Name: Analisi dei Macrofagi Microglia e dei Monociti dal Sistema Nervoso Centrale dalla Citometria del Flusso (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-06-22T14:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 43 s
Description: Impara a isolare e analizzare le sottopopolazioni di macrofagi del sistema nervoso centrale mediante citometria a flusso nel topo adulto. Questo protocollo consente di caratterizzare marcatori specifici di microglia e macrofagi.

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Questo lavoro è stato sostenuto da sovvenzioni dell&#39;Agenzia Nazionale per la Recherche (ANR-12-MALZ-0003-02-P2X7RAD), l&#39;Associazione Francia Alzheimer e Bpifrance. Il nostro laboratorio è anche supportato da Inserm, CNRS, Université Pierre et Marie Curie e il programma &quot;Investigations d&#39;avenir&quot; ANR-10-IAIHU-06 (IHU-A-ICM). Vorremmo ringraziare l&#39;assistenza della centrale CELIS per la coltura delle cellule.

Tutti i metodi qui descritti sono stati approvati dal Comitato istituzionale per la cura e l&#39;uso degli animali presso l&#39;Istituto ICM e dal Comitato per gli animali etnici di Darwin, e sono trattati con il protocollo 01407.02. 1. Preparazione <ol><li> Preparare il cocktail di digestione in un tubo da 1,5 ml combinando le seguenti forme per ogni topo: 1 mL di fosfato bucidato salina (PBS); 123 μL di enzima di digestione (vedere tabella dei materiali) a 13 wunsch / mL (soluzione di riserva), concentrazione finale 1,6 wunsch / mL; E 5 μL DNasi I (vedere tabella dei materiali) a 100 mg / ml (soluzione di scorta), concentrazione finale 0,5 mg / ml. </li></ol> 2. Perfusione e dissezione <ol><li> Eutanizzare i topi con una dose letale di pentobarbital (100 μL a 400 mg / ml). </li><li> Posizionare l&#39;animale in posizione supina e bagnare il corpo con il 70% di etanolo. </li><li> Tagliare la pelle ventrale con forbici sottili appena al di sotto del processo xifoide per esporre la cavità toracicay. </li><li> Effettuare un&#39;incisione nel diaframma e tagliare gli aspetti laterali della gabbia con una raffinata scissorsin in direzione caudale-rostrala per esporre il cuore (evitando di tagliare altri organi). Identificare il ventricolo sinistro (LV) e l&#39;atrio destro (RA). </li><li> Inserire un catetere a farfalla con un ago da 25 G all&#39;interno del LV. Effettuare un&#39;incisione sulla RA con forbici finissime e all&#39;inizio del flusso sanguigno, iniziare la perfusione a 10 mL / min di portata attraverso il LV con 20 mL di PBS per rimuovere le cellule e il sangue dalle vasi; La perfusione efficace è nota dal blanching dei polmoni e del fegato in quanto il sangue viene spostato. </li><li> Decapitare l&#39;animale con forbici medio. Disseccare la colonna vertebrale con forbici fine e separarla dal corpo escitando la muscolatura della parete addominale sul lato ventrale della colonna vertebrale e tagliando la colonna vertebrale alla base della coda. </li><li> Inserire una siringa da 10 ml contenente PBS e una punta pipetta montata da 200 μL nel lato lombare diLa colonna vertebrale e sciacquare il midollo spinale sul lato cervicale. NOTA: La punta della pipetta da 200 μL viene tagliata con forbici alla sua estremità più larga (circa 1 cm) e strettamente inserita su una siringa da 10 ml precedentemente riempita con PBS. </li><li> Rimuovere la pelle sopra il cranio e utilizzare le pinze per esporre il cervello. Inserire una lama di forbice alla base del cranio e tagliare il cranio seguendo la sutura sagittale. Inserire piccole pinze nel taglio e sollevare delicatamente il cranio. Disseccare il cervello dalla testa del mouse e rimuovere la lampadina olfattiva e il cervelletto. </li><li> Raccogliere il cervello e il midollo spinale in un tubo da 1,5 mL contenente 1,128 ml di PBS con il cocktail di digestione (dal punto 1.1). </li></ol> 3. Dissociazione delle cellule <ol><li> Tagliare finemente il cervello e il midollo spinale nel tubo da 1,5 ml (passo 2.9) in 1-2 mm 3 pezzi con forbici piccole ( figura 1 ). </li><li> Incubare il tubo da 1,5 ml contenente i tessuti macinati per 30 minuti in un incubatoA 37 ° C con 5% di CO 2 . NOTA: Preparare il gradiente di densità a questo punto. </li><li> Aggiungere 20 μl 0,5 M EDTA (soluzione di riserva), concentrazione finale 10 mM, al tubo da 1,5 mL per fermare la reazione enzimatica. </li><li> Creare delicatamente una sospensione cellulare pipettando su e giù con una pipetta da 5 ml. </li><li> Passare la sospensione cellulare attraverso una maglia di nylon (dimensioni di pori da 70 μm) in un tubo da 50 ml utilizzando lo stantuffo di una siringa da 10 ml. </li><li> Lavare la maglia di nylon con 20 ml di 5% Fetal Bovine Serum (FBS) -PBS. </li><li> Centrifugare per 7 minuti (300 xg) a temperatura ambiente (18 ° C). Scartare il surnatante aspirando e procedere alla fase successiva. Prestare particolare attenzione quando si rimuove il surnatante; Non disturbare il pellet, che può essere facilmente aspirato dalla pipetta aspirante. </li></ol> 4. Gradiente di densità <ol><li> Preparare una soluzione di scorta del mezzo di gradiente di densità aggiungendo la quantità appropriata di 10x PBS al mezzo di gradiente di densità. NOTA: Aggiunta di una parte di 10X PBS a nove parti di gradiente di densità. </li><li> Diluire il medium di gradiente di densità di stock con 1x PBS per le diverse percentuali come descritto nella Tabella 1 . </li><li> Riposizionare il pellet (dal punto 3.7) con 4 mL di 30% di gradiente di densità e trasferire in un tubo da 15 mL. </li><li> Posizionare una pipetta Pasteur nel fondo del tubo da 15 ml e sottovalutare lentamente 4 mL di mezzo di gradiente di densità del 37%. </li><li> Aggiungere 4 mL di media di gradiente di densità del 70%, come descritto in precedenza. </li><li> Centrifugare il gradiente per 40 min (800 xg) a temperatura ambiente (18 ° C). Assicurarsi che la centrifuga si arresti con un minimo o nessun freno in modo che l&#39;interfaccia non sia disturbata. NOTA: il tubo sarà stratificato. Le cellule stratificate all&#39;interfaccia di gradiente di densità del 70% -37% sono le cellule immunitarie mononucleate (sottopopolazioni microglia e macrofagi); I livelli superiori sono detriti cellulari e mielina, rispettivamente ( Figura 2 ). </li><lI&gt; Usando una pipetta di trasferimento, togliere delicatamente lo strato di mielina. </li><li> Raccogliere 3-4 mL della interfaccia di gradiente di densità del 70-37% contenente le cellule di subpopulazioni del macrofage in un tubo pulito da 15 mL. </li><li> Lavare le cellule 3x con PBS, volume totale di 15 ml. Assicurarsi che il mezzo di gradiente di densità contenente le cellule sia diluito almeno tre volte con PBS e centrifughi per 7 minuti (500 xg, 4 ° C) con il freno &quot;on&quot;. </li><li> Resuspendere il pellet cellulare con 1 ml di PBS per l&#39;etichettatura delle cellule o per altri dosaggi funzionali. </li></ol> 5. Etichettatura cellulare per la citometria di flusso <ol><li> Trasferire le celle (punto 4.10) in un tubo di citometria a flusso. </li><li> Aggiungere 1 μl di reagente per la macchiatura della cellula morta fissabile a ciascun campione di cellule ottenuto al punto 4.10. Incubare per 30 minuti in ghiaccio, protetto dalla luce. </li><li> Lavare le cellule una volta con 2 ml di PBS e centrifugare per 5 min (300 xg, 4 ° C). </li><li> Rimuovere il surnatante e risospendere il pellet di cellula con400 μl PBS 1% BSA, 0,1% azide. </li><li> Aggiungere 1 μg di anticorpi CD16 / CD32 a 100 μL delle cellule per bloccare i recettori Fc. Incubare 10-15 min su ghiaccio, protetto dalla luce. </li><li> Preparare la miscela anticorpale primaria in PBS 1% BSA, 0,1% azide o PBS 1% BSA, 0,1% azide, 0,25% saponin, per la permeabilizzazione delle cellule per la colorazione intracellulare. </li><li> Aggiungere 100 μL di anticorpi primari mescolare (2x) e incubare per 30 minuti in ghiaccio, protetto dalla luce. NOTA: Tutti gli anticorpi devono essere titolati prima di condurre l&#39;esperimento per garantire risultati ottimali. </li><li> Lavare le cellule con 2 ml di PBS e centrifugare per 5 min (300 xg, 4 ° C). Ripetere questo passaggio tre volte. </li><li> Aggiungere 100 μL di un anticorpo secondario se gli anticorpi primari non sono direttamente coniugati a un fluoroforo e incubare per 30 minuti in ghiaccio, protetti dalla luce. </li><li> Lavare le cellule con 2 ml di PBS e centrifugare per 5 min a 300 xg a 4 ° C). Ripetere questo passaggio tre volte. </li><li> Fissare ilCellule con 100 μl 1% PFA per 15 minuti a temperatura ambiente, protetti dalla luce. NOTA: Attenzione: il PFA è tossico. Usare in una cappa aspirante e indossare equipaggiamento protettivo personale. </li><li> Lavare le cellule con 2 ml di PBS e centrifugare per 5 min a 300 xg a 4 ° C. Ripetere questo passaggio tre volte. </li><li> Resuspendere il pellet cellulare con 200 μl di PBS e procedere all&#39;acquisizione e all&#39;analisi della citometria a flusso. Seguire la strategia di gating in Figura 3 . </li></ol>

<ol><li>Ginhoux, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fate+mapping+analysis+reveals+that+adult+microglia+derive+from+primitive+macrophages%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Fate mapping analysis reveals that adult microglia derive from primitive macrophages.</a> Science. 330 (6005), 841-845 (2010).</li>
<li>Ginhoux, F., Lim, S., Hoeffel, G., Low, D., Huber, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Origin+and+differentiation+of+microglia%5BTitle%5D)+AND+%22Front+Cell+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Origin and differentiation of microglia.</a> Front Cell Neurosci. 7, 45(2013).</li>
<li>Ginhoux, F., Jung, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Monocytes+and+macrophages%3A+developmental+pathways+and+tissue+homeostasis%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Immunol%22%5BJournal%5D)">Monocytes and macrophages: developmental pathways and tissue homeostasis.</a> Nat Rev Immunol. 14 (6), 392-404 (2014).</li>
<li>Schulz, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+lineage+of+myeloid+cells+independent+of+Myb+and+hematopoietic+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">A lineage of myeloid cells independent of Myb and hematopoietic stem cells.</a> Science. 336 (6077), 86-90 (2012).</li>
<li>London, A., Cohen, M., Schwartz, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microglia+and+monocyte-derived+macrophages%3A+functionally+distinct+populations+that+act+in+concert+in+CNS+plasticity+and+repair%5BTitle%5D)+AND+%22Front+Cell+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Microglia and monocyte-derived macrophages: functionally distinct populations that act in concert in CNS plasticity and repair.</a> Front Cell Neurosci. 7, 34(2013).</li>
<li>Miron, V. E., Franklin, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Macrophages+and+CNS+remyelination%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurochem%22%5BJournal%5D)">Macrophages and CNS remyelination.</a> J Neurochem. 130 (2), 165-171 (2014).</li>
<li>Mildner, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Distinct+and+non-redundant+roles+of+microglia+and+myeloid+subsets+in+mouse+models+of+Alzheimer%27s+disease%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Distinct and non-redundant roles of microglia and myeloid subsets in mouse models of Alzheimer's disease.</a> J Neurosci. 31 (31), 11159-11171 (2011).</li>
<li>Boillee, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Onset+and+progression+in+inherited+ALS+determined+by+motor+neurons+and+microglia%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Onset and progression in inherited ALS determined by motor neurons and microglia.</a> Science. 312 (5778), 1389-1392 (2006).</li>
<li>Yamasaki, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Differential+roles+of+microglia+and+monocytes+in+the+inflamed+central+nervous+system%5BTitle%5D)+AND+%22J+Exp+Med%22%5BJournal%5D)">Differential roles of microglia and monocytes in the inflamed central nervous system.</a> J Exp Med. 211 (8), 1533-1549 (2014).</li>
<li>Wu, D. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Blockade+of+microglial+activation+is+neuroprotective+in+the+1-methyl-4-phenyl-1%2C2%2C3%2C6-tetrahydropyridine+mouse+model+of+Parkinson+disease%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Blockade of microglial activation is neuroprotective in the 1-methyl-4-phenyl-1,2,3,6-tetrahydropyridine mouse model of Parkinson disease.</a> J Neurosci. 22 (5), 1763-1771 (2002).</li>
<li>Cartier, N., Lewis, C. A., Zhang, R., Rossi, F. M. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/25107477">The role of microglia in human disease: therapeutic tool or target?</a> Acta Neuropathol. 128 (3), 363-380 (2014).</li>
<li>Ajami, B., Bennett, J. L., Krieger, C., McNagny, K. M., Rossi, F. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Infiltrating+monocytes+trigger+EAE+progression%2C+but+do+not+contribute+to+the+resident+microglia+pool%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Infiltrating monocytes trigger EAE progression, but do not contribute to the resident microglia pool.</a> Nat Neurosci. 14 (9), 1142-1149 (2011).</li>
<li>Funk, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Characterization+of+peripheral+hematopoietic+stem+cells+and+monocytes+in+Parkinson%27s+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Mov+Disord%22%5BJournal%5D)">Characterization of peripheral hematopoietic stem cells and monocytes in Parkinson's disease.</a> Mov Disord. 28 (3), 392-395 (2013).</li>
<li>Butovsky, O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Modulating+inflammatory+monocytes+with+a+unique+microRNA+gene+signature+ameliorates+murine+ALS%5BTitle%5D)+AND+%22J+Clin+Invest%22%5BJournal%5D)">Modulating inflammatory monocytes with a unique microRNA gene signature ameliorates murine ALS.</a> J Clin Invest. 122 (9), 3063-3087 (2012).</li>
<li>Lewis, C. A., Solomon, J. N., Rossi, F. M., Krieger, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bone+marrow-derived+cells+in+the+central+nervous+system+of+a+mouse+model+of+amyotrophic+lateral+sclerosis+are+associated+with+blood+vessels+and+express+CX%283%29CR1%5BTitle%5D)+AND+%22Glia%22%5BJournal%5D)">Bone marrow-derived cells in the central nervous system of a mouse model of amyotrophic lateral sclerosis are associated with blood vessels and express CX(3)CR1.</a> Glia. 57 (13), 1410-1419 (2009).</li>
<li>Sedgwick, J. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+and+direct+characterization+of+resident+microglial+cells+from+the+normal+and+inflamed+central+nervous+system%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Isolation and direct characterization of resident microglial cells from the normal and inflamed central nervous system.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 88 (16), 7438-7442 (1991).</li>
<li>Ford, A. L., Goodsall, A. L., Hickey, W. F., Sedgwick, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Normal+adult+ramified+microglia+separated+from+other+central+nervous+system+macrophages+by+flow+cytometric+sorting.+Phenotypic+differences+defined+and+direct+ex+vivo+antigen+presentation+to+myelin+basic+protein-reactive+CD4%2B+T+cells+compared%5BTitle%5D)+AND+%22J+Immunol%22%5BJournal%5D)">Normal adult ramified microglia separated from other central nervous system macrophages by flow cytometric sorting. Phenotypic differences defined and direct ex vivo antigen presentation to myelin basic protein-reactive CD4+ T cells compared.</a> J Immunol. 154 (9), 4309-4321 (1995).</li>
<li>Martin, E., Boucher, C., Fontaine, B., Delarasse, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Distinct+inflammatory+phenotypes+of+microglia+and+monocyte-derived+macrophages+in+Alzheimer%27s+disease+models%3A+effects+of+aging+and+amyloid+pathology%5BTitle%5D)+AND+%22Aging+Cell%22%5BJournal%5D)">Distinct inflammatory phenotypes of microglia and monocyte-derived macrophages in Alzheimer's disease models: effects of aging and amyloid pathology.</a> Aging Cell. , (2016).</li>
<li>Bennett, M. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((New+tools+for+studying+microglia+in+the+mouse+and+human+CNS%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">New tools for studying microglia in the mouse and human CNS.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 113 (12), E1738-E1746 (2016).</li>
<li>Jin, L. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dysregulation+of+glutamine+transporter+SNAT1+in+Rett+syndrome+microglia%3A+a+mechanism+for+mitochondrial+dysfunction+and+neurotoxicity%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Dysregulation of glutamine transporter SNAT1 in Rett syndrome microglia: a mechanism for mitochondrial dysfunction and neurotoxicity.</a> J Neurosci. 35 (6), 2516-2529 (2015).</li>
<li>Bedi, S. S., Smith, P., Hetz, R. A., Xue, H., Cox, C. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Immunomagnetic+enrichment+and+flow+cytometric+characterization+of+mouse+microglia%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci+Methods%22%5BJournal%5D)">Immunomagnetic enrichment and flow cytometric characterization of mouse microglia.</a> J Neurosci Methods. 219 (1), 176-182 (2013).</li>
<li>Nikodemova, M., Watters, J. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Efficient+isolation+of+live+microglia+with+preserved+phenotypes+from+adult+mouse+brain%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neuroinflammation%22%5BJournal%5D)">Efficient isolation of live microglia with preserved phenotypes from adult mouse brain.</a> J Neuroinflammation. 9, 147(2012).</li>
<li>Mizutani, M., et al. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/22079990">The fractalkine receptor but not CCR2 is present on microglia from embryonic development throughout adulthood.</a> J Immunol. 188 (1), 29-36 (2012).</li>
<li>Lecoeur, H., Ledru, E., Gougeon, M. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+cytofluorometric+method+for+the+simultaneous+detection+of+both+intracellular+and+surface+antigens+of+apoptotic+peripheral+lymphocytes%5BTitle%5D)+AND+%22J+Immunol+Methods%22%5BJournal%5D)">A cytofluorometric method for the simultaneous detection of both intracellular and surface antigens of apoptotic peripheral lymphocytes.</a> J Immunol Methods. 217 (1-2), 11-26 (1998).</li>
<li>Richter, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Glioma-associated+microglia+and+macrophages%2Fmonocytes+display+distinct+electrophysiological+properties+and+do+not+communicate+via+gap+junctions%5BTitle%5D)+AND+%22Neurosci+Lett%22%5BJournal%5D)">Glioma-associated microglia and macrophages/monocytes display distinct electrophysiological properties and do not communicate via gap junctions.</a> Neurosci Lett. 583, 130-135 (2014).</li>
<li>Mahad, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Modulating+CCR2+and+CCL2+at+the+blood-brain+barrier%3A+relevance+for+multiple+sclerosis+pathogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Brain%22%5BJournal%5D)">Modulating CCR2 and CCL2 at the blood-brain barrier: relevance for multiple sclerosis pathogenesis.</a> Brain. 129 (Pt 1), 212-223 (2006).</li>
</ol>

Gli autori non hanno nulla da rivelare

È stato dimostrato che la microglia e l&#39;MDM hanno funzioni e fenotipi diversi nel CNS e quindi l&#39;identificazione e l&#39;analisi di queste subpopulazioni macrofagi sono essenziali per meglio capire le malattie neurologiche 9 , 18 , 25 . L&#39;analisi della citometria a flusso utilizzando due marcatori (CD11b e CD45) consente la distinzione tra ciascuna sottopopolazione ( Figura 3C ). Questa...

La microglia sono i macrofagi del tissue-residuo parenchimale del sistema nervoso centrale (CNS). Essi svolgono due ruoli funzionali chiave: difesa immunitaria e mantenimento dell&#39;omeostasi CNS. In contrasto con l&#39;MDM, che vengono continuamente rinnovate dalle cellule staminali ematopoietiche nel midollo osseo, le cellule microgliali si differenziano dalle cellule progenitrici primitive ematopoietiche originate dal sacco di tuorlo (YS) che colonizzarono il cervello durante lo sviluppo embrionale 1 , 2 , 3 . Nei roditori il fattore di trascrizione Myb svolge un ruolo fondamentale nello sviluppo di tutti i monociti e macrofagi derivanti dal midollo osseo, ma per Yglia microglia, questo fattore è dispensabile e la differenziazione rimane dipendente dal fattore di trascrizione PU.1. Nel sano CNS, microglia sono cellule dinamiche che continuamente esemplare il loro ambiente, scaNning e indagini per l&#39;invasione di patogeni o danni ai tessuti 5 . La rilevazione di tali segnali inizia un percorso per risolvere il danno. La microglia va rapidamente da una morfologia ramificata a quella amoboide, seguita da fagocitosi e rilascio di vari mediatori, come citochine pro o anti-infiammatorie. Pertanto, a seconda del loro microambiente, la microglia attivata può acquisire uno spettro di stati distinti di preparazione 6 . La microglia influenza profondamente lo sviluppo e la progressione di molti disturbi neurologici. Nei modelli roditori della malattia di Alzheimer (AD) 7 , della sclerosi laterale amyotrofica (ALS) 8 , della sclerosi multipla (MS) 9 o della malattia di Parkinson (PD) 10 , la microglia dimostra di svolgere un ruolo doppio, o indurre neurotossicità dannosa o agire In modo neuroprotettivo, che è dipendente oN la malattia specifica, la fase della malattia e se la malattia è stata influenzata dal vano immunitario sistemico 7 , 8 , 9 , 10 , 11 . La maggior parte delle lesioni CNS osservate nelle malattie citate sopra contengono una popolazione eterogenea di cellule mieloide, tra cui non solo microglia parenchimale, ma anche macrofagi perivascolari e meningiali, nonché MDM infiltrante CNS. Questi tipi di cellule possono contribuire in modo differenziato ai meccanismi patofisiologici legati alla lesione e alla riparazione 7 , 12 , 13 , 14 , 15 . La sfida attuale per gli investigatori che stanno studiando questi modelli di malattia è stabilire se i monociti e i macrofagi periferici si infiltrano nel CNS e, in caso affermativo, a distInguiare la microglia residente da queste cellule. Infatti, le cellule microgliali sono molto plastiche; Quando sono attivati, i marcatori di re-espressione di microglia che sono solitamente espressi da monociti e macrofagi periferici. La questione si basa pertanto sull&#39;individuazione di marcatori che possono distinguere la microglia residente dai monociti infiammatori e dai macrofagi. La discriminazione di queste popolazioni sulle fette del cervello mediante applicazioni immunohistologiche è limitata a causa della mancanza di anticorpi specifici. Tuttavia, l&#39;analisi della citometria a flusso è una tecnica efficace per valutare l&#39;espressione di diversi marcatori e per distinguere le popolazioni cellulari (ad esempio, i linfociti, i macrofagi / MDM CD11b + CD45 e microglia CD11b + CD45 med ), così come le sottopopolazioni di cellule 16 , 17 , 18 . Questo protocollo descrive le procedure per l&#39;isolamentoCellule mononucleari del topo CNS nei modelli di malattia neurologica utilizzando una dissociazione tissutale ottimizzata e enzimatica e una centrifugazione di gradiente di densità; Nonché un metodo per differenziare le popolazioni di microglia e MDM nel CNS utilizzando la citometria a flusso. Un altro approccio è quello di eliminare la mielina e purificare le cellule utilizzando perline magnetiche coniugate a specifici anticorpi 19 , 20 , 21 . La rimozione della mielina usando le perline magnetiche anti-mieline è più costosa e influenza la vitalità e la resa delle cellule isolate 22 . Questo passaggio e la seguente separazione immunomagnetica della microglia, limitano ulteriori studi di popolazioni specifiche delle cellule immunitarie 21 , 22 . Queste procedure forniscono un modo semplice per studiare le sottopopolazioni dei macrofagi nello sviluppo delle malattie, ePer determinare gli effetti farmacologici o le modificazioni geniche sui fenotipi macrofagi e sugli stati di attivazione.

<table><tbody><tr><td>Topi di 5 mesi</td><td>Janvier</td><td>C57BL/6J</td><td></td></tr><tr><td>Liberase TL Research Grade</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>5401020001</td><td>Enzima di digestione</td></tr><tr><td>Deossiribonucleasi I dal pancreas bovino</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>DN25</td><td></td></tr><tr><td>Percoll</td><td>GE Healthcare Life Sciences</td><td>17-0891-01</td><td>Gradiente di densità medio</td></tr><tr><td>Filtro cellulare dimensione 70 &; m Nylon</td><td>Corning</td><td>731751</td><td></td></tr><tr><td>Venofix 25 G</td><td>BRAUN</td><td>4056370</td><td></td></tr><tr><td>Siringa a pistone 10 mL</td><td>Terumo</td><td>SS+10ES1</td><td></td></tr><tr><td>Pipetta Pasteur 230 mm</td><td>Dustcher</td><td>20420</td><td></td></tr><tr><td>Provetta da 1,5 mL</td><td>Eppendorf</td><td>0030 123.328</td><td></td></tr><tr><td>Provetta da 15 mL</td><td>TPP</td><td>91015</td><td></td></tr><tr><td>Provetta da 50 mL</td><td>TPP</td><td>91050</td><td></td></tr><tr><td>5 mL tubo fondo tondo in polistirene</td><td>BD Falcon</td><td>352054</td><td></td></tr><tr><td>D-PBS (1x) senza Ca2+/Mg2+</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>14190-094</td><td></td></tr><tr><td>D-PBS (10x) senza Ca2+/Mg2+</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>14200-067</td><td></td></tr><tr><td>Siero fetale bovino</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>10270-106</td><td></td></tr><tr><td>EDTA</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>E4884</td><td></td></tr><tr><td>Siero bovino Soluzione di albumina 30%</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A7284</td><td></td></tr><tr><td>Paraformaldeide 32% Soluzione</td><td>di microscopia elettronica</td><td>Scienze 15714-S</td><td>Attenzione -Saponina tossica</td></tr><tr><td></td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S2002</td><td></td></tr><tr><td>Azide di sodio</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>47036</td><td></td></tr><tr><td>PerCPCy5.5 Anti-topo di ratto CD11b (clone M1/70)</td><td>eBioscience</td><td>45-0112</td><td></td></tr><tr><td>Controllo dell'isotipo K IgG2b di ratto PerCP-Cianina5.5</td><td>eBioscience</td><td>45-4031</td><td></td></tr><tr><td>BV421 Anti-topo di ratto CD45 (clone 30-F11)</td><td>BD Biosciences</td><td>563890</td><td></td></tr><tr><td>BV421 IgG2b di ratto, &kappa; Controllo isotipo RUO</td><td>BD Biosciences</td><td>562603</td><td></td></tr><tr><td>Coniglio anti-topo TMEM119 (clone28 - 3)</td><td>Abcam</td><td>ab209064</td><td></td></tr><tr><td>AlexaFluor 647 Asino anti-coniglio IgG</td><td>Life Technologies</td><td>A31573</td><td></td></tr><tr><td>Anti-topo CD16/CD32 Purificato</td><td>eBioscience</td><td>14-0161</td><td>Mouse Fc Block</td></tr><tr><td>Kit di colorazione di cellule morte riparabili</td><td>Invitrogen</td><td>L34969</td><td></td></tr><tr><td>Anticorpo coniugato APC CCR2 di topo</td><td>R& D</td><td>FAB5538A</td><td></td></tr><tr><td>R& controllo isotipo coniugato APC IgG2B di ratto</td><td> D</td><td>IC013A</td><td></td></tr><tr><td>Anticorpo coniugato PE di topo CX3CR1</td><td>R& D</td><td>FAB5825P</td><td></td></tr><tr><td>IgG di capra PE-coniugato Anticorpo</td><td>R& D</td><td>IC108P</td><td></td></tr><tr><td>Centrifuga</td><td>Eppendorf</td><td>5804R</td><td></td></tr><tr><td>Analizzatore cellulare</td><td>BD Biosciences</td><td>BD FACSVERSE</td><td></td></tr><tr><td>Software di analisi dati</td><td>FlowJo LLC</td><td>FlowJo</td><td></td></tr><tr><td>Forbici fini</td><td>F.S.T</td><td>14090-11</td><td></td></tr><tr><td>Forcipe modello standard</td><td>F.S.T</td><td>11000-13</td><td></td></tr><tr><td>Forbici Mayo</td><td>F.S.T</td><td>14010-15</td><td></td></tr><tr><td>Dumont #5 Pinze</td><td>F.S.T</td><td>11251-20</td><td></td></tr></tbody></table>

analisi dei macrofagi microglia e dei monociti dal sistema nervoso centrale dalla citometria del flusso

Analysis of Microglia and Monocyte-derived Macrophages from the Central Nervous System by Flow Cytometry

Numerosi studi hanno dimostrato il ruolo delle cellule immunitarie, in particolare dei macrofagi, nelle patologie del sistema nervoso centrale (CNS). Esistono due principali popolazioni di macrofagi nel CNS: (i) la microglia, che sono i macrofagi residenti del CNS e sono derivate da progenitori di sacchi di tuorlo durante l&#39;embriogenesi e (ii) i macrofagi derivanti da monociti (MDM), che possono infiltrarsi Il CNS durante la malattia e sono derivate da progenitori del midollo osseo. I ruoli di ciascuna sottopopolazione dei macrofagi variano a seconda della patologia studiata. Inoltre, non esiste un consenso sui marcatori istologici o sui criteri distintivi utilizzati per queste sottopopolazioni macrofagi. Tuttavia, l&#39;analisi dei profili di espressione dei marker CD11b e CD45 mediante citometria a flusso ci consente di distinguere la microglia (CD11b + CD45 med ) dall&#39; MDM (CD11b + CD45 alta ). In questo protocollo mostriamo che la centrifugazione di gradiente di densitàE l&#39;analisi della citometria a flusso può essere utilizzata per caratterizzare queste subpopulazioni del macrofago del CNS e per studiare diversi marcatori di interesse espressi da queste cellule come abbiamo recentemente pubblicato. Così, questa tecnica può ulteriormente comprendere il ruolo dei macrofagi nei modelli di topi di malattie neurologiche e può anche essere usato per valutare gli effetti della droga su queste cellule.

Dopo la centrifugazione di gradiente di densità e la colorazione degli anticorpi, le cellule sono state acquisite su un citometro di flusso e analizzate utilizzando una strategia di gating morfologica come segue. Un primo cancello è stato definito nella zona di puntamento di Forward-Spattered-Area (FSC-A) rispetto alla Forward-Spattered-Height (FSC-H) per discriminare singole celle da dublets ( Figura 3A ). Le singole cellule sono state quindi gated...

Questo protocollo fornisce un&#39;analisi delle subpopulazioni del macrofage nel sistema nervoso centrale del mouse adulto mediante citometria a flusso ed è utile per lo studio di marcatori multipli espressi da queste cellule.

Analisi dei Macrofagi Microglia e dei Monociti dal Sistema Nervoso Centrale dalla Citometria del Flusso

Numerous studies have demonstrated the role of immune cells, in particular macrophages, in central nervous system (CNS) pathologies. There are two main ...

L'obiettivo generale di questo esperimento è valutare i diversi marcatori espressi dalle sottopopolazioni di macrofagi all'interno del sistema nervoso centrale o SNC. Questo metodo può contribuire a rispondere a domande fondamentali nel campo della neuroimmunologia, come il ruolo dei macrofagi duperry nel SNC durante episodi di vertigini, e quali siano i fenotipi dei macrofagi nel SNC. I principali vantaggi di questa tecnica sono l'isolamento di un elevato numero di sottopopolazioni di macrofagi altamente purificate, nonché la caratterizzazione dei marcatori cellulari delle sottopopolazioni di macrofagi.Iniziare utilizzando forbici fini per tagliare la cute ventrale appena al di sotto del processo xifoidi per esporre la cavità toracica. Praticare un'incisione nel diaframma e tagliare le parti laterali della gabbia toracica in direzione caudo-rostrale per esporre il cuore. Dopo aver identificato il ventricolo sinistro e l'atrio destro, inserire un catetere a farfalla con un ago da 25 gauge nel ventricolo sinistro.Eseguire un'incisione sull'atrio destro e iniziare a perfondere 20 millilitri di PBS attraverso il catetere a un ritmo di dieci millilitri al minuto non appena inizia a scorrere il sangue. Una perfusione riuscita sarà indicata dall'ispallidimento dei polmoni e del fegato man mano che il sangue viene spostato. Successivamente, utilizzare forbici fini per dissezionare la colonna vertebrale.Escidere la muscolatura della parete addominale sul lato ventrale della colonna vertebrale e tagliare la colonna vertebrale alla base della coda per rimuovere la spina durante il prelievo. Inserire una siringa da dieci millilitri di PBS dotata di una punta pipetta modificata da 200 microlitri nel lato lombare della colonna vertebrale. Quindi lavare il midollo spinale dal lato cervicale.Rimuovere la pelle sopra il cranio e inserire una punta delle forbici alla base del cranio. Tagliare il cranio seguendo la sutura sagittale. Quindi inserire una pinzetta fine nel taglio ed eliminare delicatamente la parte superiore del cranio.Dissezionare il cervello dalla testa del topo e rimuovere il bulbo olfattivo e il cervelletto. Successivamente, posizionare il cervello e il midollo spinale in una provetta da un virgola cinque millilitri contenente un virgola uno due otto millilitri di cocktail di digestione. Per dissociare le cellule, utilizzare forbici piccole per tagliare finemente il cervello e il midollo spinale in pezzi di uno-due millimetri cubi e collocare i pezzi a 37 gradi Celsius e cinque percento di Anidride Carbonica per 30 minuti.Al termine dell'incubazione, arrestare la digestione con 20 microlitri di EDTA 0,5 M, seguita da una triturazione delicata con una pipetta da 5 millilitri. Filtrare la sospensione cellulare ottenuta attraverso un filtro mesh da 70 micron in un tubo conico da 50 millilitri, utilizzando lo stantuffo di una siringa da 10 millilitri per macerare delicatamente qualsiasi tessuto residuo di cervello o midollo spinale. Risciacquare il filtro con 20 millilitri di PBS contenente il 5% di FBS.E raccogliere le cellule filtrate mediante centrifugazione. Quindi, aspirare con attenzione il soprannatante senza disturbare il pellet. Per la separazione delle cellule mediante gradiente di densità, sospendiamo il pellet con quattro millilitri di mezzo a gradiente di densità al 30 percento e trasferiamo le cellule in un tubo conico da 15 millilitri.Sottostrato delicatamente quattro millilitri di mezzo a gradiente di densità al 37 percento, seguiti da quattro millilitri di mezzo a gradiente di densità al 70 percento sotto il mezzo a gradiente di densità al 37 percento. Trasferire il tubo in una centrifuga da banco per separare le cellule. Le cellule microgliali e i macrofagi si troveranno all'interfaccia tra gli strati di gradiente di densità al 70 e al 37 percento.Il tubo apparirà stratificato. Dopo aver rimosso con attenzione lo strato superiore di mielina, trasferire tre-quattro millilitri dello strato intermedio di microglia e macrofagi in un nuovo tubo da 15 millilitri. Successivamente, lavare le cellule immunitarie con tre centrifugazioni in 15 millilitri di PBS, risospendendo il pellet in un millilitro di PBS dopo l'ultimo lavaggio.Per valutare l'espressione dei marcatori delle sottopopolazioni di macrofagi, trasferire le cellule in un tubo da cinque millilitri per analisi in citometria a flusso, seguito dall'aggiunta di un microlitro di reagente vitalizio fissabile. Dopo 30 minuti sul ghiaccio, protetto dalla luce, lavare i campioni con due millilitri di PBS e risospendere il pellet in 400 microlitri di buffer fax per ogni tubo di analisi sperimentale. Suddividere le cellule nel numero appropriato di tubi da cinque millilitri per analisi in citometria a flusso.Quindi bloccare il legame non specifico dei recettori Fc con un microgrammo di cocktail di anticorpi bloccanti CD16/CD32 per 100 microlitri di cellule, incubando per 10-15 minuti sul ghiaccio e al buio. Successivamente, etichettare le cellule con 100 microlitri degli anticorpi primari appropriati, incubando per 30 minuti sul ghiaccio e al buio. Al termine dell'incubazione, lavare le cellule quattro volte con due millilitri di PBS.Quindi aggiungere 100 microlitri degli opportuni anticorpi secondari per 30 minuti sul ghiaccio, al riparo dalla luce, seguiti da quattro lavaggi in PBS come appena dimostrato. Dopo l'ultimo lavaggio, risospendere delicatamente i pellet in 100 microlitri di paraformaldeide al uno percento per 15 minuti a temperatura ambiente, al riparo dalla luce. Successivamente lavare le cellule quattro volte in PBS.Risospendere i pellet finali in 200 microlitri di PBS fresco ed analizzare le cellule mediante citometria a flusso. Le microglia derivate dal cervello e dal midollo spinale e i macrofagi derivati dai monociti vengono identificati in base all'espressione di CD11B e CD45. L'espressione di CX3CR1 e Tmem119 da parte delle cellule microgliali CD11B positive e CD45 di intensità media consente di distinguere ulteriormente questa popolazione cellulare dai macrofagi derivati dai monociti CD11C positivi e CD45 ad alta intensità, che non esprimono nessuno di questi marcatori, ma esprimono CCR2.Dopo la separazione mediante gradiente di densità, dall'85 al 95 percento delle cellule è ancora vitale. In assenza di isolamento mediante gradiente di densità, le sottopopolazioni di macrofagi non sono identificabili in un grafico di dispersione bifrontale, a causa della presenza di cellule non macrofagiche e di detriti mielinici. Poiché l'epitopo riconosciuto dall'anticorpo anti-Tmem119 è intracellulare, è necessaria la permeabilizzazione per l'etichettatura di questo importante marcatore cellulare microgliale.Si noti che la permeabilizzazione induce un raggrinzimento cellulare, facendo apparire le sottopopolazioni di macrofagi più piccole nell'analisi di scattering anteriore rispetto a quello laterale. Una volta acquisita padronanza, questa tecnica può essere completata in cinque ore se eseguita correttamente. Mentre tentavo questa procedura, è importante ricordare di preparare con grande attenzione il gradiente di densità.Al termine di questa procedura, altri metodi, come la rt-PCR quantitativa, possono essere eseguiti per rispondere ad ulteriori domande riguardanti le vie di segnalazione delle sottopopolazioni di macrofagi. Dopo il suo sviluppo, questa tecnica ha aperto la strada ai ricercatori nel campo delle neuroscienze per esplorare l'attivazione delle sottopopolazioni di macrofagi in modelli murini di malattie neurologiche. Dopo aver visto questo video, dovreste eseguire analisi o seguire questa metodica per identificare le sottopopolazioni di macrofagi mediante citometria a flusso.Ricordare che lavorare con paraformaldeide può essere estremamente pericoloso e che precauzioni come l'utilizzo di una cappa devono essere sempre adottate durante l'esecuzione di questa procedura.

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Immunology and Infection

Immunologia e Infezioni

Microglia risiedono macrofagi che forniscono la prima linea di difesa e sorveglianza immunitaria del sistema nervoso centrale. I microRNA sono molecole regolatrici che svolgono un ruolo importante in molti processi fisiologici tra cui l'attivazione e la differenziazione dei macrofagi. In questo articolo, si descrive il metodo per la misurazione dei microRNA in cellule microgliali.

Rilevamento dei microRNA nella microglia da Real-time PCR in CNS normale e durante neuroinfiammazione

Questo video dimostra la citometria a flusso per misurare l'assorbimento microgliale di bioparticelle fluorescenti dopo la somministrazione intravitreale in un occhio di topo. La citometria a flusso rileva le cellule vive che esprimono CD11b e distingue le cellule della microglia fagocitaria che mostrano fluorescenza verde da altre cellule mieloidi, inclusi i monociti che esprimono Ly6C e i neutrofili che esprimono Ly6G.

Misurazione dell'assorbimento microgliale di particelle fluorescenti erogate per via intravitreale mediante citometria a flusso

fagocitosi microglia è fondamentale per il mantenimento della omeostasi tissutale e fagocitaria inadeguata è stato implicato nella patologia. Tuttavia, valutare la funzione microglia in vivo è tecnicamente impegnativo. Abbiamo sviluppato una tecnica semplice ma robusto per monitorare e quantificare il potenziale di fagocitosi microglia in un ambiente fisiologico preciso.

La valutazione della retina microglia fagocitaria Funzione<em&gt; In Vivo</em&gt; Usando un test citometria a flusso basato su

Analisi quantitativa del contenuto della cella all'interno del nervo sciatico murino è difficile a causa della scarsità del tessuto. Questo protocollo descrive un metodo per la digestione del tessuto e preparazione che fornisce cellule sufficienti per analisi di citometria a flusso delle popolazioni delle cellule immuni dai nervi dei topi individuali.

Analisi delle cellule immuni in singolo nervo sciatico e del ganglio della radice dorsale da un singolo Mouse mediante citometria a flusso

Un protocollo per l'isolamento di microglia primaria dal cervello murino è presentato. Questa tecnica aiuta a promuovere la comprensione corrente di condizioni neurologiche. Centrifugazione in gradiente di densità e separazione magnetica sono combinati per produrre sufficiente resa di un campione altamente puro. Inoltre, abbiamo delineare i passaggi per la caratterizzazione di microglia.

Caratterizzazione e isolamento di Mouse Microglia primaria di centrifugazione in gradiente di densità

Questo protocollo fornisce un metodo per digerire interi occhi in una singola sospensione cellulare ai fini dell'analisi citometrica del flusso multi-parametro al fine di identificare specifiche popolazioni fagocitiche mononucleari oculari, inclusi monociti, microglia, macrofagi e cellule dendritiche.

Digestione di interi occhi di topo per l'analisi citometrica a flusso multi-parametro dei fagociti mononucleari

Qui presentiamo due protocolli per quantificare l'inghiottimento microgliale delle sinapsi vGLUT1-positive e dei sinaptosomi grezzi marcati con pHRodo Red utilizzando la citometria a flusso.

Quantificazione dell'inghiottimento microgliale di materiale sinaptico mediante citometria a flusso

L'identificazione delle microglia (MG) e dei macrofagi infiltranti periferici (Mø) nel midollo spinale danneggiato è difficile. In questo protocollo, la citometria a flusso (FCM) è stata utilizzata per identificare rispettivamente M1-like MG, M2-like MG, M1-like Mø e M2-like Mø. Questa tecnologia può essere applicata anche ad altre malattie del sistema nervoso centrale per comprendere il ruolo di MG e Mø.

Identificazione della microglia e dei macrofagi infiltranti periferici nel midollo spinale danneggiato mediante citometria a flusso

Qui, presentiamo un protocollo per valutare la funzione delle cellule immunitarie dopo ictus ischemico utilizzando l'analisi citofluorimetrica in un modello di mini-ictus. Questo metodo consente un esame dettagliato delle interazioni neuroimmunitarie e può essere adattato per lo studio di altre malattie neurodegenerative, migliorando la nostra comprensione delle risposte immunitarie nella patologia dell'ictus.

Isolamento e valutazione citofluorimetrica delle interazioni neuroimmunitarie in un modello murino di mini-ictus

Questo protocollo combina la citometria a flusso e il sequenziamento dell'RNA a singola cellula per isolare e caratterizzare gli stati delle cellule microgliali nel cervelletto dei cervelli di topo postnatale precoce. Utilizza la dissociazione enzimatica, la centrifugazione Percoll e l'immunocolorazione per rivelare l'eterogeneità delle microglia e migliorare la comprensione del loro ruolo nello sviluppo e nella malattia cerebellare.

Citometria a flusso e analisi di singole cellule per caratterizzare l'attivazione della microglia nello sviluppo precoce del cervello di topo postnatale

Impara a isolare e analizzare le sottopopolazioni di macrofagi del sistema nervoso centrale mediante citometria a flusso nel topo adulto. Questo protocollo consente di caratterizzare marcatori specifici di microglia e macrofagi.

Analisi dei Macrofagi Microglia e dei Monociti dal Sistema Nervoso Centrale dalla Citometria del Flusso

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