Protocolli per l'assemblaggio standard di DNA C-Brick utilizzando Cpf1

I video seguenti descrivono in dettaglio una procedura per l'utilizzo dello standard C-Brick per assemblare parti di DNA utilizzando la proteina associata a CRISPR, Cpf1. Questo metodo può favorire lo sviluppo dell'assemblaggio del DNA nel campo della biologia sintetica. Ad esempio facilitando la costruzione di complicati circuiti genetici.

Il vantaggio principale di questo metodo è che è indipendente dalla sequenza e consente l'assemblaggio iterativo di costrutti di DNA. Abbiamo avuto l'idea di questo metodo quando abbiamo notato che Cpf1 era guidato da un singolo siRNA e dal DNA catalitico che veniva impilato. Pertanto, generando DKN.

A dimostrare la procedura sarà Shi-Yuan Li, uno studente laureato del mio laboratorio. Per riparare i modelli di crRNA, risospendere i singoli oligonucleotidi in acqua priva di RNasi a una concentrazione di 10 micromolari. A una provetta per PCR da 0,2 millilitri, aggiungere l'oligonucleotide del filamento superiore, l'oligonucleotide del filamento inferiore e il tampone di ricottura 10x come descritto nel documento allegato.

Assicurarsi che il volume totale sia di 50 microlitri. Questa tabella mostra sei diversi oligonucleotidi del filamento inferiore, ognuno dei quali dovrebbe essere accoppiato individualmente con il filamento superiore, T7-F. Le lettere minuscole rappresentano la sequenza da trascrivere nella sequenza guida del crRNA.

Posizionare la provetta per PCR in un termociclatore. Eseguire il programma di ricottura con una denitrazione iniziale a 95 gradi Celsius per cinque minuti, quindi un raffreddamento da 95 a 20 gradi Celsius con una diminuzione di un grado Celsius al minuto. Dopo la ricottura, eseguire immediatamente la trascrizione combinando il prodotto ricotto con acqua priva di RNasi, tampone di trascrizione T-7, miscela NTP, inibitore della RNasi ricombinante e RNasi polimerasi T-7 in una provetta da microcentrifuga da 1,5 millilitri.

Incubare la reazione in un bagno d'acqua a 37 gradi Celsius durante la notte. Il giorno successivo, utilizzare un kit di pulizia e concentrazione dell'RNA per purificare l'RNA trascritto. Utilizzare uno spettrofotometro UV-Vis per quantificare l'RNA.

Quindi, diluire l'RNA a una concentrazione di 10 micromolari. Se i campioni non vengono utilizzati immediatamente, conservarli a 80 gradi Celsius. La costruzione di parti in C-Brick può essere realizzata con diversi metodi.

In questa sezione del video, tre cassette di cromoproteine, cjBlue, eforRed e amilGFP saranno assemblate utilizzando il metodo di assemblaggio senza soluzione di continuità. Iniziare progettando e ordinando gli oligonucleotidi per l'amplificazione PCR delle cassette cromoproteiche. Quando arrivano gli oligonucleotidi, risospenderli in acqua ultrapura ad una concentrazione di 10 micromolari.

Successivamente, per impostare le reazioni PCR, posizionare provette PCR da 0,2 millilitri sul ghiaccio. Aggiungere acqua ultrapura, due tamponi XPCR, DNTP, primer diretti e inversi, modello cromoproteico e DNA polimerasi ad alta fedeltà. Posizionare i tubi direttamente nel termociclatore ed eseguire il programma.

Utilizzare i campioni immediatamente, oppure congelarli e conservarli a 20 gradi Celsius. Dopo l'amplificazione, purificare i prodotti PCR utilizzando un kit. Successivamente, per digerire il vettore standard C-Brick con BamH1, aggiungere acqua ultrapura, plasmide, tampone 10x e BamH1 alla provetta.

Incubare per un massimo di due ore a 37 gradi Celsius a bagnomaria. Purificare il vettore linearizzato utilizzando un kit di pulizia in gel. Dopo la pulizia, combinare il vettore linearizzato, il prodotto PCR, il tampone di assemblaggio senza saldatura 5x e l'enzima di assemblaggio senza saldatura da un kit di assemblaggio senza saldatura in una provetta per microcentrifuga da 1,5 millilitri.

Assicurarsi che il volume totale sia di 10 microlitri. Mettilo in un bagnomaria a 37 gradi Celsius per 30 minuti. Dopo l'incubazione, utilizzare immediatamente i campioni o congelarli su ghiaccio e conservarli a 20 gradi Celsius.

A 90 microlitri di e coli DH10B, aggiungere 10 microlitri del costrutto. Eseguire una trasformazione chimica. Quindi, stendere le cellule trasformate su una piastra LB e incubare a 37 gradi Celsius.

Il giorno successivo, selezionare diversi cloni da coltivare in provette LB liquide da cinque millilitri e incubarli a 37 gradi Celsius su uno shaker a 220 giri/min durante la notte. Estrarre il plasmide utilizzando un kit di preparazione del plasmide. Quindi, identifica i cloni corretti mediante sequenziamento Sanger.

Sappi che la costruzione di percorsi C-Brick può essere realizzata anche mediante l'applicazione reattiva di PCI, o mediante restrizione nella digestione immediata del terreno di DNA ligasi T4 alla legatura. Successivamente, per digerire il vettore C-Brick con Cpf1, combinare acqua priva di RNasi, 10x tampone Cpf1, il plasmide, l'inibitore ricombinante della RNasi e Cpf1 in una provetta da microcentrifuga da 1,5 millilitri. Per inserire un frammento di DNA estraneo nei siti T1 e T2, aggiungere un microlitro di crRNA T2 e incubare la provetta in un bagno d'acqua a 37 gradi Celsius per 30 minuti.

Quindi, tenendo la provetta nel bagnomaria, aggiungere un microlitro di crRNA T1, un microlitro di Cpf1 e incubare per altri 30 minuti. Il crRNA T2 viene aggiunto per primo, perché i due siti di riconoscimento sono più vicini sul DNA vettore. Il legame di Cpf1 sul sito T1 può influenzare la lettiera del sito T2.

Inoltre, se il sito T2 stava sostituendo il sito T2, il sito T2 sarebbe stato interrotto se il crRNA T1 fosse stato aggiunto per primo. Aggiungere un microlitro di fosfatasi alcalina termosensibile e incubare la provetta in un bagno d'acqua a 37 gradi Celsius per un'altra ora. Eseguire l'elettroforesi su gel di agarosio e purificare il vettore utilizzando un kit per il sistema di pulizia del gel.

Utilizzare i campioni immediatamente, oppure congelarli e conservarli a 20 gradi Celsius. Per digerire il frammento di DNA di interesse con Cpf1, combinare acqua priva di RNasi, 10x tampone Cpf1, plasmide, inibitore della RNasi ricombinante e Cpf1 in una provetta da microcentrifuga da 1,5 millilitri. Per inserire un frammento di DNA estraneo nei siti T1 e T2, aggiungere un microlitro di crRNA T1 e un microlitro di crRNA T3 alla provetta e incubarla a bagnomaria a 37 gradi Celsius per due ore.

Dopo l'incubazione, eseguire l'elettroforesi su gel di agarosio e purificare il frammento utilizzando un kit di pulizia del gel. Utilizzare i campioni immediatamente, oppure congelarli e conservarli a 20 gradi Celsius. Successivamente, per legare il frammento di DNA estraneo nel vettore C-Brick, combinare il vettore linearizzato e il frammento di DNA in una provetta da microcentrifuga da 1,5 millilitri.

Aggiungere 10 tampone DNA ligasi T4 e DNA ligasi T4. Quindi, incubare per due ore a 22 gradi Celsius. Utilizzare i campioni immediatamente, oppure congelarli e conservarli a 20 gradi Celsius.

Aggiungere 10 microlitri di prodotti di legatura alle cellule competenti di e coli DH10B ed eseguire una trasformazione chimica. Quindi, stendere l'e coli trasformato su piastre LB e incubarle a 37 gradi Celsius. Il giorno successivo, aggiungere diversi cloni a provette LB liquide da 5 millilitri e incubarli per una notte su uno shaker a 220 giri/min e 37 gradi Celsius.

Estrarre il plasmide utilizzando un kit di preparazione del plasmide. Quindi, identifica i cloni corretti mediante sequenziamento Sanger. Eseguite un nuovo ciclo di assemblaggio C-Brick.

Utilizzando il campione, i cosiddetti cloni di crack possono essere utilizzati come nuovo vettore C-Brick o pezzo di DNA per un ulteriore assemblaggio iterativo di C-Brick. Tre cassette di cromoproteine, cjBlue, eforRed e amilGFP, sono state assemblate come descritto in questo video. Tre cromoproteine sono state espresse in e coli coltivato su una piastra.

I batteri di controllo negativi, privi di cromoproteine, sono mostrati sulla quarta piastra. Successivamente, due cassette per l'espressione del colore sono state ulteriormente assemblate con lo standard C-Brick per creare più colori. Tre cromoproteine e tre cromoproteine doppie assemblate sono state espresse in e coli cresciuti in terreno LB liquido.

Da uno a sei, i costrutti espressi sono eforRed, uno, amilGFP, due, cjBlue, tre, amilGFP più eforRed, quattro, eforRed più cjBlue, cinque e amilGFP più cjBlue, sei. I batteri colorati su una singola piastra, o in una singola provetta da microcentrifuga, sono stati coltivati da un singolo clone verificato in sequenza. Una volta padroneggiata, questa tecnica può essere eseguita in una settimana, se eseguita correttamente.

Durante il tentativo di questa procedura, è importante ricordare che tutti i materiali devono essere privi di RNasi, per la preparazione di siRNA e la clearance di Cpf1. Raccomando ancora, questa tattica ha aiutato i ricercatori nel campo della biologia sintetica a costruire una vetrina genetica delle vie metaboliche. Dopo aver visto questo video, dovresti avere una buona comprensione di come assemblare un percorso del DNA utilizzando lo standard C-Brick.