Analisi delle interazioni proteine-proteine ​​e co-localizzazione tra i componenti di giunzione, stretti e giunti aderenti in ghiandole mammarie murine

L'obiettivo generale di questo metodo è determinare se due o più proteine della giunzione intercellulare co-localizzano all'interno delle cellule e valutare ulteriormente la loro interazione fisica tramite co-immunoprecipitazione. Questo metodo può aiutare a rispondere a domande chiave nel campo della biologia della ghiandola mammaria, compresi i ruoli svolti dalle giunzioni nel normale sviluppo e malattie come il cancro al seno. Il vantaggio principale di questa tecnica è che può fornire informazioni significative sull'interazione proteina-proteina in vivo a un costo relativamente basso.

Per eseguire la colorazione co-immunofluorescente, recuperare i vetrini microscopici appropriati dal congelatore. Fissare immediatamente le sezioni immergendole in formaldeide al quattro percento per 15 minuti a temperatura ambiente. Quindi, immergere i vetrini in soluzione salina tamponata con fosfato a temperatura ambiente.

Lasciare le diapositive lì fino a quando non si procede al passaggio successivo. Cerchia ogni sezione del vetrino utilizzando una barriera idrofobica disponibile in commercio o una penna da laboratorio idrorepellente. Aggiungere immediatamente gocce di PBS al tessuto e posizionare il vetrino in una camera istologica umana per il resto della procedura.

Bloccare ogni sezione di tessuto con 100-200 microlitri di soluzione salina tamponata con albumina-tris di siero bovino al tre percento, polisorbato-20 allo 0,1%, per 30 minuti a temperatura ambiente. Mentre i campioni sono bloccanti, preparare le soluzioni di anticorpi primari e secondari diluendo gli anticorpi in TBS 0,1% polisorbato-20. Dopo aver rimosso la soluzione bloccante per aspirazione, incubare le sezioni in 100-200 microlitri dell'anticorpo primario diluito per 60 minuti a temperatura ambiente.

Quindi rimuovere la soluzione di anticorpi primari mediante aspirazione e lavare le sezioni con 250-500 microlitri di TBS 0,1% polisorbato-20 per cinque minuti. Rimuovere la soluzione di lavaggio mediante aspirazione prima di ripetere il lavaggio due volte. Aspirare la soluzione di lavaggio e incubare le sezioni con 100-200 microlitri dell'anticorpo secondario coniugato Fluoro-4 appropriato per 60 minuti a temperatura ambiente.

Dopo aver rimosso la soluzione di anticorpi secondari per aspirazione, lavare le sezioni con 250-500 microlitri di TBS 0,1% polisorbato-20 per cinque minuti. Rimuovere la soluzione di lavaggio e ripetere l'operazione due volte. Ripetere questi passaggi utilizzando la combinazione appropriata di corpi primari e secondari per qualsiasi proteina successiva di interesse.

Dopo la rimozione del lavaggio finale, eseguire la colorazione dei nuclei incubando la sezione con 100-200 microlitri di un milligrammo per milliletro DAPI e TBS 0,1% polisorbato-20 per cinque minuti a temperatura ambiente. Aspirare la soluzione DAPI e montare i vetrini utilizzando un mezzo di montaggio solubile in acqua e non fluorescente e vetrini coprioggetti. Metti i vetrini in un frigorifero a quattro gradi Celsius per almeno otto ore.

Procedere all'imaging al microscopio a fluorescenza come descritto nel protocollo di testo. Raccogliere da 500 a 1000 microgrammi di lisato e diluirlo in PBS per un volume finale di 200 microlitri in ciascuna provetta da 1,5 millilitri. Aggiungere l'anticorpo contro l'antigene di interesse al primo tubo di lisato e tenerlo in ghiaccio.

Incubare le provette per una notte a quattro gradi Celsius su un miscelatore a rulli per provette a bassa velocità. Il giorno seguente, aggiungere 50 microlitri di perline magnetiche ai nuovi tubi da 1,5 millilitri per il prelavaggio. Posizionare i tubi contenenti le perline sul supporto magnetico e lasciare che le perline migrino verso il magnete.

Rimuovere il tampone di conservazione dalle perle utilizzando una pipetta da 200 microlitri. Lavare le perle aggiungendo 500 microlitri di PBS 0,1% polisorbato-20 e agitare energicamente i tubi per 10 secondi. Quindi, rimetti i tubi sul supporto magnetico e lascia che le perline migrino verso il magnete.

Rimuovere il tampone di lavaggio in eccesso pipettandolo con una pipetta da 200 microlitri. Aggiungere il complesso di reazione anticorpale del lisato alle perle e incubare per 90 minuti a temperatura ambiente sul miscelatore a rulli. Dopo l'incubazione, posizionare le provette sul supporto magnetico e lasciare che le perle migrino verso il magnete.

Utilizzando una pipetta da 200 microlitri, aspirare e scartare il lisato e posizionare le provette sul ghiaccio. Lavare le perline due volte aggiungendo 500 microlitri di PBS, posizionando i tubi sul supporto magnetico e rimuovendo il liquido come prima. Durante le fasi di lavaggio, evitare il vortice e mantenere i campioni sul ghiaccio.

Lavare le perle una volta con PBS 0,1% di polisorbato-20 senza vortice e scartare l'ultimo tampone di lavaggio utilizzando un puntale per pipetta da 200 microlitri. Per eluire, aggiungere 20 microlitri di glicina acida 0,2 molare alle provette e agitarle per sette minuti sul miscelatore a rulli. Dopo aver centrifugato ad alta velocità per alcuni secondi, raccogliere il surnatante in una provetta fresca e ghiacciata.

Ripetere le fasi di lavaggio ed eluizione per ciascun tubo. Quindi, aggiungere 10 microlitri di tampone 4x al campione eluito da 40 microlitri. Aggiungere immediatamente un molare Tris ai campioni eluiti, una goccia alla volta, fino a quando il suo colore diventa blu, quindi procedere con le provette successive.

Far bollire i campioni eluiti a una temperatura compresa tra 70 e 90 gradi Celsius per 10 minuti. Caricare i lisati preparati e i campioni precipitati uno accanto all'altro in un gel di acrilammide SDS-PAGE. Far funzionare il gel nel tampone di corsa a 100 volt per circa 95 minuti, o fino a quando il bordo delle proteine in migrazione raggiunge il fondo del gel.

Successivamente, trasferire i gel su una membrana di nitrocellulosa o PVDF utilizzando un protocollo standard. Quindi, bloccare la membrana per un'ora su un bilanciere a bassa velocità in TTBS di latte secco al cinque percento. Per identificare se la precipitazione ha avuto successo, sondare la membrana utilizzando il primo anticorpo contro la proteina precipitata.

Diluirlo in TTBS di latte in polvere al cinque percento alla concentrazione consigliata dal produttore. Incubare la membrana per una notte a quattro gradi Celsius su una piattaforma oscillante con agitazione lenta. Il giorno seguente, lavare la membrana tre volte per cinque minuti ciascuna con TTBS su una piattaforma oscillante ad alta agitazione.

Quindi, incubare la membrana nell'anticorpo secondario appropriato coniugato con perossidasi di rafano, diluito in TTBS, per un'ora a temperatura ambiente su una piattaforma oscillante con agitazione lenta. Eseguire da tre a sei lavaggi, ciascuno per cinque minuti, con TTBS su una piattaforma oscillante ad alta agitazione. Analizzare il segnale dell'anticorpo secondario incubando la membrana con una soluzione di luminol disponibile in commercio e seguire le istruzioni del produttore.

Rileva il segnale utilizzando un sistema di imaging a chemiluminescenza. Per identificare le proteine interagenti, ripetere questi passaggi utilizzando gli anticorpi appropriati sullo stesso blot. Per determinare se i componenti della giunzione gap, della giunzione di aderenza e della giunzione stretta possono interagire insieme nella ghiandola mammaria, sono stati eseguiti saggi di co-immunofluorescenza.

Il test di co-immunofluorescenza mostra che la beta-catenina, una proteina integrale della giunzione aderente, e la connessina 26, una proteina della giunzione gap, co-localizzano sulla membrana cellulare nelle ghiandole mammarie dei topi al settimo giorno di lattazione, come riflesso dal colore giallo. I nuclei cellulari vengono visualizzati con colorazione DAPI blu. Le criosezioni delle ghiandole mammarie al 18° giorno di gravidanza sono state tagliate e colorate in immunofluorescenza per Claudin 7, una proteina a giunzione stretta mostrata in verde, E-Caderina, una proteina a giunzione aderente mostrata in rosso, e Connexin 26, una proteina a giunzione gap mostrata in blu corallo.

I nuclei sono stati colorati con DAPI blu. La colocalizzazione di E-Caderina e Claudina 7 è di colore da giallo ad arancio chiaro, mentre la colocalizzazione di Connessina 26 con E-Caderina e Claudina 7 ha portato a una colorazione punteggiata di bianco. Per scoprire quali proteine giunzionali si mescolano e si legano fisicamente insieme alla membrana cellulare, è stata eseguita la co-immunoprecipitazione utilizzando tessuti della ghiandola mammaria di topi in allattamento.

I risultati hanno mostrato che la connessina 43, un componente della giunzione gap, interagisce con E-caderina e Claudina 7, ma non con Claudina 3. Questi risultati sono stati confermati dall'immunoprecipitazione reciproca. Quando l'E-caderina è stata immunoprecipitata, ha interagito con la Connessina 43 e la Claudina 7.

Una volta padroneggiata, questa tecnica può essere eseguita in due giorni per la co-immunofluorescenza da quattro a otto vetrini e i vetrini possono essere visualizzati il giorno successivo se eseguita correttamente. Durante il tentativo di procedura di co-immunofluorescenza, è importante ricordare di scegliere diversi anticorpi coniugati Fluoro 4 sollevati in spazi diversi con lunghezze d'onda non sovrapposte e di selezionare le perle magnetiche di proteina A o G compatibili con gli anticorpi utilizzati per la co-immunoprecipitazione. Dopo il suo sviluppo, questa tecnica ha aperto la strada ai ricercatori nel campo della biologia cellulare per esplorare l'interazione delle giunzioni intercellulari nelle ghiandole mammarie mure.

Non dimenticare che lavorare è estremamente pericoloso e che è necessario prendere sempre precauzioni durante l'esecuzione di questa procedura.