Quantificazione della densità di raggruppamento nelle ghiandole del mammella di ratto intere con il metodo di analisi di Sholl

L'obiettivo generale di questo metodo computerizzato è quello di quantificare oggettivamente la densità di ramificazione della ghiandola mammaria e il decadimento della ramificazione, due importanti indicatori di sviluppo nei roditori, applicando un'analisi di sholl modificata alle immagini dell'intero montaggio della ghiandola mammaria. Questo metodo può aiutare a rispondere a domande nel campo della biologia della ghiandola mammaria, ad esempio come le esposizioni chimiche possono alterare lo sviluppo della ghiandola mammaria. Il vantaggio principale di questa tecnica è che utilizza software open source per quantificare oggettivamente le caratteristiche fondamentali dello sviluppo della ghiandola mammaria.

Per questa procedura, avere immagini di montature intere che mostrino l'epitelio ghiandolare a un ingrandimento fisso. Per iniziare, aprire un'immagine in ImageJ. Quindi, seleziona lo strumento a mano libera.

Traccia intorno all'epitelio ghiandolare e libera l'area circostante. Quindi, traccia intorno al linfonodo e rimuovi questa parte dell'immagine con il comando di taglio. Se lo sfondo dell'immagine è nero, deve essere convertito in bianco.

Fai clic su Modifica, quindi su Opzioni, quindi su Colori. Nella finestra di dialogo, seleziona il bianco dal menu a discesa delle opzioni di sfondo. Sebbene lo sfondo possa rimanere nero, verrà trattato come bianco durante l'elaborazione dell'immagine.

Ora, separa i canali di colore in tre immagini in scala di grigi a otto bit. Quindi, seleziona il canale con il miglior contrasto, che in genere è il canale blu. Ora, sottrai lo sfondo dal canale di colore selezionato.

Quindi, procedi con la scelta dei parametri desiderati e l'anteprima delle modifiche. Controlla lo sfondo chiaro e l'anteprima nella finestra di dialogo, quindi regola il numero di pixel fino a ottenere il contrasto desiderato. Se è necessario un contrasto aggiuntivo, utilizzare l'opzione Maschera di contrasto.

Seleziona Anteprima nella finestra di dialogo e regola il raggio dei pixel e il peso della maschera fino a ottenere il contrasto desiderato. Dopo aver applicato il filtro maschera di contrasto, rimuovere il bordo creato dal filtro. Fare clic sul pulsante della doppia freccia rossa nella barra degli strumenti e selezionare Strumenti di disegno.

Quindi, scegli lo strumento Gomma. Regola il suo diametro facendo clic con il pulsante destro del mouse sul pulsante dello strumento gomma, quindi tieni premuto il pulsante sinistro del mouse per cancellare il bordo. Durante la cancellazione è consentito un solo livello di annullamento, quindi fai attenzione.

Dopo aver applicato uno dei filtri, rimuovere manualmente il rumore rimanente. Fare riferimento a una copia dell'immagine originale e rimuovere il rumore identificato facendo prima clic sul pulsante della doppia freccia rossa nella barra degli strumenti e selezionando gli strumenti di disegno. Quindi, scegli lo strumento gomma.

Regola il suo diametro facendo clic con il pulsante destro del mouse sul pulsante dello strumento gomma. Quindi, tieni premuto il pulsante sinistro del mouse per cancellare il rumore. Durante la cancellazione è consentito un solo livello di annullamento, quindi fai attenzione.

Quindi, regola la soglia dell'immagine. Spostare i cursori per regolare i valori di soglia minima e massima per migliorare l'immagine del premistoppa. Quindi, fai clic su Applica.

Rimuovi automaticamente il rumore aggiuntivo utilizzando uno dei due metodi seguenti. La prima opzione consiste nell'utilizzare il comando despeckle. La seconda opzione consiste nell'utilizzare il comando remove outliers.

Questo processo sostituisce un pixel con la mediana dell'ambiente circostante solo se il pixel si discosta dalla mediana di oltre un valore di soglia definito dall'utente. Ora, utilizzando l'immagine originale per il confronto, ricostruisci le porzioni dell'epitelio ghiandolare che sono state rimosse mediante soglia e rimozione del rumore. Quando ricostruisci l'immagine, assicurati di farlo con attenzione e su una base minima per mantenere l'integrità dell'immagine.

Selezionare lo strumento bomboletta spray dagli strumenti di disegno. Fare clic con il pulsante destro del mouse sul pulsante dello strumento bomboletta spray per regolare le dimensioni degli strumenti, quindi riempire con cura le sezioni mancanti della ghiandola utilizzando il pulsante sinistro del mouse. Quindi, crea un'immagine scheletrata della ghiandola per l'analisi della gola.

Innanzitutto, inserisci l'immagine in un formato binario. Quindi, scheletrare l'immagine. In questo modo i pixel vengono rimossi ripetutamente dai bordi dell'immagine binaria fino a quando non viene ridotta a una forma larga un singolo pixel.

Ora, dilatare l'immagine una volta per chiudere gli spazi vuoti creati dalla soglia e dalla scheletratura. Quindi, salva l'immagine come nuovo file utilizzando il comando salva con nome. Infine, controlla l'accuratezza dell'immagine dello scheletro rispetto all'originale sovrapponendo le due immagini.

Nella finestra di dialogo Aggiungi immagine, seleziona l'immagine dello scheletro e imposta la sua opacità al 30%Quindi, salva la sovrapposizione come nuova immagine per riferimento futuro. Per iniziare, apri un'immagine scheletro e converti l'immagine in un formato binario. Ora, definisci la scala dell'immagine.

Inserisci il numero di pixel per millimetro, quindi imposta sia la distanza nota che le proporzioni dei pixel su uno, quindi inserisci i millimetri per l'unità di lunghezza e attiva l'opzione globale per applicare la scala a tutte le immagini. Quindi, determinare il raggio finale per l'analisi della pala utilizzando lo strumento di disegno al tratto. Tracciare una linea dall'inizio del dotto primario al punto più distale dell'epitelio ghiandolare.

Premere quindi il tasto M e verrà riportata la distanza della linea. Ora, inserisci le impostazioni per l'analisi della pala. Innanzitutto, seleziona le opzioni nella sezione di definizione delle shell, imposta il raggio iniziale su 0,00 millimetri e imposta la dimensione del passo del raggio su 0,1 millimetri.

Impostare il numero di campioni su uno. La lunghezza della linea appena disegnata viene inserita automaticamente nel campo del raggio finale. Per le opzioni di campioni multipli per raggio, scegliere media per l'integrazione.

Per i descrittori e le opzioni di raccordo curvo, impostare il taglio del raggio di inclusione su uno. Scegliere Deduci dal raggio iniziale per il numero di rami primari e selezionare le opzioni di grado lineare e più adatta. Quindi, in profili senza normalizzazione, selezionare più informativo.

Ora, nella sezione dei metodi sholl, scegli l'area per il profilo normalizzato. Infine, nella sezione di output, seleziona crea maschera di intersezione per creare una mappa termica delle intersezioni. Ora, apri una finestra di anteprima dell'immagine con anelli e conferma l'area di analisi.

Se tutto sembra a posto, fare clic su OK per eseguire l'analisi. L'esecuzione dell'analisi creerà una finestra lineare del profilo della pala, una finestra semi-log del profilo della pala, una finestra dei risultati della pala, che contiene tutti i valori di output della pala e una finestra dei profili della pala con nome file, che fornisce il numero di intersezioni a ciascun raggio come determinato dal polinomio. Per misurare la MEA, lavorare dall'immagine dello scheletro della ghiandola in ImageJ.

Apri lo strumento poligono e disegna un poligono attorno al perimetro della ghiandola. Utilizzare i clic del mouse per aggiungere segmenti di linea. Quando l'intera area epiteliale è stata aggirata, fare doppio clic per chiudere il poligono.

Quindi, premere il tasto M per aprire una finestra dei risultati. Il valore nella colonna area corrisponde al MEA. Se l'epitelio ghiandolare è esteso oltre il linfonodo, sottrarre l'area linfonodale dal MEA quando si calcola la densità di ramificazione.

L'area linfonodale può essere misurata allo stesso modo del MEA. Utilizzando i metodi descritti, sono stati analizzati due gruppi di ratti di pari età. Gli animali del gruppo B sono stati trattati con una sostanza chimica nota per causare uno sviluppo precoce della ghiandola mammaria.

Tracciando il numero di intersezioni di diramazione lungo il raggio dalla ghiandola si illustra la variazione dei risultati. I risultati dell'analisi della sholl hanno rivelato una chiara differenza nel numero medio di intersezioni tra i gruppi. Tuttavia, i dati di intersezione devono essere normalizzati all'area della ghiandola mammaria per trarre conclusioni.

L'analisi della pala e le misurazioni dell'area epiteliale della ghiandola mammaria forniscono due parametri fisiologici utili per effettuare analisi comparative. Chiaramente, la dimensione delle ghiandole era molto maggiore nel gruppo di trattamento. L'analisi sholl restituisce il valore per la somma N, che viene utilizzato per calcolare la densità di ramificazione e il valore per k.

Nel gruppo di trattamento, la maggiore densità media di ramificazione e la media più bassa, k, che riflette un tasso inferiore di decadimento delle ramificazioni, indicano che gli animali trattati avevano ghiandole più sviluppate rispetto agli animali non trattati. Durante il tentativo di questa procedura, è importante ricordare che la rimozione del rumore è il passaggio più cruciale. La rimozione di una quantità eccessiva o insufficiente può compromettere l'integrità della ghiandola e distorcere i risultati.

Quando si utilizza questo metodo, è importante iniziare con un tumulo mammario intero ristagna. Non è possibile ottenere un'immagine scheletrata accurata se sono presenti imperfezioni, come strappi o pieghe. La creazione di un'immagine scheletrata accurata richiede pazienza e pratica.

Una volta padroneggiata, questa tecnica può essere eseguita in 15-20 minuti per ghiandola analizzata se eseguita correttamente.