Automatizzato di protocolli per cristallizzazione macromolecolare al MRC Laboratorio di biologia molecolare

L'obiettivo generale di questa procedura è quello di produrre cristalli di alta qualità dalle condizioni iniziali di screening della cristallizzazione. I cristalli possono essere utilizzati per studiare le strutture di proteine, DNA, RNA e i loro complessi. Qualcosa nelle strutture macromolecolari è diventato sempre più impegnativo.

Inoltre, fornire un'ampia varietà di condizioni iniziali aumenta la resa di cristalli utili, riducendo al contempo la necessità di ottimizzare campioni e cristalli. I due sistemi completamente automatizzati, l'LMB, facilitano la preparazione di un massimo di 1.920 esperimenti di diffusione del vapore in goccioline di nanolitri. Per brevità, si presume che gli utenti abbiano già familiarità con le funzioni di base e la manutenzione del dispenser di nanolitri, della stampante a getto d'inchiostro e del sigillante per lastre adesive.

Prima di eseguire la procedura, assicurarsi che i robot del sistema siano inizializzati e che il loro software di controllo sia aperto. Accendere il refrigeratore del portatubi di raffreddamento, circa 30 minuti prima dell'avvio del programma principale. Posizionare una piastra di prova sul supporto SBS motorizzato della sigillatrice per piastre.

Azionare la sigillatrice per piastre e verificare che la pellicola sia applicata correttamente. Ripetere questo test altre due volte per verificare che la sigillatrice per piastre sia pronta. Quindi aggiungere 20 litri di acqua deionizzata al contenitore principale del dispositivo di movimentazione dei liquidi.

Scollegare gli inserti di accoppiamento dal contenitore più piccolo della soluzione di risciacquo all'etanolo al 20% e collegare gli inserti al contenitore principale. Immettere il nome utente appropriato sul touchscreen della stampante a getto d'inchiostro. Quindi apri e chiudi lo sportello del carosello per attivare la rotazione del carosello.

Apri la porta quando si presenta la prima pila. Caricare completamente la prima pila con 22 piastre di cristallizzazione, ciascuna con la colonna una rivolta verso l'esterno. Carica completamente le due pile successive allo stesso modo.

Caricare le restanti sei piastre nelle posizioni più alte della quarta pila, quindi chiudere lo sportello del carosello. Verificare che il display del refrigeratore indichi 14 gradi Celsius. Capovolgere delicatamente e ripetutamente i kit di screening selezionati per un minuto.

Quindi, aprire il pannello frontale del dispositivo di trattamento dei liquidi. Aprire le provette e posizionarle nel contenitore di raffreddamento nel layout standard a 96 pozzetti. Dopo aver posizionato ciascuna provetta nel supporto, posizionare il coperchio sul vassoio con lo stesso layout a 96 pozzetti.

Quando si utilizza il Sistema 1, i cavi di etichettatura vengono posizionati sul vassoio nel layout a 96 pozzetti per consentire il controllo incrociato che le provette siano disposte correttamente. Controllare le posizioni dei tubi e assicurarsi che tutti i tubi siano in piano e sistemati nel supporto. Quindi chiudere il pannello frontale.

Nella finestra di avvio del software del gestore di liquidi, selezionare Esegui manutenzione e aprire il programma di lavaggio. Eseguire il programma per eliminare il 20% di etanolo dal sistema e per lavare l'esterno delle punte di erogazione del liquido. Al termine dello scaricamento, fare clic su Annulla per tornare all'avvio.

Seleziona Esegui un processo esistente e fai clic su Avvia selezione. Aprire il programma di erogazione del kit MRC. Compila 18" per le istanze nella schermata di configurazione ed esegui il programma, monitora il sistema mentre le prime quattro piastre vengono etichettate, riempite e sigillate.

Non lasciare il sistema incustodito fino al completamento della preparazione delle prime quattro piastre. Una volta che tutte le 72 piastre sono state preparate e riposizionate nella giostra, cambiare gli inserti di accoppiamento dal contenitore dell'acqua deionizzata al contenitore dell'etanolo al 20%. Eseguire il programma di svuotamento all'avvio utilizzando lo stesso processo di prima.

Spegnere il refrigeratore ed eliminare le provette vuote del kit di screening. Rimuovere con cautela i 72 piatti preparati dalla giostra. Eliminare le piastre riempite in modo errato o mal sigillate.

Conservare le piastre pronte all'uso a 10 gradi Celsius. Per prima cosa assicurati che i robot del sistema siano accesi, che l'erogatore di nanolitri sia inizializzato con il software aperto e che il gestore dei metodi del gestore del liquido sia aperto. Accendere il supporto di raffreddamento del microtubo circa 15 minuti prima dell'avvio del programma principale.

Posizionare una piastra di prova sul supporto SBS motorizzato della sigillatrice per piastre. Azionare la sigillatrice per piastre e verificare che la piastra sia sigillata correttamente. Testare tre volte la sigillante per piastre.

Quindi eseguire l'erogatore di nanolitri per inserire 100 goccioline di nanolitri di soluzione di prova in una piastra di prova. Qui è mostrata una micrografia a luce di una goccia da 100 nanolitri, prodotta dal dosatore di nanolitri, con la soluzione di prova a base di colorante rosso. Chiudere il software dell'erogatore di nanolitri e rimuovere il blocco portastrisce dal piatto.

Successivamente, inserire in un portapiastre progettato su misura, una piastra di cristallizzazione preriempita a 96 pozzetti con la più alta quantità relativa di reagenti volatili nelle sue condizioni. Rimuovere la pellicola adesiva dalla piastra. Aprire il pannello frontale del gestore di liquidi e posizionare la piastra non sigillata sul ponte sul retro del primo supporto scorrevole.

Coprire la piastra con un coperchio in alluminio SBS. Posizionare il coperchio verso l'angolo posteriore sinistro del supporto applicando una leggera pressione sull'angolo opposto del coperchio. Quando si utilizza il Sistema 2, è necessario elaborare prima i kit di screening con quantità significative di reagenti volatili.

In questo modo si evita la formazione di condensa sui cavi SBS, che potrebbe influire sulla gestione automatizzata dei cavi o sulla sigillatura delle piastre. Aprire, caricare nei supporti scorrevoli e coprire le restanti 19 piastre allo stesso modo, lavorando dalle condizioni più volatili a quelle meno volatili. Una volta che il portante di raffreddamento del microtubo è a 4 gradi Celsius, come indicato da una luce verde, rimuovere il coperchio.

Tagliare il coperchio di una microprovetta contenente almeno 440 microlitri di un campione di proteine. Assicurarsi che il campione non abbia schiuma sopra il menisco, poiché ciò interferirebbe con il sistema di rilevamento del liquido. Posizionare il tubo nella posizione 1 del supporto di raffreddamento del microtubo.

Posizionare una piastra PCR sul ponte di erogazione dei liquidi davanti al supporto dell'adattatore mobile della piastra. Quindi chiudere il pannello frontale. Nell'interfaccia di gestione del metodo del gestore di liquidi, selezionare Imposta piastre.

Monitorare l'inizializzazione di entrambi i sistemi e inserire i parametri di corsa, tra cui il tipo di lastra e il numero di gocce per ciascuna condizione, la dimensione della goccia, la posizione della prima lastra da elaborare e il numero di lastre. Fai clic su No quando ti viene chiesto se desideri assistenza per caricare il mazzo. Dopo aver verificato che non ci siano rack di puntali vuoti, fai clic su OK. Dopo aver verificato che ci siano abbastanza suggerimenti per la corsa, fai clic su OK. Se necessario, aggiornare il sistema di gestione delle mance e fare clic su OK. Assicurarsi che il piano dell'erogatore di nanolitri sia libero dal blocco portastrisce e che il supporto si trovi sul retro delle pile di puntali da 50 microlitri, siano libere dai coperchi SBS in alluminio.

Ricontrolla che tutti gli altri componenti richiesti siano pronti, quindi avvia il processo. Monitorare il sistema mentre l'erogatore di nanolitri posiziona le gocce nella prima piastra e il sigillante per piastre sigilla successivamente la piastra. Non lasciare l'impianto incustodito fino al completamento della preparazione della prima piastra.

Una volta che tutte le 20 piastre sono state preparate con goccioline di cristallizzazione e sono tornate automaticamente ai supporti scorrevoli, aprire il pannello frontale e rimuovere delicatamente le piastre. Verificare che le piastre siano correttamente sigillate prima di riporle per la cristallizzazione. Pulire i coperchi SBS con la soluzione di etanolo al 20% prima di impilarli sul lato sinistro del dispositivo di movimentazione dei liquidi per la conservazione.

Eliminare la piastra PCR e la microprovetta. Spegnere il contenitore di raffreddamento del microtubo e rimuovere la condensa. Lascia un tovagliolo di carta sopra la superficie del refrigeratore per assorbire ulteriore condensa.

Quindi riposizionare il coperchio del supporto e chiudere il pannello frontale. OmpF e MreB sono stati inizialmente sottoposti a screening utilizzando questi protocolli completamente automatizzati. Cristalli di OmpF di qualità sufficiente per la diffrazione dei raggi X sono stati trovati nel pozzetto A4 della piastra LMB 7.

Cristalli di qualità di diffrazione di MreB sono stati trovati nel pozzetto D12 della piastra LMB 20. Conservare le piastre pre-carburante a 10 gradi Celsius è un compromesso per evitare il congelamento e lo stoccaggio a 4 gradi, che può causare il deterioramento delle condizioni di cristallizzazione e problemi legati alla condensa. Se conservate in questo modo, le piastre possono essere utilizzate entro quattro o cinque mesi.

Con il Sistema 1 vengono prodotte tra le 4 e le 8.000 piastre LMB all'anno che vengono successivamente utilizzate per lo screening iniziale. I protocolli dovrebbero essere ottimizzati in modo diverso quando il turnover previsto è molto più basso. Il nostro intero set di piastre pre-carburante viene normalmente utilizzato come un grande schermo iniziale per un nuovo campione.

Tuttavia, è possibile selezionare un numero inferiore di lastre in base a requisiti di campionamento molto specifici. Dopo aver preparato le goccioline, le piastre vengono conservate su scaffali a basse vibrazioni con la temperatura strettamente controllata a 4 o 18 gradi Celsius. Gli esperimenti sono valutati con microscopi a spirale con sorgente luminosa.

Dopo aver studiato attentamente la natura dei cristalli, i tratti e le somiglianze tra le condizioni possono essere analizzati con strumenti basati sul web come i database LMB o C6 Screen. Potrebbe essere ancora necessaria una successiva ottimizzazione delle condizioni di cristallizzazione. Ulteriori protocolli automatizzati, con i metodi a 4 angoli e lo screening additivo sono descritti nel nostro manoscritto.