Analisi dei Macrofagi Microglia e dei Monociti dal Sistema Nervoso Centrale dalla Citometria del Flusso

L'obiettivo generale di questo esperimento è valutare i vari marcatori espressi dalle sottopopolazioni di macrofagi all'interno del sistema nervoso centrale o del SNC. Questo metodo può aiutare a rispondere a domande chiave nel campo della neuroimmunologia, come i macrofagi di Duperry mentre cerchiamo di fare vertigini al SNC e quali sono i fenotipi del SNC nei macrofagi. I principali vantaggi di questa tecnica sono l'isolamento di un gran numero di sottopopolazioni di macrofagi altamente purificate, nonché una contificazione del marcatore cellulare della sottopopolazione di macrofagi.

Inizia usando le forbici sottili per tagliare la pelle ventrale appena sotto il processo xifoideo per esporre la cavità toracica. Fai un'incisione nel diaframma e taglia gli aspetti laterali della gabbia toracica in direzione da caudale a rostrale per esporre il cuore. Dopo aver identificato il ventricolo sinistro e l'atrio destro, inserire un catetere a farfalla con un ago da 25 gauge nel ventricolo sinistro.

Praticare un'incisione sull'atrio destro e iniziare a spruzzare 20 millilitri di PBS attraverso il catetere a una velocità di dieci millilitri al minuto non appena il sangue inizia a fluire. Una profusione riuscita sarà indicata da uno sbiancamento dei polmoni e del fegato quando il sangue viene spostato. Quindi, usa le forbici sottili per sezionare la colonna vertebrale.

Asportare la muscolatura della parete addominale sul lato ventrale della colonna vertebrale e tagliare la colonna vertebrale alla base della coda per rimuovere la colonna vertebrale man mano che viene raccolta. Inserire una siringa da dieci millilitri di PBS dotata di una punta di pipetta modificata da 200 microlitri nel lato lombare della colonna vertebrale. Quindi sciacquare il midollo spinale sul lato cervicale.

Rimuovi la pelle sopra il cranio e inserisci una punta delle forbici alla base del cranio. Tagliare il cranio seguendo la sutura sagittale. Quindi inserire piccole pinze nel taglio e rimuovere delicatamente la parte superiore del cranio.

Sezionare il cervello dalla testa del topo e rimuovere il bulbo olfattivo e il cervelletto. Quindi posizionare il cervello e il midollo spinale in un tubo da cinque millilitri contenente un cocktail da un punto uno due otto millilitri di digestivo. Per dissociare le cellule, usa piccole forbici per tagliare finemente il cervello e il midollo spinale in uno o due millimetri cubi e posiziona i pezzi a 37 gradi Celsius e al cinque percento di anidride carbonica per 30 minuti.

Al termine dell'incubazione, interrompere la digestione con 20 microlitri di EDTA a cinque molari di punto zero, seguita da una triturazione delicata con una pipetta da cinque millilitri. Filtrare la sospensione cellulare risultante attraverso un colino a maglie da 70 micron in un tubo conico da 50 millilitri utilizzando lo stantuffo di una siringa da dieci millilitri per macerare delicatamente il tessuto cerebrale o del midollo spinale rimanente. Sciacquare il colino con 20 millilitri di FBS e PBS al cinque percento.

E raccogliere le cellule filtrate mediante centrifugazione. Quindi, aspirare con cura il surnatante senza disturbare il pellet. Per la separazione in gradiente di densità delle celle, sospendiamo il pellet con quattro millilitri di terreno con gradiente di densità del 30% e trasferiamo le celle in un tubo conico da 15 millilitri.

Appoggiare delicatamente quattro millilitri di gradiente di densità del 37%, seguiti da quattro millilitri di gradiente di densità del 70% sotto il gradiente di densità del 37%. Trasferire la provetta in una centrifuga da banco per separare le cellule. Le cellule della microglia e dei macrofagi saranno all'interfaccia degli strati di gradiente di densità del 70 e del 37%.

Il tubo apparirà stratificato. Dopo aver rimosso con cura lo strato superiore di mielina, trasferire da tre a quattro millilitri dello strato di interfase dei macrofagi della microglia in una nuova provetta da 15 millilitri. Quindi lavare le cellule immunitarie con tre centrifughe in 15 millilitri di PBS, rimettendo in sospensione il pellet in un millilitro di PBS dopo il lavaggio finale.

Per valutare l'espressione del marcatore della sottopopolazione dei macrofagi, trasferire le cellule in una provetta per analisi di citometria a flusso da cinque millilitri, seguita dall'aggiunta di un microlitro di reagente per la colorazione delle cellule morte fissabile. Dopo 30 minuti in ghiaccio, al riparo dalla luce, lavare i campioni in due millilitri di PBS e risospendere il pellet in 400 microlitri di tampone fax per provetta di analisi sperimentale. Dividere le cellule in un numero appropriato di provette per l'analisi della citometria a flusso da cinque millilitri.

Quindi bloccare il legame del recettore FC aspecifico con un microgrammo di cocktail di anticorpi bloccanti CD 16 CD 32 per 100 microlitri di cellule per un'incubazione di 10-15 minuti su ghiaccio, al riparo dalla luce. Successivamente, etichettare le cellule con 100 microlitri di anticorpi primari appropriati, per un'incubazione di 30 minuti su ghiaccio, al riparo dalla luce. Al termine dell'incubazione, lavare le cellule in due millilitri di PBS quattro volte.

Quindi aggiungere 100 microlitri degli anticorpi secondari appropriati per 30 minuti su ghiaccio, al riparo dalla luce, seguiti da quattro lavaggi in PBS come appena dimostrato. Dopo l'ultimo lavaggio, risospendere delicatamente i pellet in 100 microlitri di paraformaldeide all'uno per cento per 15 minuti a temperatura ambiente, al riparo dalla luce. Quindi lavare le celle quattro volte in PBS.

Risospendere i pellet finali in 200 microlitri di PBS fresco e analizzare le cellule mediante citometria a flusso. Le microglia derivate dal cervello e dal midollo spinale e i macrofagi derivati dai monociti sono identificati in base alla loro espressione di CD 11 B e CD 45. L'espressione di CX3CR1 e Tmem119 da parte delle cellule microgliali medie CD 11 B positive CD 45 consente a questa popolazione cellulare di essere ulteriormente distinta dai macrofagi CD 11 C positivi CD 45 derivati da monociti, che non esprimono nessuno di questi marcatori, ma esprimono CCR2.

Dopo la separazione per gradiente di densità, dall'85 al 95% delle cellule è ancora vitale. In assenza di isolamento del gradiente di densità, le sottopopolazioni di macrofagi non sono identificabili in un grafico di dispersione bilaterale in avanti, a causa della presenza di cellule non macrofagiche e detriti di mielina. Poiché l'epitopo riconosciuto dall'anticorpo anti-Tmem119 è intracellulare, la permeabilizzazione è necessaria per la marcatura di questo importante marcatore di cellule microgliali.

Si noti che la permeabilizzazione induce il restringimento cellulare, tuttavia, facendo apparire le sottopopolazioni di macrofagi più piccole con l'analisi della dispersione diretta rispetto a quella laterale. Una volta padroneggiata, questa tecnica può essere completata in cinque ore se eseguita correttamente. Mentre ho tentato questa procedura, è importante ricordare di impostare la gradazione di densità con molta attenzione.

Seguendo questa procedura, è possibile eseguire altri metodi, come la rt-PCR quantitativa, per rispondere a ulteriori domande sulle vie di segnalazione della sottopopolazione di macrofagi. Dopo il suo sviluppo, questa tecnica ha aperto la strada ai ricercatori nel campo delle neuroscienze per esplorare l'attivazione della sottopopolazione di macrofagi in modelli murini di malattia neurologica. Dopo aver visto questo video, è necessario condurre test o seguire questa tradizione come sottopopolazioni di macrofagi mediante citometria a flusso.

Non dimenticare che lavorare con la paraformaldeide può essere estremamente pericoloso e che durante l'esecuzione di questa procedura è necessario prendere sempre precauzioni come l'uso di una cappa.