luce di livello inferiore.

Aggiungi un collimatore tra il laser e lo specchio per aiutare a diffondere e allargare l'area irradiante NIR sul piano focale. Quindi utilizzare una soluzione di nanoparticelle di conversione per visualizzare il raggio nel vicino infrarosso. Regolare la posizione del tavolino laser per centrare il raggio di luce nel vicino infrarosso per completare l'allineamento.

Eseguire la sintesi di PKA in gabbia e smobilitare la PKA/UCNP in gabbia, per generare PKA/UCNP in gabbia come descritto nel protocollo di testo. Per misurare l'attività di entrambi i costrutti prima della fotolisi UV, misurare la diminuzione degli assorbenti di NADH nella miscela del saggio nel tempo dopo l'aggiunta di due microlitri di soluzione di PKA alla miscela del saggio. Ripetere la misurazione per PKA/UCNP.

Successivamente, eseguire la fotolisi UV a 200 milliwatt per centimetro quadrato di PKA in gabbia e PKA/UCNP in gabbia, in un bagno di acqua ghiacciata, per assicurarsi che la PKA possa essere attivata. L'attività della PKA è determinata da un saggio accoppiato all'enzima piruvato chinasi lattato deidrogenasi. Con una diminuzione degli assorbenti di NADH, viene misurato nel tempo dopo l'aggiunta della soluzione di PKA.

Incubare le cellule in siero fetale bovino al 10% contenente terreno L15 durante il periodo di microiniezione per un controllo stabile del pH all'esterno dell'incubatrice. Configura l'estrattore dell'ago per una punta a forma di cono con un diametro di circa 1,5 micron per l'apertura successiva della punta. Per aprire la punta, installare l'ago sul microiniettore, spostare la punta dell'ago a contatto con il bordo di un vetrino e seguire con una manopola delicata sul tavolino del microscopio.

Questa forza di vibrazione è sufficiente per rompere leggermente la punta e allargare l'apertura. Esaminare l'apertura dell'ago per assicurarsi che abbia un diametro esterno compreso tra 1,3 e 1,5 micron, che può essere confermato dalle immagini del microscopio utilizzando un obiettivo 40x. Successivamente, impostare la pressione di iniezione da 50 a 75 ettopascal con un intervallo di pressione da 200 a 300 millisecondi e impostare la pressione di compensazione costante da 15 a 30 ettopascal per evitare il riflusso del fluido nell'ago.

Caricare il complesso PKA/UCNP in gabbia con il colorante TAMRA nella posizione posteriore dell'ago. L'ago caricato viene quindi posizionato su un micromanipolatore idraulico ad un asse, con un angolo da 30 gradi a 45 gradi. Controllare l'ago con il microscopio per assicurarsi che non si generino bolle dopo il caricamento del campione.

Dopo aver immerso l'ago nel fluido, passare alla modalità a fluorescenza, per confermare un rilascio rapido del colorante quando viene applicata la pressione di iniezione e un rilascio lento del colorante quando viene applicata costantemente la pressione di compensazione. Quindi passare alla modalità campo chiaro a contrasto di fase, per avviare la microiniezione cellulare. L'onda d'urto della membrana può essere osservata nelle iniezioni riuscite.

Lavare le cellule due volte e controllare le cellule iniettate per la fluorescenza TAMRA co-iniettata per individuare correttamente le cellule microiniettate. Le cellule con ammissione a UCNP ma senza un segnale di colorante co-iniettato, indicano che la membrana cellulare si è rotta durante l'iniezione e dovrebbero essere escluse da ulteriori esperimenti. Irradiare le celle con un diodo laser a 980 nanometri nel percorso della luce di livello inferiore focalizzato da una lente dell'obiettivo 10x per 15 minuti.

Attendere un intervallo di buio di cinque minuti ogni cinque minuti di irradiazione per evitare il riscaldamento. Se è necessario un tempo di attivazione più breve, ad esempio secondi o addirittura subsecondi, è sufficiente passare a una lente dell'obiettivo 40x per una maggiore densità di fotoni di messa a fuoco. Dopo la fotolisi e il recupero cellulare, fissare le cellule in un millilitro o 4% di paraformaldeide in PBS per 20 minuti, prima di seguire un'ulteriore alexa 594 all'interno della colorazione.

Infine, visualizzare la disintegrazione delle fibre da stress indotta da NIR. Dopo l'irradiazione NIR, le cellule microiniettate con PKA/UCNP in gabbia, come indicato dalle frecce bianche, mostrano un'emissione di conversione verso l'alto. La disintegrazione delle fibre da stress causata da una fotoattivazione PKA NIR riuscita, espone più f actina e di conseguenza provoca una forte colorazione verde vicino all'UCNP.

Un controllo negativo in cui le cellule vengono microiniettate ma rimangono al buio, non mostrano disintegrazione delle fibre di stress. Il livello di esposizione alla f actina dopo la fotoattivazione NIR può essere colorato con alexa 594 seguito all'interno e quantificato dall'immagine J.Sono state tracciate le curve di intensità della colorazione della f actina lungo la freccia rossa, fornendo informazioni quantitative sulla disintegrazione delle fibre di stress che possono essere correlate all'attività della PKA indotta da NIR. Una volta acquisita familiarità con la microiniezione, questa tecnica può essere eseguita in un giorno, compresa la preparazione e il controllo di qualità di PKA/UCNP in gabbia.

Con le nostre istruzioni per le modifiche ai nostri strumenti e gli esperimenti, la reazione desiderata può essere innescata dall'infrarosso vicino, con una risoluzione temporale altamente spaziale come l'UV tradizionale per i metodi di titolazione, ma senza la fototossicità, non è contagiosa. Dopo aver visto questo video, spero che tu abbia una buona comprensione di come fornire un complesso di nanoparticelle enzimatiche in una cellula mediante microiniezione e fotoattivare l'enzima, utilizzando la luce IR vicina compatibile con la campana. Questa tecnica ha aperto la strada ai ricercatori nel campo della biologia chimica, che hanno bisogno di utilizzare la luce per innescare la reazione enzimatica desiderata nelle cellule viventi per la risoluzione temporale spaziale quando la cellula non può tollerare la fototossicità UV.

Seguendo questa procedura, altri bio affetti possono essere associati alla nanoparticella di upconversione, per rispondere a ulteriori domande che richiedono la fotoattivazione temporale spaziale. Se il bio affector funziona in modo extracellulare, la microiniezione non è nemmeno necessaria. La piattaforma di fotoattivazione a infrarossi può anche fornire una maggiore profondità di penetrazione nei tessuti e può quindi essere applicata in piccoli animali per innescare le reazioni desiderate nel momento e nel luogo stabiliti.