Isolamento delle cellule della ganglioma della retina primaria (RGC) mediante citometria a flusso

Milioni di persone soffrono di malattie degenerative della retina che provocano cecità irreversibile. Un elemento comune di molte di queste malattie è la perdita delle cellule del ganglio retinico (RGC). Questo protocollo dettagliato descrive l'isolamento di RGC murine primari mediante selezione positiva e negativa con citometria a flusso.

L'obiettivo generale di questa procedura è quello di isolare una popolazione omogenea arricchita di cellule gangliari retiniche murine primarie. Questo metodo può aiutare a rispondere a domande nel campo delle cellule gangliari retiniche sui meccanismi alla base del declino dell'acuità visiva nelle popolazioni di età e nelle popolazioni di malattie degenerative della retina. Il vantaggio principale di questa tecnica è che può offrire un protocollo veloce, visibile, riproducibile e standardizzato per l'isolamento di cellule gangliari retiniche murine primarie arricchite.

Abbiamo avuto l'idea di questo metodo quando Sumana Chintalapudi, che all'epoca era una studentessa laureata nel mio laboratorio e prima autrice di questo studio, ha presentato al nostro journal club un articolo del 2013 di Krishna Murtheadol, e il loro studio ha chiaramente dimostrato che la linea cellulare a cinque cellule RGC, che è stata originariamente generata come una linea cellulare di ganglio retinico di ratto immortalizzata, non era più di origine rattica, né possedeva il fenotipo RGC. Ci è diventato evidente che questo problema lasciava una grande lacuna nelle risorse disponibili per la comunità di ricerca sulla vista, compreso il nostro laboratorio. Sumana ed io abbiamo contattato il Dr. Morales-Tirado e insieme abbiamo sviluppato un nuovo metodo per isolare RGC vivi e altamente arricchiti.

In generale, gli individui che non conoscono questo metodo avranno difficoltà perché gli obiettivi di questo metodo sono isolare una popolazione cellulare viva e altamente arricchita che può essere coltivata come cellule primarie o immortalizzata come linea cellulare. Per questo motivo bisogna stare molto attenti a non danneggiare le cellule che si sta cercando di isolare. Inoltre, i parametri del metodo di smistamento cellulare devono essere adattati alle cellule specifiche che si sta cercando di isolare.

Entrambi i metodi richiedono competenze speciali. A dimostrare le procedure saranno il Dr.Xiang Di Wang, un ricercatore associato del laboratorio del Dr.Jablonski, e il Mr.Zach Goldsmith, dottorando del mio laboratorio. Per enucleare l'occhio, inserire prima una pinza sotto il globo oculare.

Afferrare il nervo ottico e tirare verso l'alto. Il globo sarà enucleato con il nervo ottico intatto. Metti l'occhio in una fiala di PBS con ghiaccio ed enuclea l'altro occhio.

Quando tutti gli occhi sono stati raccolti, mettere un occhio in una capsula di Petri di PBS fresco sotto un microscopio da dissezione e usare una pinza per afferrare con cura il globo alla base del nervo ottico. Usando un ago affilato calibro 30, perforare la cornea per consentire all'umore acqueo di drenare, facilitando la presa dell'occhio con il forcipe. Tenendo la cornea con la pinza, usa le forbici per praticare una piccola incisione nel tessuto corneale e usa la pinza per staccare delicatamente la cornea e la sclera.

Quando il globo è staccato a metà, usa la pinza per srotolare la retina e il cristallino. Posizionare la retina in una piccola capsula di Petri da 40 millimetri contenente PBS e 1% FPS in una cabina di biosicurezza e lavare la retina tre volte in PBS fresco più FBS per ogni lavaggio. Quando tutti gli occhi sono stati lavati, posizionare fino a 12 retine su un colino di nylon sterile da 70 micron inumidito con PBS e FBS e macerare delicatamente le retine con l'estremità posteriore di uno stantuffo da siringa da 10 millilitri, con un movimento circolare.

Quando tutte le cellule sono state dissociate, posizionare il filtro su una provetta di raccolta in polipropilene e utilizzare una pipetta P1000 per filtrare le cellule attraverso il filtro nella provetta di raccolta. Sciacquare il colino con PBS e FBS, raccogliendo il lavaggio nella provetta di raccolta. Aggiungere abbastanza PBS più FBS per portare il volume finale fino a un millilitro di soluzione per retina e raccogliere le cellule mediante centrifugazione.

Quindi, risospendere il pellet in PBS più FBS a un millilitro di terreno per cinque concentrazioni di retina, se l'immunomarcatura deve essere eseguita immediatamente. In alternativa, incubare le cellule risospese nel mezzo cellulare neurale durante la notte a quattro gradi Celsius in posizione orizzontale. Per immunomarcare le cellule retiniche, centrifugare la sospensione cellulare retinica e risospendere il pellet in 50 microlitri di PBS fresco più FBS in una provetta per fax.

Mettere da parte cinque volte da 10 a una sesta cella per il controllo negativo non etichettato. Successivamente, bloccare qualsiasi legame del recettore FC non specifico in ciascuna provetta con un microlitro di anticorpo anti topo CD 16 32 per una volta 10 alla sesta cellula, per 10 minuti a temperatura ambiente. Al termine dell'incubazione bloccante, aggiungere il cocktail di anticorpi di interesse alle cellule con un pipettaggio delicato per un'incubazione di 30 minuti su ghiaccio al riparo dalla luce.

Quindi lavare le cellule due volte in una formula un litro di volume finale di PBS e FBS. Etichettare le cellule con un anticorpo secondario appropriato per altri 30 minuti su ghiaccio al riparo dalla luce, seguiti da due lavaggi in PBS più FBS come appena dimostrato. Risospendere i pellet in PBS e FBS freschi per il conteggio delle cellule.

Per regolare la compensazione, aggiungere tre gocce di microsfere di polistirene in un tubo fax sterile per florafor e un microgrammo del rispettivo florafor per ogni tubo. Incubare le microsfere per 15 minuti a temperatura ambiente al riparo dalla luce. Quindi lavare le microsfere in tre millilitri di PBS e FBS e rimuovere con cura il surnatante.

Risospendere i pellet di microsfere in 250 microlitri di PBS e FBS e caricare la provetta del campione non etichettata sul citometro a flusso. Nel software del citometro a flusso, selezionare l'esperimento, l'impostazione della compensazione e creare i controlli di compensazione. Aggiungere la flora per controlli specifici dall'elenco visualizzato e fare clic su OK. Verificare la luce diffusa in avanti e lateralmente e bloccare la popolazione iniziale.

Quindi installare il tubo di controllo negativo sul citometro e fare clic su Carica. Verificare che sia visualizzata la popolazione di interesse o P1 e selezionare la popolazione. Fare clic con il pulsante destro del mouse sul cancello P1 e selezionare calcola compensazione.

Quindi fare clic su registra dati. Al termine della registrazione, fare clic su scarica per rimuovere il tubo e caricare il tubo di controllo successivo per regolare i controlli di compensazione. Quando tutti i campioni di controllo sono stati registrati, creare un grafico di dispersione diretto rispetto a quello laterale per la prima provetta sperimentale e selezionare la popolazione P1.

Quindi, apri un grafico a pseudo colori dell'altezza di dispersione laterale rispetto alla larghezza di dispersione laterale e gate le singole celle. Utilizzando le singole celle, creare un grafico dell'altezza di dispersione in avanti rispetto alla larghezza di dispersione in avanti e del gate per escludere i dublet. Quindi generare un grafico a pseudo colori CD48 rispetto a CD90.2 e a gate le cellule CD90.2 positive CD48 negative per eliminare i monociti, seguito da un grafico a pseudo colori CD57 rispetto a CD15 per eliminare eventuali contaminanti delle cellule amacrine.

Definire ora le popolazioni da raccogliere per il campione nel foglio di layout di ordinamento e ordinare le celle. Alla fine dell'ordinamento, utilizzare un'aliquota di 2,5 volte 10 alla quarta cella per confermare la purezza della popolazione cellulare isolata. Dopo aver ingranato le retine nel filtro cellulare, è possibile visualizzare più cellule retiniche interne, anche se le cellule gangliari retiniche hanno perso la loro morfologia caratteristica, a causa dell'assotomia durante la procedura di isolamento cellulare.

Il classico fenotipo di superficie CD48 negativo dye one positivo non è sufficiente per identificare e isolare le cellule gangliari retiniche mure, poiché queste cellule esprimono geni associati alle cellule epiteliali del pigmento mattinino, muller, bipolare, fotorecettore orizzontale e pigmento retinico. Le cellule selezionate esprimono anche marcatori intracellulari associati alle cellule gangliari retiniche come la sinucleina gamma, BRN3A, TUJ1 e RBPMS, con la localizzazione intracellulare dei marcatori ulteriormente confermata dalla citometria a flusso di imaging. Alcune delle cellule selezionate iniziano persino a mostrare la morfologia delle cellule gangliari retiniche dopo la coltura cellulare in vitro.

Inoltre, l'analisi PCR quantitativa della popolazione di cellule selezionate altamente arricchite rivela un aumento di molte volte dei geni che codificano per i marcatori intracellulari specifici del ganglio retinico. Una volta padroneggiata, questa tecnica può essere completata in meno di sei ore se eseguita correttamente. Durante il tentativo di questa procedura, è importante ricordare di mantenere sterile la sospensione cellulare, di bloccare i recettori FC dalla sospensione cellulare, di evitare il legame non specifico degli anticorpi e di discutere i dettagli o la strategia di smistamento cellulare con l'operatore del selezionatore cellulare.

Seguendo questa procedura, è possibile eseguire altri metodi come la QPCR per rispondere a ulteriori domande sulla profilazione dell'espressione genica. Non dimenticare che lavorare con attrezzature specializzate, come una selezionatrice cellulare, richiede un operatore altamente specializzato. Dopo il suo sviluppo, questa tecnica ha aperto la strada ai ricercatori nel campo della vista per aiutare a comprendere i meccanismi di sopravvivenza e morte nelle cellule gangliari retiniche, per lo sviluppo di nuove terapie per la conservazione della vista.

Dopo aver visto questo video, dovresti avere una buona comprensione di come isolare una popolazione omogenea arricchita di cellule gangliari retiniche murine primarie.