Name: Isolamento delle cellule della ganglioma della retina primaria (RGC) mediante citometria a flusso (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-07-05T15:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 1 s
Description: Impara l'isolamento di cellule gangliari retiniche primarie murine mediante citometria a flusso. Questo protocollo standardizzato e riproducibile consente di ottenere popolazioni cellulari vive e altamente arricchite per studiare le malattie degenerative retiniche.

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Gli autori vorrebbero ringraziare il Sig. Tim Higgins, Senior Illustrator del Dipartimento di Microbiologia, Immunologia e Biochimica, per l&#39;assistenza tecnica video; Il dottor Matthew W. Wilson per le discussioni ei membri dei laboratori Jablonski e Morales-Tirado per i loro commenti utili. Questo lavoro è stato sostenuto dall&#39;Istituto di Ricerca Giovani Investigatori dell&#39;Istituto di Ricerca di Alcon (VMM-T), dall&#39;Università della Tennessee Research Foundation (VMM-T), dall&#39;Istituto Nazionale di Occhi EY021200 (MMJ), dalla Gerwin Fellowship (VMM-T); La borsa di studio pre-dottorale di Gerwin (ZKG), la ricerca medica dell&#39;esercito della difesa e il comando dei materiali (VMM-T) e la sovvenzione senza restrizioni dalla ricerca per prevenire la cecità.

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</ol>

Gli autori dichiarano di non avere interessi finanziari concorrenti.

FACS è la tecnica di scelta per purificare le popolazioni cellulari. Altri metodi di isolamento includono immunopanning, perline magnetiche e depletionamento della fissazione del complemento. Il vantaggio di FACS rispetto a queste altre metodologie si basa sull&#39;identificazione simultanea di marcatori a superficie cellulare con gradi di intensità variabili. L&#39;intensità fluorescente della molecola è proporzionale alla quantità di espressione proteica. Fino ad ora l&#39;isolamento dei RGC è basato esclusivamente su...

I RGC sono terminali differenziati dai neuroni e pertanto sono necessarie le cellule primarie per la sperimentazione. Lo sviluppo di un protocollo per l&#39;isolamento e l&#39;arricchimento delle cellule primarie di ghiandole retiniche murine (RGCs) è fondamentale per rivelare i meccanismi di salute e degenerazione di RGC in vitro . Ciò è particolarmente importante per studi che cercano di generare potenziali terapie per promuovere la funzione RGC e per ridurre al minimo la loro morte. La degenerazione dei RGC è associata a malattie degenerative della retina, come il glaucoma, la retinopatia diabetica e l&#39;invecchiamento normale. Anche se i meccanismi cellulari specifici alla base della perdita di RGC non sono chiari, sono stati individuati una serie di fattori di rischio. La mancanza di ossigenazione alla testa del nervo ottico 1 , 2 , 3 provoca la morte di RGC 4 e funge da disturbo dell&#39;omeostasi tra l&#39;attivazione di eccitatori e iRecettori nhibitory all&#39;interno di singoli RGCs 5 , 6 . Una serie di sfide impediscono il progresso verso l&#39;uso di queste cellule per studi approfonditi. In primo luogo, il numero di RGC presenti in una retina murina è piccolo. RGC rappresentano meno dell&#39;1% delle cellule retiniche totali 7 , 8 , 9 . Secondo, la maggior parte dei marker RGC-specifici sono proteine ​​intracellulari 10 , 11 , 12 . La selezione basata su questi marcatori lascia le cellule inattive, che esclude le analisi funzionali a valle. Infine, i protocolli attualmente disponibili sono lunghi e mancano la standardizzazione 13 , 14 . I primi protocolli di isolamento RGC sono stati basati su metodi di immunopanning. Barres et al. 15 Adattato il classico immunoplayAnnotando la tecnica e ha aggiunto un secondo passo, che escludeva monociti e cellule endoteliali dalla maggior parte delle cellule retiniche prima della selezione positiva basata sull&#39;immunopositività all&#39;antigene anti-timocitico (aka Thy1), un marker di superficie cellulare. Anni dopo, Hong et al. Tecniche di isolamento del tallone magnetico combinato con strategie di selezione delle cellule per isolare RGC con purezza superiore 16 . L&#39;uso di perline magnetiche è ancora utilizzato in molte applicazioni scientifiche. Insieme, i branelli magnetici ei protocolli di citometria di flusso hanno migliorato la purezza delle cellule isolate. Tuttavia, questi sistemi di purificazione non sono ancora stati standardizzati per l&#39;isolamento dei RGC murini da retina dissociata. La citometria di flusso è un potente metodo analitico che misura le caratteristiche ottiche e fluorescenti delle sospensioni cellulari. Le cellule sono analizzate in modo quantitativo e qualitativo con un elevato livello di sensibilità, fornendo un&#39;analisi multidimensionale del populino cellularezione. La discriminazione cellulare si basa su due principali proprietà fisiche: dimensione delle cellule o superficie e granularità o complessità interna 17 . È possibile eseguire un&#39;analisi multidimensionale combinando anticorpi tagliati con fluorochromi che presentano lunghezze d&#39;onda simili e diverse emissioni. La citometria del flusso è veloce, riproducibile e sensibile. I laser Multitpe permettono di analisi multidimensionali ancora più grandi di singole cellule mediante citometria a flusso. Quindi è una metodologia attraente per lo studio di campioni citologici. La classificazione delle cellule attivata con fluorescenza (FACS) utilizza le differenze fenotipiche multidimensionali identificate dalla citometria di flusso per ordinare singole cellule in sottopopolazioni distinte. Nell&#39;ultimo decennio, proteine ​​multiple e proteine ​​intracellulari sono state identificate come potenziali biomarcatori per la selezione delle cellule, compresi i neuroni. Gli studi iniziali che cercavano di isolare i RGC dai topi utilizzavano Thy1 come un ganglio celL marker. Purtroppo, Thy1, aka CD90, ha diverse isoforme in altre specie di roditore 18 , 19 e 20 ed è espresso da più tipi di cellule retiniche 19 , 20 , rendendolo un marker non specifico per i RGC. Un altro marcatore di superficie, CD48, si trova sulle popolazioni monocitiche nella retina, tra cui macrofagi e microglia. Usando questi due marcatori di superficie, una delle cellule negate di RGC firmate Thy1 + e CD48 è stata sviluppata 15 , 16 , 21 , 22 . Purtroppo, questi due criteri di selezione non sono sufficienti per selezionare una popolazione RGC altamente arricchita. Per affrontare questa necessità non soddisfatta, è stato sviluppato un protocollo di citometria di flusso 23 basato su criteri di selezione positivi e negativi multi-layer usiI marker di superficie delle cellule noti per arricchire e purificare RGC murine primarie.

<table><tbody><tr><td>Anti-topo CD15 PE</td><td>BioLegend</td><td>125606</td><td>Clone MC-480</td></tr><tr><td>Anti-topo CD48 PE-Cy7</td><td>BioLegend</td><td>103424</td><td>Clone HM48-1</td></tr><tr><td>Anti-topo CD57</td><td>Sigma Aldrich</td><td>C6680-100TST</td><td>Clone VC1.1</td></tr><tr><td>Anti-topo CD90.2 AF700</td><td>BioLegend</td><td>105320</td><td>Clone 30-H12</td></tr><tr><td>Brilliant Violet 421 Capra Anti-topo IgG</td><td>BioLegend</td><td>405317</td><td>Clone Poly4053</td></tr><tr><td>Purificato Anti-topo CD16/32</td><td>BioLegend</td><td>101302</td><td>FcgRII/III blocco, Clone 93</td></tr><tr><td>Zombie Aqua&nbsp;</td><td>BioLegend</td><td>423102</td><td>Discriminazione di cellule vive/cellule morte</td></tr><tr><td>Siero fetale bovino</td><td>Hyclone</td><td>SH30071.03</td><td>Origine statunitense</td></tr><tr><td>AbC Kit di perline di compensazione degli anticorpi totali</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>A10497</td><td>Ig multispecie</td></tr><tr><td>Neurobasal Medium</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>21103049</td><td>Aggiungere il siero al terreno prima della coltura.</td></tr><tr><td>Soluzione salina tamponata con fosfato (PBS)</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>10010049</td><td>soluzione salina</td></tr><tr><td>Microscopio di dissezione</td><td>Olympus</td><td>modello SZ-PT</td><td>Stereomicroscopio</td></tr><tr><td>Sorvall Centrifuga</td><td>Thermo Scientific</td><td>ST 16R</td><td>Tutte le centrifugazioni eseguite sulla</td></tr><tr><td>piastra di base RT Padella di dissezione</td><td>Fisher Scientific</td><td>SB15233FIM</td><td>Si può utilizzare anche una piastra di cera</td></tr><tr><td>Pinze</td><td>Aesculap</td><td>5002-7</td><td>4 &frac12; pollici</td></tr><tr><td>Forbici dell'iride, dritte</td><td>Aesculap</td><td>1360</td><td>5 & frac12; pollici</td></tr><tr><td>Falcon 15 mL provette coniche</td><td>Fisher Scientific</td><td>352097</td><td>Provette in polipropilene</td></tr><tr><td>Falcon 50 mL provette coniche</td><td>Fisher Scientific</td><td>352098</td><td>Provette in polipropilene</td></tr><tr><td>BD FACS Provette</td><td>Fisher Scientific 352003</td><td></td><td>Provette in polipropilene</td></tr><tr><td>da 40 mm Piastre</td><td>MidSci</td><td>TP93040</td><td>Coltura tissutale trattata</td></tr><tr><td>70 &mu; m filtro in nylon</td><td>MidSci</td><td>70ICS</td><td>sterile</td></tr><tr><td>40 &mu; m filtro in nylon</td><td>MidSci</td><td>40ICS</td><td>sterile</td></tr><tr><td>&nbsp; Siringa BD 10 mL Siringa</td> monouso <td>Fisher Scientific</td><td>301604</td><td>senza ago</td></tr><tr><td>Pestelli</td><td>MidSci</td><td>PEST</td><td>fiale sterili</td></tr><tr><td>Wheaton</td><td>Fisher Scientific</td><td>986734</td><td>No Liner</td></tr><tr><td>Ago BD 30 G Fisher</td><td>Scientific</td><td>305128</td> Camera di conteggio in vetro Bright-Line da <td>1 pollice</td></tr><tr><td></td><td>Fisher Scientific</td><td>0267151B</td><td>Emocitometro</td></tr><tr><td>Gibco Trypan blue 0,4% Solution</td><td>Fisher Scientific</td><td>15250061</td><td>Viability Dye</td></tr><tr><td>Eppendorf tubes</td><td>Fisher Scientific</td><td>05-402-25</td><td>1,5mL</td></tr><tr><td>EVOS Floid Cell Imaging</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>447113</td><td>Imaging a fluorescenza con obiettivo 20X</td></tr><tr><td>100% etanolo</td><td>Fisher Scientific</td><td>04-355-452</td><td>Utilizzato per produrre il 70% di etanolo</td></tr><tr><td>Pipetta Pipet-Lite LTS L-1000XLS+</td><td>Pipetta Rainin</td><td>17014282</td><td>LTS</td></tr><tr><td>Pipetta Pipet-Lite LTS L-200XLS+</td><td>Pipetta Rainin</td><td>17014391</td><td>LTS Pipetta</td></tr><tr><td>Pipet-Lite LTS L-20XLS+</td><td>Rainin</td><td>17014392</td><td>Portapipette LTS</td></tr><tr><td>LTS 1000 mL GPS-L1000S</td><td>Rainin</td><td>17005088</td><td>Blue Rack Puntali sterili</td></tr><tr><td>Rack LTS 250 mL GPS-L250S</td><td>Rainin</td><td>17005092</td><td>Green Rack Puntali sterili</td></tr><tr><td>LTS 20 mL GPS-L10S</td><td>Rainin</td><td>17005090</td><td>Red Rack Punte sterili</td></tr><tr><td>FACSAria II Selezionatore di cellule</td><td>BD Biosciences</td><td>N/A Ordine</td><td>personalizzato</td></tr><tr><td>LSR II Citometro</td><td>BD Biosciences</td><td>N/A Ordine</td><td>personalizzato</td></tr><tr><td>Abca8a</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>Mm00462440_m1</td><td>M&uuml; celle di ller</td></tr><tr><td>Aldh1al</td><td>Thermo Fisher Scientific Mm00657317_m1</td><td></td><td>M&uuml; celle di ller</td></tr><tr><td>Aqp4</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>Mm00802131_m1</td><td>Astrociti</td></tr><tr><td>Calb2</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>Mm00801461_m1</td><td>Amacrino, orizzontale</td></tr><tr><td>Cd68</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>Mm03047340_m1</td><td>Cellule epiteliali pigmentate retiniche</td></tr><tr><td>Gad2</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>Mm00484623_m1</td><td>Amacrine</td></tr><tr><td>Hprt</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>Mm01545399_m1</td><td>Mantenimento della casa gene</td></tr><tr><td>Lhx1</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>Mm01297482_m1</td><td>Horizontal</td></tr><tr><td>Lim2</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>Mm00624623_m1</td><td>Horizontal</td></tr><tr><td>Nrl</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>Mm00476550_m1</td><td>Fotorecettori</td></tr><tr><td>Ntrk1</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>Mm01219406_m1</td><td>Horizontal</td></tr><tr><td>PCp4</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>Mm00500973_m1</td><td>Bipolare, Amacrine</td></tr><tr><td>Pou4f1</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>Mm02343791_m1</td><td>Cellule</td></tr> <tr>gangliari retiniche<td>Prdx6</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>Mm00725435_s1</td><td>Astrociti</td></tr><tr><td>Prkca</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>Mm00440858_m1</td><td>Bipolare</td></tr><tr><td>Prox1</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>Mm00435969_m1</td><td>Horizontal</td></tr><tr><td>Pvalb</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>Mm00443100_m1</td><td>Amacrine</td></tr><tr><td>Rbpms</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>Mm02343791_m1</td><td>Cellule gangliari retiniche</td></tr><tr><td>Rom1</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>Mm00436364_g1</td><td>Fotorecettori</td></tr><tr><td>Rpe65</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>Mm00504133_m1</td><td>Cellule epiteliali pigmentate retiniche</td></tr><tr><td>Slc1a3</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>Mm00600697_m1</td><td>Astrocytes</td></tr><tr><td>Slc6a9</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>Mm00433662_m1</td><td>Amacrine</td></tr><tr><td>Sncg</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>Mm00488345_m1</td><td>Cellule gangliari retiniche</td></tr><tr><td>Tubb3</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>Mm00727586_s1</td><td>Cellule gangliari retiniche</td></tr><tr><td>Vim</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>Mm01333430_m1</td><td>M&uuml; celle</td></tr><tr><td>ller Taqman Universal Master Mix</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>4440047</td><td>reagente qPCR</td></tr><tr><td>miRNeasy Mini Kit</td><td>Qiagen</td><td>217004</td><td>Isolamento dell'RNA</td></tr><tr><td>SuperScript VILO Kit di sintesi del cDNA</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>11754250</td><td>sintesi del cDNA</td></tr><tr><td>Taqman PreAmp Master Mix</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>4391128</td><td>fase di pre-amplificazione</td></tr><tr><td>BD Cytofix/ Cytoperm</td><td>BD Biosciences</td><td>554714</td><td>Fissazione/ Permeabilizzazione Tampone</td></tr><tr><td>BD Perm/ Lavaggio</td><td>BD Biosciences</td><td>554723</td><td>Soluzione di permeabilizzazione</td></tr><tr><td>RBPMS</td><td>Santa Cruz Biotechnology</td><td>sc-86815</td><td>anticorpo intracellulare</td></tr><tr><td>SNCG</td><td>Gene Tex</td><td>GTX110483</td><td>anticorpo intracellulare</td></tr><tr><td>BRN3A</td><td>Santa Cruz Biotechnology</td><td>sc-8429</td><td>anticorpo intracellulare</td></tr><tr><td>TUJ1</td><td>BioLegend</td><td>801202</td><td>anticorpo intracellulare</td></tr></tbody></table>

isolamento delle cellule della ganglioma della retina primaria (rgc) mediante citometria a flusso

Isolation of Primary Murine Retinal Ganglion Cells (RGCs) by Flow Cytometry

Le malattie neurodegenerative spesso hanno un impatto devastante su coloro che sono colpiti. La perdita di cellule della ganglioma retinica (RGC) è implicata in una serie di malattie, tra cui la retinopatia diabetica e il glaucoma, oltre al normale invecchiamento. Nonostante la loro importanza, i RGCs sono stati estremamente difficili da studiare finora, in parte a causa del fatto che essi comprendono solo una piccola percentuale della grande varietà di cellule della retina. Inoltre, i metodi di isolamento attuali utilizzano marcatori intracellulari per identificare RGC, che producono cellule non vitali. Queste tecniche coinvolgono anche lunghi protocolli di isolamento, per cui esiste una mancanza di metodi pratici, standardizzati e affidabili per ottenere e isolare i RGC. Questo lavoro descrive un metodo efficiente, completo e affidabile per isolare i RGC primari dalla retina dei topi usando un protocollo basato sui criteri di selezione sia positivi che negativi. I metodi presentati consentono il futuro studio dei RGC, con l&#39;obiettivo di una migliore comprensione dei principaliDiminuzione dell&#39;acuità visiva che risulta dalla perdita di RGC funzionali nelle malattie neurodegenerative.

<html> Lo studio approfondito di RGC è ostacolato da molti fattori, tra cui la loro bassa frequenza e la mancanza di una metodologia robusta e standardizzata per il loro isolamento. La figura 1 mostra la metodologia utilizzata per l&#39;isolamento della retina. Variazioni nella procedura di enucleazione esistono in base al tipo di analisi, come se l&#39;enucleazione fa parte della sperimentazione in vivo 27 . L&#39;enucleazion...

Milioni di persone soffrono di malattie degenerative della retina che provocano cecità irreversibile. Un elemento comune di molte di queste malattie è la perdita delle cellule del ganglio retinico (RGC). Questo protocollo dettagliato descrive l&#39;isolamento di RGC murine primari mediante selezione positiva e negativa con citometria a flusso.

Isolamento delle cellule della ganglioma della retina primaria (RGC) mediante citometria a flusso

Neurodegenerative diseases often have a devastating impact on those affected. Retinal ganglion cell (RGC) loss is implicated in an array of diseases, ...

L'obiettivo generale di questa procedura è isolare una popolazione omogenea arricchita di cellule gangliari retiniche primarie di origine murina. Questo metodo può contribuire a rispondere a domande nel campo delle cellule gangliari retiniche riguardo ai meccanismi alla base del declino dell'acuità visiva nelle popolazioni anziane e in quelle affette da malattie degenerative della retina. Il principale vantaggio di questa tecnica è che può offrire un protocollo rapido, visibile, riproducibile e standardizzato per l'isolamento di cellule gangliari retiniche primarie murine arricchite.L'idea per questo metodo è nata quando Sumana Chintalapudi, all'epoca studentessa laureata nel mio laboratorio e prima autrice di questo studio, presentò al nostro club del giornale un articolo del 2013 di Krishna Murtheadol, il cui studio dimostrava chiaramente che la linea cellulare RGC five, originariamente sviluppata come linea immortale di cellule gangliari retiniche di ratto, non era più di origine ratina, né possedeva il fenotipo delle RGC. Ci siamo resi conto che questo problema lasciava un'ampia lacuna nelle risorse disponibili per la comunità di ricerca sulla visione, inclusa la nostra stessa struttura. Sumana ed io abbiamo contattato il dottor Morales-Tirado e insieme i tre abbiamo sviluppato un nuovo metodo per isolare RGC vive e altamente arricchite.Generalmente, le persone nuove a questo metodo incontreranno difficoltà perché gli obiettivi di questa tecnica consistono nell'isolare una popolazione cellulare vitale e altamente arricchita che può essere coltivata come cellule primarie oppure immortalizzata come linea cellulare. Per questo motivo, è necessario fare molta attenzione a non danneggiare le cellule che si desidera isolare. Inoltre, i parametri del metodo di sorting cellulare devono essere adattati alle specifiche cellule che si intende isolare.Entrambi i metodi richiedono competenze specifiche. A dimostrare le procedure saranno il dottor Xiang Di Wang, ricercatore associato del laboratorio della dottoressa Jablonski, e il signor Zach Goldsmith, dottorando del mio laboratorio. Per enucleare l'occhio, inserire prima le pinzette sotto il bulbo oculare.Afferrare il nervo ottico e sollevarlo. Il bulbo oculare verrà enucleato insieme al nervo ottico. Posizionare l'occhio in un flaconcino di PBS su ghiaccio ed enucleare l'altro occhio.Dopo aver raccolto tutti gli occhi, posizionarne uno in una piastra di Petri contenente PBS fresco sotto un microscopio stereoscopico ed usare una pinzetta per afferrare delicatamente il bulbo oculare alla base del nervo ottico. Utilizzando un ago affilato da 30 gauge, perforare la cornea per permettere il deflusso dell'umore acqueo, facilitando così la manipolazione dell'occhio con la pinzetta. Tenendo ferma la cornea con la pinzetta, usare un paio di forbici per praticare una piccola incisione nel tessuto corneale ed utilizzare quindi la pinzetta per rimuovere delicatamente la cornea e la sclera.Quando il globo oculare &egrave; stato pelato per met&agrave;, utilizzare la pinzetta per srotolare la retina e il cristallino. Posizionare la retina in una piccola piastra di Petri da 40 millimetri contenente PBS e 1% FPS all'interno di un armadio a sicurezza biologica e lavare la retina tre volte in PBS fresco aggiunto di FBS per ogni lavaggio. Una volta lavati tutti gli occhi, posizionare fino a 12 retinae su un setaccio sterile in nylon da 70 micron inumidito con PBS e FBS e macerare delicatamente le retinae con l'estremit&agrave; posteriore dello stantuffo di una siringa da 10 millilitri, utilizzando un movimento circolare.Una volta che tutte le cellule sono state dissociate, posizionare il filtro su un tubo di raccolta in polipropilene e utilizzare una pipetta P1000 per filtrare le cellule attraverso il filtro nel tubo di raccolta. Lavare il filtro con PBS e FBS, raccogliendo il lavaggio nel tubo di raccolta. Aggiungere PBS e FBS in quantità sufficiente da portare il volume finale a un millilitro di soluzione per retina e raccogliere le cellule mediante centrifugazione.Quindi, risospendere il pellet in PBS più FBS a una concentrazione di un millilitro di mezzo per cinque retine, se l'immunomarcatura deve essere eseguita immediatamente. In alternativa, incubare le cellule risospese nel mezzo per cellule neurali durante la notte a quattro gradi Celsius in posizione orizzontale. Per immunomarcare le cellule retiniche, centrifugare la sospensione di cellule retiniche e risospendere il pellet in 50 microlitri di PBS fresco più FBS in un tubo fax.Mettere da parte cinque volte 10 alla sesta cellule per il controllo negativo non marcato. Successivamente, bloccare qualsiasi legame non specifico ai recettori Fc in ogni provetta aggiungendo un microlitro di anticorpo anti-mouse CD16/32 per ogni 1×10⁶ cellule, e incubare per 10 minuti a temperatura ambiente. Al termine dell'incubazione di blocco, aggiungere alle cellule il cocktail di anticorpi di interesse mediante pipettamento delicato, quindi incubare per 30 minuti sul ghiaccio, protetto dalla luce.Quindi lavare le cellule due volte in un volume finale di un litro di PBS e FBS. Etichettare le cellule con un anticorpo secondario appropriato per altri 30 minuti sul ghiaccio, protetto dalla luce, seguito da due lavaggi in PBS più FBS come appena descritto. Risospendere i pellet in PBS e FBS fresco per il conteggio delle cellule.Per regolare la compensazione, aggiungere tre gocce di microsfere di polistirene in un tubo sterile per ogni floraforo e un microgrammo del rispettivo floraforo in ciascun tubo. Incubare le microsfere per 15 minuti a temperatura ambiente, protette dalla luce. Successivamente, lavare le microsfere con tre millilitri di PBS e FBS ed eliminare con attenzione il sopranatante.Risospendere i pellet di microsfere in 250 microlitri di PBS e FBS e caricare il tubo del campione non marcato sul citometro a flusso. Nel software del citometro a flusso, selezionare l'esperimento, la configurazione della compensazione e creare i controlli di compensazione. Aggiungere i controlli specifici per flora dall'elenco visualizzato e fare clic su OK. Verificare la luce diffusa in avanti e quella diffusa lateralmente e delimitare la popolazione iniziale.Quindi installare il tubo di controllo negativo sul citometro e fare clic su carica. Verificare che la popolazione di interesse o P1 sia visualizzata e selezionare la popolazione. Fare clic con il tasto destro sul gate P1 e selezionare calcola compensazione.Quindi fare clic su "registra dati". Al termine della registrazione, fare clic su "espelli" per rimuovere il tubo e caricare il tubo di controllo successivo per regolare i controlli di compensazione. Una volta registrati tutti i campioni di controllo, creare un grafico di dispersione forward rispetto a side scatter per il primo tubo sperimentale e selezionare la popolazione P1.Successivamente, aprire un grafico pseudocromatico di altezza dello scatter laterale rispetto alla larghezza dello scatter laterale ed effettuare il gating sulle singole cellule. Utilizzando le singole cellule, creare un grafico di altezza dello scatter anterogrado rispetto alla larghezza dello scatter anterogrado ed effettuare il gating per escludere i doppietti. Quindi generare un grafico pseudocromatico CD48 rispetto a CD90.2 ed effettuare il gating sulle cellule positive per CD90.2 e negative per CD48 per eliminare i monociti, seguito da un grafico pseudocromatico CD57 rispetto a CD15 per eliminare eventuali contaminanti di cellule amacrini.Ora definire le popolazioni da raccogliere per il campione nel foglio di impostazione del sorting e separare le cellule. Al termine del sorting, utilizzare un'aliquote di cellule pari a 2,5 volte 10 alla quarta per confermare la purezza della popolazione cellulare isolata. Dopo aver macerato le retinae nel filtro cellulare, possono essere visualizzate numerose cellule della retina interna, anche se le cellule gangliari retiniche hanno perso la loro morfologia caratteristica a causa dell'assotomia durante la procedura di isolamento cellulare.Il classico fenotipo di superficie positivo per il colorante uno e negativo per CD48 non è sufficiente per identificare e isolare le cellule gangliari retiniche murine, poiché queste cellule esprimono geni associati ad amacrine, cellule di Müller, bipolari, orizzontali, fotoricettori e cellule epiteliali del pigmento retinico. Le cellule ordinate esprimono inoltre marcatori intracellulari associati alle cellule gangliari retiniche, come la sinucleina gamma, BRN3A, TUJ1 e RBPMS, la cui localizzazione intracellulare è stata ulteriormente confermata mediante citometria a flusso con imaging. Alcune delle cellule ordinate iniziano persino a mostrare una morfologia tipica delle cellule gangliari retiniche dopo coltura cellulare in vitro.Inoltre, l'analisi di PCR quantitativa della popolazione cellulare altamente arricchita e ordinata rivela un aumento di molteplici volte nei geni che codificano per marcatori intracellulari specifici dei gangli retinici. Una volta padroneggiata, questa tecnica può essere completata in meno di sei ore se eseguita correttamente. Durante il tentativo di questa procedura, è importante ricordare di mantenere sterile la sospensione cellulare, di bloccare i recettori FC presenti nella sospensione cellulare, di evitare il legame non specifico degli anticorpi e di discutere i dettagli o la strategia relativa all'ordinamento cellulare con l'operatore del citofluorimetro.Al termine di questa procedura, possono essere eseguiti altri metodi come la QPCR per rispondere a ulteriori domande sul profilo di espressione genica. Non dimenticare che l'utilizzo di apparecchiature specializzate, come un cell sorter, richiede un operatore altamente specializzato. Dopo il suo sviluppo, questa tecnica ha aperto la strada ai ricercatori nel campo della visione per comprendere i meccanismi di sopravvivenza e morte delle cellule gangliari retiniche, contribuendo allo sviluppo di nuove terapie per la preservazione della vista.Dopo aver visto questo video, si dovrebbe avere una buona comprensione di come isolare una popolazione omogenea arricchita di cellule gangliari retiniche primarie di origine murina.

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Questo articolo fornisce una descrizione del modo di sezionare e registrare dalla preparazione della retina isolata nel topo. In particolare, viene descritto come registrare le risposte luce da una popolazione di cellule gangliari fluorescente e successivamente identificare e analizzare la sua morfologia.

Una preparazione isolati retina per registrare Risposta Luce da Geneticamente etichetta cellule gangliari della retina

Questo video mostra la procedura per isolare le cellule gangliari retiniche primarie murine (RGC) utilizzando la citometria a flusso. Questo metodo consente lo studio futuro delle RGC, con l'obiettivo di comprendere meglio il principale declino dell'acuità visiva che deriva dalla perdita di RGC funzionali nelle malattie neurodegenerative.

Isolamento delle cellule gangliari retiniche murine mediante smistamento cellulare attivato dalla fluorescenza

Fonte: Laboissonniere, et. al. RNA-seq a singola cellula di sottoinsiemi definiti di cellule gangliari retiniche. J. Vis. Exp. (2017).  Questo video mostra una tecnica di tracciamento fluorescente per identificare i sottotipi di cellule gangliari retiniche (RGC) in una retina di topo transgenico. Il processo prevede il fissaggio della retina isolata in una camera di registrazione, il mantenimento della vitalità cellulare con perfusione ossigenata e il targeting di RGC marcate in fluorescenza...

Identificazione dei sottotipi di cellule gangliari retiniche di topo mediante tracciatura fluorescente

fagocitosi microglia è fondamentale per il mantenimento della omeostasi tissutale e fagocitaria inadeguata è stato implicato nella patologia. Tuttavia, valutare la funzione microglia in vivo è tecnicamente impegnativo. Abbiamo sviluppato una tecnica semplice ma robusto per monitorare e quantificare il potenziale di fagocitosi microglia in un ambiente fisiologico preciso.

La valutazione della retina microglia fagocitaria Funzione<em&gt; In Vivo</em&gt; Usando un test citometria a flusso basato su

Qui presentiamo un approccio combinatorio per la classificazione di tipi di cellule neuronali prima dell'isolamento e per la successiva caratterizzazione di transcriptomi a singola cellula. Questo protocollo ottimizza la preparazione di campioni per il successo RNA Sequencing (RNA-Seq) e descrive una metodologia studiata appositamente per una migliore comprensione della diversità cellulare.

Sequenza RNA a singola cellula di sottogruppi definiti delle cellule del Ganglio retinico

Questo protocollo presenta due tecniche per isolare i compartimenti subcellulari dei fotorecettori murini a bastoncello per l'analisi delle proteine. Il primo metodo utilizza retina viva e carta da filtro di cellulosa per separare i segmenti esterni dell'asta, mentre il secondo impiega retina liofilizzata e nastro adesivo per rimuovere gli strati del segmento interno ed esterno dell'asta.

Due metodi di peeling per l'isolamento dei compartimenti cellulari fotorecettori nella retina del topo per l'analisi delle proteine

Questo protocollo descrive un metodo per l'isolamento di cellule endoteliali retiniche postnatali murine ottimizzate per la resa, la purezza e la vitalità delle cellule. Queste cellule sono adatte per approcci di sequenziamento di prossima generazione.

Isolamento di cellule endoteliali retiniche murine per il sequenziamento di nuova generazione

Questo manoscritto descrive un protocollo dettagliato per isolare le cellule di Müller gliali retiniche dagli occhi di topo. Il protocollo inizia con l'enucleazione e la dissezione degli occhi di topo, seguita dall'isolamento, dalla semina e dalla coltura delle cellule di Müller.

Isolamento delle cellule primarie di Müller gliali retiniche di topo

L'epitelio pigmentato retinico (RPE) agisce come una barriera cruciale tra la coroide e la retina, promuovendo la salute e la funzione dei tipi di cellule retiniche, come i fotorecettori. In questo articolo, descriviamo un protocollo semplice ed efficace per isolare e coltivare l'EPR murino adulto.

Un metodo semplificato per l'isolamento e la coltura di cellule epiteliali pigmentate retiniche da topi adulti

Questo protocollo descrive la procedura per isolare la retina di topo a montaggio intero ed eseguire l'immunocolorazione per marcare tutte le cellule gangliari retiniche (RGC). Il processo è seguito dall'imaging e dal conteggio automatico delle RGC utilizzando un software basato sull'intelligenza artificiale, fornendo un metodo semplice, veloce e accurato per quantificare le RGC nell'intera retina del topo.

Immunocolorazione a montaggio intero e conteggio automatico delle cellule gangliari retiniche di topo

Questo articolo presenta un protocollo dettagliato per l'isolamento delle cellule primarie di Müller retiniche da ratti neonatali di Sprague-Dawley (SD). La procedura comprende l'enucleazione dei bulbi oculari, la dissezione del tessuto retinico, l'estrazione e l'identificazione delle cellule e le considerazioni chiave per la successiva coltura cellulare.

Isolamento e coltura di cellule primarie di Müller retiniche da ratti Sprague-Dawley (SD)

Impara l'isolamento di cellule gangliari retiniche primarie murine mediante citometria a flusso. Questo protocollo standardizzato e riproducibile consente di ottenere popolazioni cellulari vive e altamente arricchite per studiare le malattie degenerative retiniche.

Isolamento delle cellule della ganglioma della retina primaria (RGC) mediante citometria a flusso

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