Name: Automatizzato di protocolli per cristallizzazione macromolecolare al MRC Laboratorio di biologia molecolare (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-01-24T13:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 20 s
Description: Scopri i protocolli automatizzati per la cristallizzazione macromolecolare al MRC Laboratory. Questo metodo utilizza sistemi robotizzati per preparare fino a 1.920 esperimenti di diffusione del vapore in nanolitri, ottimizzando la produzione di cristalli di alta qualità per studi strutturali di proteine, DNA e RNA.

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L'impianto di cristallizzazione di MRC-LMB è gentilmente sostenuta dal Consiglio di ricerca medica (UK). Si ringraziano i membri del LMB per il loro sostegno: Olga Perisic (PNAC), Tony Warne, Fusinita Van den Ent e Pat Edwards (studi strutturali), Steve Scotcher e gli altri membri dell'officina meccanica, Neil Grant e Jo Westmoreland (visivi), Paul Hart e Tom Pratt (IT). Vorremmo anche ringraziare Steve Elliot (Tecan, UK), Mitchell Stuart e Heather Ringrose (robotica di Hamilton, Regno Unito), Paul Thaw, Robert Lewis e Joby Jenkins (TTP Labtech, UK), Paul Reardon (Swissci AG, Svizzera), George Stephens e Donald Ogg (Alphabiotech, UK), Neil Williams (Markem-Imaje, UK) e Graham Harris (The Cleveland Agency) per assistenza tecnica.

1. i due sistemi (screening iniziale) completamente automatizzati
<ol><li>
Sistema 1: preparazione di 72 tavole di 96 pozzetti cristallizzazione riempito con screening Kit (piastre di LMB)
	<ol>
<li>Prima di eseguire la procedura, assicurarsi che il robot del sistema vengono inizializzati e il loro software di controllo è aperto. Accendere il refrigeratore del vettore tubo di raffreddamento circa 30 minuti prima che verrà avviato il programma principale.</li>
		<li>Sistemare una piastra di prova sul supporto motorizzato SBS del copripiastra. Eseguire il copripiastra e controllare che la pellicola viene applicata correttamente. Ripetere questa prova altre due volte per verificare che il copripiastra è pronto.</li>
		<li>Quindi, aggiungere 20 L di acqua deionizzata al contenitore principale del gestore liquido. Scollegare gli inserti di accoppiamento dal contenitore piccolo (etanolo al 20% soluzione di risciacquo) e collegare gli inserti al contenitore principale.</li>
		<li>Digitare il nome appropriato (tabella 1) sul touchscreen della stampante a getto d'inchiostro. Quindi, aprire e chiudere lo sportello di carosello per innescare la rotazione della giostra. Aprire la porta quando si presenta la prima pila.</li>
		<li>Caricare completamente la prima pila con 22 piastre di cristallizzazione, ciascuno con esposto a colonna 1 fuori. Caricare completamente le due pile nello stesso modo.</li>
		<li>Caricare le rimanenti 6 piastre nelle posizioni più alte dello stack di quarto. Quindi, chiudere lo sportello di carosello.</li>
		<li>Verificare che il display del refrigeratore indica 14 ° C. Delicatamente e ripetutamente invertono i kit di screening selezionati per 1 minuto. Quindi, aprire il pannello frontale del gestore liquido.</li>
		<li>Aprire le provette e metterli nel supporto di raffreddamento secondo il layout standard di 96 pozzetti (A1, A2, ecc.). Piazzando ogni tubo nel supporto, posizionare il coperchio su un vassoio nello stesso layout di 96 pozzetti.</li>
		<li>Controllo incrociato il tubo posizioni e garantire che tutti i tubi sono di livello e si stabilirono nel vettore. Quindi, chiudere il pannello anteriore.</li>
		<li>Nella finestra del software gestore liquido 'Avvio', selezionare 'Esegui manutenzione' e aprire il programma di lavaggio. Eseguire il programma per svuotare l'etanolo al 20% dal sistema e per lavare i lati esterni delle punte di erogazione del liquido.</li>
		<li>Quando lo svuotamento è completo, fare clic su 'Annulla' per tornare a 'Avvio'. Selezionare 'Esegui un processo esistente' e fare clic su 'Avvia la selezione'. Aprire il programma 'MRC kit dispensing'. Compilare '18' per 'Istanze' nella configurazione dello schermo ed eseguire il programma.</li>
		<li>Monitorare il sistema in quanto le prime quattro piastre sono etichettate, riempite e sigillate.</li>
		<li>Una volta che tutti i 72 tavole sono stati preparati e inseriti nuovamente nella giostra, passare gli inserti di accoppiamento dal contenitore principale per il piccolo contenitore. Eseguire il programma 'Start up flush' (Vedi punto 1.1.10).</li>
		<li>Spegnere il refrigeratore e scartare il vuoto tubi kit di screening. Rimuovere con cautela il 72 tavole preparate dalla giostra. Scartare le piastre riempito in modo errato o mal sigillato. Conservare le piastre di ready-to-use a 10 ° C.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Sistema 2: impostazione le goccioline di cristallizzazione (proteina nL 100 + 100 nL condition) da un singolo campione in 20 piastre di LMB
	<ol>
<li>In primo luogo, assicurarsi che robot del sistema sono su, il dispenser nanolitro viene inizializzato con il suo software open, e gestione del metodo del gestore dei liquidi è aperto. Accendere il vettore conetti di raffreddamento circa 15 minuti prima che verrà avviato il programma principale.</li>
		<li>Sistemare una piastra di prova sul supporto motorizzato SBS del copripiastra. Eseguire il copripiastra e verificare che la piastra è opportunamente sigillata. Testare il copripiastra tre volte.</li>
		<li>Quindi, eseguire il dispenser nanolitro per impostare 100-nL gocce della soluzione di test in una piastra di prova. Controllare al microscopio che le goccioline siano impostate correttamente. Chiudere il software di erogatore nanolitro e rimuovere il blocco striscia-porta dal ponte.</li>
		<li>Quindi inserire il porta targa personalizzata (vedere Risultati rappresentante: cristallizzazione dispositivi sviluppati presso il LMB) la piastra LMB con il più alta quantità relativa di reagenti volatili nelle sue condizioni (tabella 1). Rimuovere la pellicola adesiva dalla piastra.</li>
		<li>Aprire il pannello frontale di liquido gestore e posizionare la piastra non bloccata sul ponte, sul retro il primo elemento portante scorrevole (vettori di scorrimento può essere tirato fuori per facilità di accesso).</li>
		<li>Coprire la piastra con un coperchio di alluminio SBS. Saldare il coperchio verso l'angolo posteriore sinistro del vettore applicando leggera pressione verso l'angolo opposto del coperchio.</li>
		<li>Rompere il sigillo, caricare i supporti scorrevoli e coprire il restante 19 tavole nello stesso modo, lavorando da più di meno volatile condizioni. Una volta che il vettore conetti di raffreddamento è a 4 ° C, come indicato da una luce verde, togliendo la copertura.</li>
		<li>Tagliare il coperchio di una microprovetta contenente (almeno) 440 µ l di campione della proteina (tabella 2). Assicurarsi che il campione non abbia schiuma sopra il menisco, come ciò interferirà con il sistema di rilevamento di liquidi. Inserire il tubo nella posizione 1 del vettore conetti di raffreddamento.</li>
		<li>Posizionare un piatto PCR sul ponte liquido gestore davanti il vettore di movimento piastra adattatore. Quindi, chiudere il pannello anteriore.</li>
		<li>Dopo aver caricato il deck, assicurarsi che il deck di erogatore nanolitro è chiaro del blocco porta-striscia e che i vettori sul retro gli stack di punta 50-µ l sono chiari dei coperchi in alluminio SBS.</li>
		<li>Nell'interfaccia liquido gestore 'Metodo Management', selezionare 'Setup piastre'. L'inizializzazione di entrambi i sistemi di controllo e immettere i parametri di esecuzione. Seguire le linee guida dell'interfaccia di gestione del metodo (prompt, figure e un sistema di suggerimento-gestione aiutare con preparazione).</li>
		<li>Controllare che tutti i necessari componenti sono pronti e quindi avviare il processo.</li>
		<li>Monitorare il sistema come il dispenser nanolitro imposta le gocce nel primo piatto e il copripiastra successivamente sigilla la piastra.</li>
		<li>Una volta che tutti i 20 piastre sono state preparate con le goccioline di cristallizzazione e automaticamente restituite ai vettori scorrevoli, aprire il pannello anteriore e rimuovere delicatamente le piastre. Controllare che le piastre siano correttamente sigillate prima di riporli per cristallizzazione.</li>
		<li>Pulire i coperchi SBS con una soluzione di etanolo al 20% prima di metterli sul lato sinistro del gestore liquido per l'archiviazione. Scartare la piastra PCR e la microprovetta.</li>
		<li>Spegnere il vettore conetti-raffreddamento e spazzare via l'acqua di condensa. Lasciare un tovagliolo di carta sopra la superficie del radiatore di assorbire ulteriore condensazione. Ricollocare il coperchio del vettore, quindi chiudere il pannello anteriore.</li>
	</ol>
</li>
</ol>2. ottimizzazione delle condizioni
<ol><li>
Basato su siringa liquido gestore: producendo due gradienti lineari delle concentrazioni nei serbatoi di una piastra di cristallizzazione (il metodo 4-angolo).
	<ol>
<li>In primo luogo, assicurarsi che il gestore di liquido è su e inizializzato con il suo software aperto.</li>
		<li>La 'pendenza' scheda: aprire il programma richiesto, selezionare il tipo di piastra di cristallizzazione e il volume finale nei serbatoi (tabella 3). L'impostazione avanzata per 'max colpo vol' dovrebbe essere abbassata da 6.000 a 3.000 quando si utilizzano soluzioni che contengono [isopropanolo] > 10% v/v e [MPD] > 20% v / v.
</li>
		<li>Preparare le siringhe. Mettere un pistone in ogni siringa (estremità appuntite verso il basso) e inserire il retro delle siringhe nelle scanalature designate sotto la testa del robot. Una siringa di torsione in senso orario per bloccarlo in posizione (il programma verrà avviato solo con tutte le siringhe necessarie collegate correttamente).</li>
		<li>Preparare le depressioni. Rimuovere il telaio in acciaio inox e inserire le depressioni. 4 posizioni a sinistra corrispondono ai 4 angoli A, B, C, D. passare alla scheda di SET UP che Visualizza i volumi delle soluzioni richieste in ogni siringa (in tabella 3, 0,5 mL di volume morto è stato aggiunto per i volumi visualizzati). Versare le soluzioni angolari nel loro rispettivi depressioni e posizionare il telaio torna sul ponte (la cornice tiene in posizione con 2 piccoli magneti che si trova nella parte anteriore del ponte). Un modo alternativo di procedere con questo passaggio è quello di versare le soluzioni in depressioni, quando già si trovano sul ponte.
</li>
		<li>Posizionare la piastra di cristallizzazione del supporto motorizzato di SBS.</li>
		<li>Fare clic su 'Aspirare' e attendere che questo passaggio essere completata (quando pistoni fermato il loro modo).</li>
		<li>Passare alla scheda 'Esegui' ed eseguire il programma.</li>
		<li>A completamento del programma, torna alla scheda di SET UP e fare clic su 'Rimuovi': il sistema elimina l'inceppo le siringhe da avanzi soluzioni e quindi solleva completamente i pistoni. 'Eliminare' può essere richiesto invece di 'Rimuovi'; questo lascerà i pistoni nella posizione inferiore, pronta aspirare più soluzioni con le siringhe stesse.
</li>
		<li>Togliere le siringhe girandole in senso antiorario.</li>
		<li>Scartare le siringhe e le depressioni nell'apposito contenitore (o sciacquare con acqua deionizzata e poi soluzione al 20% v/v etanolo per il riutilizzo).</li>
		<li>Sigillare la piastra e posizionatelo sopra il mixer di micropiastre per 3 min a 1.000 giri/min, o 10 min quando soluzioni altamente viscose sono essere mescolati. Il piatto è pronto per l'impostazione di goccioline di cristallizzazione sul dispenser nanolitro.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Additivo di screening protocollo n. 1 (impostazione le goccioline di cristallizzazione in una piastra 96 pozzetti cristallizzazione pre-riempita con additivo schermo)
	<ol>
<li>In primo luogo, preparare la condizione con concentrazioni iniziali dei reagenti sono aumentate del 10% (min. vol. 15 mL durante il trasferimento la condizione da un contenitore sullo schermo con il gestore di liquido additivo).</li>
		<li>Assicurarsi che il gestore di liquido è pronto per funzionare. Aprire il programma 'Aggiungi schermo agli additivi' per una singola piastra (inserire volume nei serbatoi: 'µ l 72'). Di richiami, figure e una suggerimento-gestione sistema (punte di 12 x 1.000 µ l richiesti) guida con assicurandosi che il robot è pronto a funzionare secondo le selezioni.
</li>
		<li>Recuperare la schermata additiva dall'incubatrice-20 ° C e rimuovere immediatamente proprio sigillo di alluminio (uso il portatarga), quindi posizionare la piastra sul ponte del gestore liquido. Il programma opera secondo un layout verticale (la piastra è posta con l'A1-angolo situato nella parte anteriore sinistra del vettore). Inoltre posto anche il contenitore riempito con la condizione. Eseguire il programma.</li>
		<li>Una volta che i serbatoi della piastra sono stati riempiti, posizionatelo sopra l'agitatore per micropiastre ed eseguire il programma. Risciacquare il contenitore della condizione con deionizzata acqua e 20% di etanolo per il riutilizzo.</li>
		<li>
Impostare le goccioline sul dispenser nanolitro. In primo luogo, dissigillare la piastra di cristallizzazione (uso il portatarga). Quindi, posto che la piastra e la proteina di 8 pozzetti striscia nella prima posizione del blocco porta-striscia. La scheda 'Setup' sul software di controllo vengono visualizzate le posizioni reali di ciascun componente sul ponte. Caricare ogni bene della striscia con il campione della proteina secondo la dimensione della goccia richiesta (tabella 4). Eseguire il programma per preparare le goccioline.
</li>
		<li>A completamento del programma, rimuovere la piastra dal ponte e sigillarlo immediatamente (utilizzare il foglio sigillante, nastro adesivo largo 3 pollici). Eliminare la striscia nell'apposito contenitore.</li>
		<li>Valutare la dimensione, forma e centratura delle goccioline sotto il microscopio prima dello stoccaggio.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Additivo di screening protocollo 2 (impostazione le goccioline di cristallizzazione in una piastra 96 pozzetti cristallizzazione con uno schermo di additivo riutilizzabile)
	<ol>
<li>In primo luogo, preparare lo schermo additivo: lasciare la piastra di coltura congelati 96 pozzetti cella corrispondente a scongelare a temperatura ambiente per 40 min. Poi, centrifugare la schermata additiva a 1.000 x g per 2 min.</li>
		<li>Preparare la condizione (min. vol. 15 mL durante il trasferimento la condizione da un contenitore sullo schermo con il gestore di liquido additivo).</li>
		<li>Riempire i serbatoi di una piastra a 96 pozzetti cristallizzazione con la condizione. Il gestore di liquido, procedere nello stesso modo come protocollo n. 1, punto 2.2.2, ma immettere '80 µ l' per il volume in serbatoi.</li>
		<li>Impostare le goccioline sul dispenser nanolitro con 3 componenti sul ponte (la piastra che contiene lo schermo additivo, insieme con la piastra di cristallizzazione e la striscia di 8 pozzetti proteina nella prima posizione del blocco porta-striscia, tabella 4).</li>
		<li>Sigillare la piastra di coltura cellulare contenente lo schermo con un foglio di alluminio e inserirlo nell'incubatrice-20 ° C.</li>
		<li>Valutare la dimensione, forma e centratura delle goccioline sotto il microscopio prima dello stoccaggio.</li>
	</ol>
</li>
</ol>

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</ol>

Vi precisiamo un conflitto d'interessi commercio poiché LifeArc commercializza i seguenti elementi: il 96 e 48-ben MRC piastre, il sigillo di goccia appeso MRC, le schermate di cristallizzazione di MORPHEUS, Pi, ANGSTROM e LMB.

1 - preparazione e uso di schermate iniziali archiviati in piastre
Kit di screening devono essere miscelati prima erogazione in piastre perché luce precipitazione o fase di separazione si verifica in alcuni tubi durante la conservazione. Quando uno schermo è composto di due kit (2 x 48 tubi), il primo tubo del kit secondo è collocato posizione E1 del vettore raffreddamento. Quando uno schermo è composto di 4 Kit (4 x 24 tubi), il primo tubo del kit secondo è collocato in posizione C1, il primo tubo del terzo kit è collocato in posizione E1 e il tubo primo del quarto kit è collocato in posizione G1. Inserire le provette nel loro elemento portante di raffreddamento, coperchi sono collocati su un vassoio seguendo il layout orizzontale 96 pozzetti standard. Poiché i numeri ben sono indicati sopra i coperchi da parte dei produttori, in questo modo incrociato se tutti i tubi sono stati inseriti nel giusto ordine. Questo aiuta anche a sostituire i coperchi corretti sui tubi durante la compilazione di un ridotto numero di piastre.
Memorizziamo le piastre pre-riempite a 10 ° C, un compromesso per evitare il congelamento e la conservazione a 4 ° C che possono provocare il deterioramento delle condizioni e problemi con il sigillamento. Piastre sono conservati per fino a parecchi mesi normalmente senza evidente formazione di condensa sulla faccia interna della guarnizione. Questo è meno vero per piastre LMB05, LMB06, LMB09 e LMB10 come questi contengono condizioni con concentrazioni relativamente alte di reagenti volatili (tabella 1). Piccola quantità di condensa sul lato interno della guarnizione riduce l'efficienza di tenuta e può causare la contaminazione incrociata tra pozzi mentre sigilli le piastre. Per contribuire a prevenire la formazione di condensa durante il raffreddamento iniziale, piastre possono essere trasferiti in primo luogo dalla giostra in un pic-nic isolati più fresco che viene memorizzata nella cella frigorifera a 4 ° C durante la notte. Il raffreddamento molto lento minimizza lo sviluppo di gradienti di temperatura all'interno dei pozzetti sigillati e quindi riduce la condensa complessiva15. Inoltre, una volta che le piastre vengono memorizzate nell'incubatrice 10 ° C, un coperchio in polistirolo di SBS personalizzato in-House è disposto sul piatto nella parte superiore di ogni stack (non mostrato).
L'intero set dei nostri piatti pre-riempite può essere utilizzato come un grande schermo iniziale contro un campione della proteina del romanzo, solubile in acqua. In alternativa, è possibile selezionare un minor numero di piastre per abbinare i requisiti specifici. Ad esempio, LMB15 e LMB19 sono schermi formulati specificamente per membrana proteina campioni26,27, o LMB20 è uno schermo formulato con pesanti-atomi per facilitare la graduale sperimentali di diffrazione dati28 (veda inoltre : <a href="https://www.youtube.com/watch?v=Gpb4SypWnQY&t=11s">Formulazione delle schermate di cristallizzazione della proteina di MORPHEUS</a>).
2. impostazione le goccioline di cristallizzazione
Quando si utilizza il sistema 2, kit con una notevole quantità di reagenti volatili di screening dovrebbe essere elaborato per primo. Questo evita la condensa la gomma dei coperchi SBS, che potrebbero influenzare la gestione coperchio e guarnizione piastra. Un coperchio SBS ha un po' di spazio quando sulla cima di una piastra, che è per questo che hanno bisogno di essere allineati inizialmente (Vedi protocollo, punto 1.2.6). I volumi morti di proteine nei pozzetti della piastra PCR sono relativamente generoso (0,8 µ l, Vedi legenda della tabella 2). Si noti che altrettanto generosi volumi morti sono impiegati quando si utilizza il dispenser nanolitro individualmente con proteina a strisce da 8 pozzetti (tabella 4). Più piccoli volumi morti potrebbe funzionare, tuttavia alcuni campioni aderiscono alle punte, calibrazione di un robot può diventare leggermente imprecise, la camera potrebbe essere più calda rispetto al solito, ecc. Tutti portare a perdite di esempio rientrano i generosi volumi morti al fine di consolidare l'approccio.
Recenti sviluppi abilitato ulteriore miniaturizzazione degli esperimenti e quindi il volume di campione richiesto per condizioni di cristallizzazione di screening può essere ridotto integrando la corrispondente tecnologia29,la30 . Tuttavia, alcuni aspetti di ulteriore miniaturizzazione bisogno un'attenta considerazione, come ad esempio l'evaporazione delle goccioline31 e la manipolazione di microcristalli32.
Infine, centrifugazione della piastra (2.000 giri/min, 1 min) potrebbe essere integrata come passaggio finale ordinaria quando si impostano le goccioline di cristallizzazione (a sferico superiore-wells). Una più consistente dimensione e forma di goccioline risultanti da centrifugazione può ridurre la riproducibilità problemi33,34. Sicuramente, centrati gocce faciliterà la successiva valutazione degli esperimenti utilizzando un microscopio, come la lunghezza focale necessaria sarà simile in tutta l'intera piastra.
3. i vantaggi del metodo 4-angolo
Il vantaggio più significativo del metodo 4-angolo è la sua semplicità, che riduce al minimo gli errori e facilita protocolli automatici semplici. Ad esempio, le soluzioni di 4 angolo inserirà sempre sul ponte di un gestore di liquido seguendo lo stesso layout. Inoltre, tutti i programmi si basano su rapporti fissi tra le soluzioni (Figura 3). Preparazione manuale delle soluzioni 4 angolo è preferito al trattamento automatizzato di soluzioni ad alte concentrazioni che possono essere altamente viscose. Relativamente veloce ed accurata aspirazione/erogazione è poi possibile sulla maggior parte dei tipi di gestori liquidi con requisiti minimi per l'ottimizzazione delle classi liquide. Tuttavia, alcune soluzioni di angolo possono essere ancora troppo viscosi per un robot operano con un sistema di liquido per operare in modo efficiente. Questo è il motivo per cui abbiamo optato per un gestore di liquido di funzionamento con spostamento positivo (Figura 3B).
Oltre i 2 gradienti lineari delle concentrazioni, una terza componente (cioè, un set di buffer/additivi) possa essere testata ad una concentrazione costante in modo conveniente. Per questo, un volume relativamente grande di un insieme di soluzioni ad angolo ad una concentrazione superiore opportunamente, escludendo il componente per essere variata, è preparato prima. Quindi, soluzioni di riserva tra cui questo componente viene aggiunto per regolare le concentrazioni finali. Ad esempio, 50 mL di un insieme di 4 soluzioni angolari vengono preparati al 10% più alte concentrazioni che inizialmente. Questo set di base è quindi divisa in 5 sottoinsiemi più piccoli di 4. Infine, il 10% in volume di soluzioni tampone pH diversi viene aggiunto a ogni sottoinsieme.
4. formati e tipi di schermi additivi
Gli schermi sono normalmente memorizzati a-20 ° C (Figura 4), poiché non sono usati regolarmente e contengono composti volatili/instabile. L'uso di un schermo congelato additivo memorizzato in un pozzo profondo blocco (1 mL a wells) dovrà essere pianificata presto perché ci vorranno 12-24 ore per tutte le soluzioni additiva scongelare completamente a temperatura ambiente. Inoltre, una moltitudine di utenti condividono lo stesso schermo additivo, potenzialmente causando problemi con contaminazione incrociata. Infine, l'altezza del pozzi profondo blocchi li rende inadatti per la maggior parte dei distributori di nanolitro. Come una soluzione conveniente per aggirare questi problemi, lo schermo deve essere trasferito dal pozzo profondo blocco piastre di basso profilo (Figura 4).
Storicamente, schermate di additivi che includono un'ampia varietà di singoli reagenti (con singole concentrazioni) sono state molto popolari35,36. Tuttavia, sono stati sviluppati altri tipi di schermi additivi che integrano le miscele di additivi37 o un ridotto numero di singoli additivi trovato alle concentrazioni differenti38. Infine, un approccio complementare è quello di studiare l'effetto degli additivi su campioni prima cristallizzazione39,40.
5. altre considerazioni
Buone pratiche: La maggior parte delle schermate contengono sostanze dannose o addirittura tossiche e quindi un'adeguata protezione personale deve essere impiegata durante i protocolli. Ugualmente, parti dei robot in movimento possono causare lesioni, soprattutto quando si cerca di interferire manualmente mentre un programma è in esecuzione (anche se la maggior parte dei robot hanno sistema/pulsante di arresto di emergenza). A causa della complessità tecniche coinvolte, regolare il controllo di robot, schermi e programmi con precedentemente caratterizzato campioni del test sono importanti per alti livelli continui di riproducibilità.
Velocità di trasmissione: A titolo indicativo, tra 4.000-8.000 LMB piatti vengono prodotti annualmente con il sistema 1 (e successivamente impiegati dagli utenti per lo screening iniziale). Esso non è adatto a magazzino una grande quantità di piatti pre-riempite a 10 ° C, quando il fatturato atteso è molto più basso, come dopo 4-5 mesi, alcune condizioni inizierà a deteriorarsi e far evaporare. Diversi approcci ai protocolli di automazione sono stati implementati per laboratori di piccole-medie dimensioni41.
Memorizzazione e valutazione esperimenti: Dopo aver preparato le goccioline, piastre vengono memorizzati sugli scaffali di basso-vibrazione in una camera a 4 o 18 ° C con temperatura strettamente controllata (+ /-0,5 ° C massima deviazione). Gli esperimenti sono valutati utilizzando microscopi di fonte di luce fredda. Vari sistemi di imaging automatici sono disponibili in commercio, tuttavia uno deve considerare attentamente tutti gli aspetti: la velocità necessaria per eseguire la scansione una piastra sarà sufficiente per alta velocità effettiva? Oggetti diversi dai cristalli interferirà con autofocus? La qualità delle immagini sarà sufficiente per spot cristalli molto piccoli (soprattutto intorno al bordo delle goccioline)? 42 , 43 , 44
Confronto di condizioni di cristallizzazione: Dopo un'attenta indagini circa la natura dei cristalli ottenuti inizialmente, si può analizzare tendenze e somiglianze attraverso condizioni utilizzando il <a href="http://fms-3.lmb.internal/screens2/search.html">database di LMB schermo</a> o il C6 <a href="http://c6.csiro.au/">Strumento Web</a>45.

Cristallografia a raggi x si applica estesamente per avanzare ulteriormente la nostra comprensione dei meccanismi biologici e malattia a livello atomico e successivamente assistere approcci razionali di drug discovery1. Per questo, purificato e campioni macromolecolari (2-50 mg/mL) concentrato di proteine, DNA, RNA, altri ligandi e loro complessi sono sperimentati per la loro propensione a forma ordinato reticoli tridimensionali attraverso cristallizzazione2,3 ,4. Quando si ottengono cristalli di alta qualità che diffrangono i raggi x, la struttura di cristallo può essere risolto a vicino a risoluzione atomica5,6. Fondamentalmente, le condizioni a cristallizzare un romanzo campione non possono essere previsto e la resa dei cristalli di alta qualità è di solito molto bassa. Una ragione di fondo è che molti campioni di interesse hanno proprietà biochimiche impegnativa, che li rendono instabile sulla scala cronologica corrispondente per la cristallizzazione (in genere pochi giorni). Infine, il processo è aggravato dal tempo richiesto per produrre campioni e varianti di campione e per ottimizzare la loro purificazione e cristallizzazione7,8.
Una condizione di cristallizzazione è una soluzione con un precipitante che riduce la solubilità del campione e condizioni contengono spesso anche buffer e additivi. Centinaia di tali reagenti è adatti per modificare i parametri degli esperimenti di cristallizzazione come hanno scarsa propensione ad interferire con l'integrità del campione (ad esempio proteine o acidi nucleici dispiegarsi). Mentre testato milioni di combinazioni di reagenti di cristallizzazione non è fattibile, test diversi per molti kit di screening - formulato con varie strategie9,10 - è possibile con le prove miniaturizzate e protocolli automatizzati. In questa prospettiva, la tecnica più favorevole è probabilmente diffusione del vapore con le goccioline di nL 100-200 che si siede su un piccolo pozzo sopra un serbatoio contenente la condizione di cristallizzazione (25-250 µ l), implementata in cristallizzazione specializzati piastre11 , 12. il campione della proteina e la condizione sono spesso combinati in un rapporto di 1:1 per un volume totale di 200 nL durante l'impostazione le goccioline in superiore-pozzetti. Cristallizzazione della proteina nanolitro robotica può essere implementato con tecniche alternative e piatti come sotto-l'olio lotto13 e la fase cubica lipidico14 (quello più recente applicato specificamente a proteine trans-membrana che sono molto scarsamente solubile in acqua).
<a href="http://www2.mrc-lmb.cam.ac.uk/groups/JYL/WWWrobots/robot.html">L'impianto di cristallizzazione a MRC-LMB</a> è stato avviato all'inizio del 2000 e un riassunto iniziale dei nostri protocolli automatizzati è stato presentato nel 200515. Un'introduzione storica alla cristallizzazione della proteina è stata presentata e anche un contorno dei vantaggi della robotica nanolitro approccio (quindi un nuovo approccio alla sperimentazione sistematica). Dal macromolecolare cristallizzazione è essenzialmente un processo stocastico con molto poco o nessun utile informazione preventiva, che impiegano una vasta gamma di condizioni iniziali (adatte) aumentare il rendimento di qualità diffrazione cristalli16. Inoltre, un vantaggio spesso trascurato di un grande schermo iniziale è quello di ridurre in modo significativo la necessità di ottimizzazione dei campioni e cristalli in molti casi. Naturalmente, uno potrebbe essere ancora necessario procedere con l'ottimizzazione di alcune condizioni iniziali più tardi. In genere, la concentrazione dei reagenti e il pH quindi sono studiato sistematicamente. Altri reagenti possono anche essere introdotto nelle condizioni ottimizzate di modificare ulteriori parametri di cristallizzazione. Certamente, si dovrebbe tentare la cristallizzazione con un campione preparato al momento, quindi i protocolli corrispondenti devono essere semplice e disponibile ogni volta.
Qui, due completamente automatizzato sistemi progettati presso il MRC-LMB (sistemi 1 e 2) e i protocolli corrispondenti sono descritti. L'applicazione principale di questi due sistemi è iniziale di screening di diffusione del vapore nella goccia cristallizzazione piastre di seduta. Sistema 1 integra un gestore di liquido, un carosello automatizzato al magazzino Piastre, una stampante a getto d'inchiostro per l'etichettatura di piastra e un copripiastra adesivo. Sul sistema 1, 72 piastre da 96 pozzetti sono riempite con i kit di screening disponibile in commercio (80 µ l di condizione trasferito al serbatoio da un volume iniziale di 10 mL in provette), etichettate e sigillate. Le piastre vengono quindi archiviate in un'incubatrice di 10 ° C, dove sono disponibili per gli utenti in qualsiasi momento (come schermate iniziali chiamati 'Piastre LMB').
Sistema 2 integra un gestore di liquido, un dispenser nanolitro e un copripiastra adesivo. Sul sistema 2, seduta goccioline (nL 100-1.000) per gli esperimenti di diffusione del vapore sono prodotte mediante la combinazione di condizioni e il campione nei pozzetti-superiore di 20 48 o 96 pozzetti piastre pre-riempita con condizioni. Ciò significa 1.920 screening iniziale condizioni sono sperimentate quando si utilizza 20 piastre di LMB sul sistema 2.
Robot sono utilizzati anche singolarmente per l'ottimizzazione delle condizioni selezionate, e inoltre vengono descritti i protocolli semi-automatici corrispondenti. Il metodo 4-angolo17 è impiegato abitualmente per produrre schermi di ottimizzazione. Il protocollo corrispondente richiede innanzitutto la preparazione manuale di 4 soluzioni ('A, B, C e D'). Due gradienti lineari delle concentrazioni (per due agenti principali di cristallizzazione) sono poi automaticamente generati direttamente nei serbatoi di una piastra di cristallizzazione. Per questo, un gestore di liquido basato su siringa eroga le soluzioni 4 angolo a differenti rapporti.
Per ottimizzare ulteriormente una condizione, uno può impiegare schermi additivi che potenzialmente migliorare le proprietà di risultante cristalli18. Due approcci sono disponibili per lo screening di additivo: un protocollo a partire con additivi erogati nei serbatoi delle piastre di cristallizzazione prima dell'impostazione le goccioline (protocollo 1) e un altro protocollo dove viene erogata la schermata additiva direttamente le goccioline (protocollo n. 2).
Altri sviluppi utili che sono stati avviati presso il MRC-LMB per facilitare la cristallizzazione macromolecolari automatizzati, inoltre sono presentati. Essenzialmente, piastre di cristallizzazione e dispositivi associati come un impilabile società di biomolecolari di Screening (SBS) coperchio che minimizza l'evaporazione delle condizioni quando si utilizza il sistema 2.
Per brevità, si presume che gli utenti hanno familiari con le funzioni di base e la manutenzione di dispenser nanolitro, stampante a getto d'inchiostro e il copripiastra adesivo. Salvo diversa indicazione, le piastre sul ponte dei robot sono posizionati tali che il pozzetto A1 (A1-corner) è verso l'angolo posteriore sinistro di un elemento portante del piatto.

<table><tbody><tr><td>Robots</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Freedom EVO&reg;</td><td>Tecan</td><td>n/a</td><td>Gestore di liquidi (Sistema 1). Aspirazione/erogazione in base al liquido del sistema. Integra un carosello automatizzato. EVOware plus software di controllo v.2.4.12.0.&nbsp;</td></tr><tr><td>Microlab® STAR&commercio;</td><td>Hamilton</td><td>n/a</td><td>Gestore di liquidi (Sistema 2). Aspirazione/erogazione basata sullo spostamento positivo (tecnologia CO-RE&trade;). Software di controllo Hamilton STAR v.4.3.5.4785 con interfaccia di gestione dei metodi.</td></tr><tr><td>Zanzare&reg;</td><td>TTP Labtech</td><td>n/a</td><td>Dispenser di nanolitri basato su microsiringhe utilizzato per l'impostazione di goccioline (Sistema 2 e stand-alone), deck a 3 posizioni. Software di controllo v.3.11.0.1422.&nbsp;</td></tr><tr><td>Libellula&reg;</td><td>TTP Labtech</td><td>n/a</td><td>Liquid handler a siringa utilizzato per produrre schermate di ottimizzazione (metodo a 4 angoli). Software di controllo v.1.2.1.10196.</td></tr><tr><td>Sigillatrice per piastre adesive</td><td>Brandel</td><td>n/a</td><td>Integrata nei sistemi 1 e 2 (utilizzata anche come robot stand-alone).</td></tr><tr><td>Stampante a getto d'inchiostro 9232</td><td>Markem-Imaje</td><td>n/a</td><td>Integrata al sistema 1. Interfaccia touchscreen.</td></tr><tr><td>Schermi di cristallizzazione</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Crystal Screen&trade; 1</td> Kit di cristallizzazione <td>Hampton Research</td><td>HR2-110</td><td>(provette, 10mL per condizione) utilizzato in LMB01</td></tr><tr><td>Crystal Screen 2&trade;</td>Kit di cristallizzazione <td>Hampton Research</td><td>HR2-112</td><td>(provette, 10 ml per condizione) utilizzato in LMB01</td></tr><tr><td>Wizard&trade; Kit di cristallizzazione Classic 1</td><td>Rigaku</td><td>1009530</td><td>(provette, 10 ml per condizione) utilizzato in LMB02</td></tr><tr><td>Wizard&trade; Kit di cristallizzazione Classic 2</td><td>Rigaku</td><td>1009531</td><td>(provette, 10 ml per condizione) utilizzato in LMB02</td></tr><tr><td>Grid Screen&trade; Kit di cristallizzazione del solfato di ammonio</td><td>Hampton Research</td><td>HR2-211</td><td>(provette, 10mL per condizione) utilizzato in LMB03</td></tr><tr><td>Grid Screen&trade; Kit di cristallizzazione PEG/LiCl</td><td>Hampton Research</td><td>HR2-217</td><td>(provette, 10 ml per condizione) utilizzato in LMB03</td></tr><tr><td>Quick Screen&trade;</td>Kit di cristallizzazione <td>Hampton Research</td><td>HR2-221</td><td>(provette, 10 ml per condizione) utilizzato in LMB03</td></tr><tr><td>Grid Screen&trade; Kit</td> di cristallizzazione <td>Hampton Research</td><td>HR2-219</td> di <td>cloruro di sodio (provette, 10 ml per condizione) utilizzato in LMB03</td></tr><tr><td>Grid Screen&trade; PEG 6000</td><td>Hampton Research</td><td>HR2-213</td><td>Kit di cristallizzazione (provette, 10 ml per condizione) utilizzato in LMB04</td></tr><tr><td>Grid Screen&trade; Kit</td> di cristallizzazione MPD <td>Hampton Research</td><td>HR2-215</td><td>(provette, 10 ml per condizione) utilizzato in LMB04</td></tr><tr><td>MemFac&trade;</td>Kit di cristallizzazione <td>Hampton Research</td><td>HR2-114</td><td>(provette, 10 ml per condizione) utilizzato in LMB04</td></tr><tr><td>PEG/Ion&commercio;</td>Kit di cristallizzazione <td>Hampton Research</td><td>HR2-126</td><td>(provette, 10 ml per condizione) utilizzato in LMB05</td></tr><tr><td>Natrix&trade;</td>Kit di cristallizzazione <td>Hampton Research</td><td>HR2-116</td><td>(provette, 10 ml per condizione) utilizzato in LMB05</td></tr><tr><td>Crystal Screen Lite&trade;</td>Kit di cristallizzazione <td>Hampton Research</td><td>HR2-128</td><td>(provette, 10 ml per condizione) utilizzato nello schermo LMB06</td></tr><tr><td>Custom Lite</td><td>Molecular Dimensions Ltd</td><td>n/a</td><td>Kit di cristallizzazione (provette, 10 ml per condizione) utilizzato in LMB06</td></tr><tr><td>Wizard&trade; Kit di cristallizzazione Cryo 1</td><td>Rigaku</td><td>1009536</td><td>(provette, 10 ml per condizione) utilizzato in LMB07</td></tr><tr><td>Wizard&trade; Kit di cristallizzazione Cryo 2</td><td>Rigaku</td><td>1009537</td><td>(provette, 10 ml per condizione) utilizzato in LMB07</td></tr><tr><td>JBS1</td><td>JenaBioScience</td><td>CS-101L</td><td>Kit di cristallizzazione (provette, 10 ml per condizione) utilizzato in LMB08</td></tr><tr><td>JBS2</td><td>JenaBioScience</td><td>CS-102L</td><td>Kit di cristallizzazione (provette, 10 ml per condizione) utilizzato in LMB08</td></tr><tr><td>JBS3</td><td>JenaBioScience</td><td>CS-103L</td><td>Kit di cristallizzazione (provette, 10 ml per condizione) utilizzato in LMB08</td></tr><tr><td>JBS4</td><td>JenaBioScience</td><td>CS-104L</td><td>Kit di cristallizzazione (provette, 10 ml per condizione) utilizzato in LMB08</td></tr><tr><td>JBS5</td><td>JenaBioScience</td><td>CS-105L</td><td>Kit di cristallizzazione (provette, 10 ml per condizione) utilizzato in LMB09</td></tr><tr><td>JBS6</td><td>JenaBioScience</td><td>CS-106L</td><td>Kit di cristallizzazione (provette, 10 ml per condizione) utilizzato in LMB09</td></tr><tr>Kit di cristallizzazione <td>JBS7</td><td>JenaBioScience</td><td>CS-107L</td><td>(provette, 10 ml per condizione) utilizzato in LMB09</td></tr><tr><td>JBS8</td><td>JenaBioScience</td><td>CS-108L</td><td>Kit di cristallizzazione (provette, 10 ml per condizione) utilizzato in LMB09</td></tr><tr><td>JBS9</td><td>JenaBioScience</td><td>CS-109L</td><td>Kit di cristallizzazione (provette, 10 ml per condizione) utilizzato in LMB10</td></tr><tr><td>JBS10</td><td>JenaBioScience</td><td>CS-110L</td><td>Kit di cristallizzazione (provette, 10 ml per condizione) utilizzato in LMB10</td></tr><tr><td>Clear Strategy&trade; Schermo 1 pH 4.5</td><td>Molecular Dimensions Ltd</td><td>MD1-16LMB</td><td>Kit di cristallizzazione (provette, 10mL per condizione) utilizzato in LMB10</td></tr><tr><td>Clear Strategy&trade; Schermo 1 pH 5.5</td><td>Molecular Dimensions Ltd</td><td>MD1-16LMB</td><td>Kit di cristallizzazione (provette, 10mL per condizione) utilizzato in LMB10</td></tr><tr><td>Clear Strategy&trade; Schermo 1 pH 6.5</td><td>Molecular Dimensions Ltd</td><td>MD1-16LMB</td><td>Kit di cristallizzazione (provette, 10mL per condizione) utilizzato in LMB11</td></tr><tr><td>Clear Strategy&trade; Schermo 1 pH 7.5</td><td>Molecular Dimensions Ltd</td><td>MD1-16LMB</td><td>Kit di cristallizzazione (provette, 10 ml per condizione) utilizzato in LMB11</td></tr><tr><td>Clear Strategy&trade; Schermo 1 pH 8.5</td><td>Molecular Dimensions Ltd</td><td>MD1-16LMB</td><td>Kit di cristallizzazione (provette, 10mL per condizione) utilizzato in LMB11</td></tr><tr><td>Clear Strategy&trade; Schermo 2 pH 4.5</td><td>Molecular Dimensions Ltd</td><td>MD1-16LMB</td><td>Kit di cristallizzazione (provette, 10 ml per condizione) utilizzato in LMB11</td></tr><tr><td>Clear Strategy&trade; Schermo 2 pH 5.5</td><td>Molecular Dimensions Ltd</td><td>MD1-16LMB</td><td>Kit di cristallizzazione (provette, 10mL per condizione) utilizzato in LMB12</td></tr><tr><td>Clear Strategy&trade; Schermo 2 pH 6.5</td><td>Molecular Dimensions Ltd</td><td>MD1-16LMB</td><td>Kit di cristallizzazione (provette, 10mL per condizione) utilizzato in LMB12</td></tr><tr><td>Clear Strategy&trade; Schermo 2 pH 7.5</td><td>Molecular Dimensions Ltd</td><td>MD1-16LMB</td><td>Kit di cristallizzazione (provette, 10 ml per condizione) utilizzato in LMB12</td></tr><tr><td>Clear Strategy&trade; Schermo 2 pH 8.5</td><td>Molecular Dimensions Ltd</td><td>MD1-16LMB</td><td>Kit di cristallizzazione (provette, 10mL per condizione) utilizzato in LMB12</td></tr><tr><td>Index&trade;</td>Kit di cristallizzazione <td>Hampton Research</td><td>HR2-144</td><td>(provette, 10 ml per condizione) utilizzato in LMB13</td></tr><tr><td>SaltRX&trade; 1</td> Kit di cristallizzazione <td>Hampton Research</td><td>HR2-107</td><td>(provette, 10mL per condizione) utilizzato in LMB14</td></tr><tr><td>SaltRX&trade; 2</td> Kit di cristallizzazione <td>Hampton Research</td><td>HR2-109</td><td>(provette, 10mL per condizione) utilizzato in LMB14</td></tr><tr><td>MemStar&trade;</td><td>Molecular Dimensions Ltd</td><td>MD1-21</td><td>Kit di cristallizzazione (provette, 10 ml per condizione) utilizzato in LMB15</td></tr><tr><td>MemSys&trade;</td><td>Molecular Dimensions Ltd</td><td>MD1-25</td><td>Kit di cristallizzazione (provette, 10 ml per condizione) utilizzato in LMB15</td></tr><tr><td>JCSG-plus&trade; Suite</td><td>Qiagen</td><td>130720</td><td>Kit di cristallizzazione (provette, 10 ml per condizione) utilizzato nello schermo LMB16</td></tr><tr><td>MORPHEUS&reg;</td><td>Molecular Dimensions Ltd</td><td>MD1-46</td><td>Kit di cristallizzazione (provette, 10 ml per condizione) utilizzato nello schermo minimo LMB17</td></tr><tr><td>Pi</td><td>JenaBioScience</td><td>CS-127</td><td>Kit di cristallizzazione (provette, 10 ml per condizione) utilizzato nello schermo LMB18</td></tr><tr><td>Pi-PEG</td><td>JenaBioScience</td>Kit di cristallizzazione <td>CS-128</td><td>(provette, 10 ml per condizione) utilizzato in LMB19</td></tr><tr><td>MORPHEUS&reg; Kit</td><td></td><td></td><td>di cristallizzazione (provette, 10 ml per condizione) utilizzato nello schermo di cristallizzazione LMB20</td></tr><tr><td>LMB&commercio;</td><td>Molecular Dimensions Ltd</td><td>MD1-98</td><td>Kit di cristallizzazione (provette, 10 ml per condizione) utilizzato negli schermi additivi LMB21</td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>HT Schermo additivo</td><td>Hampton Research</td><td>HR2-138</td><td>Congelato in un blocco deepwell a 96 pozzetti (1 mL per pozzetto).</td></tr><tr><td>Schermo additivo MORPHEUS® Molecular</td><td>Dimensions Ltd</td><td>MD1-93-500</td><td>Congelato in blocco di pozzetti profondi a 96 pozzetti (500 & micro; L per pozzetto).</td></tr><tr><td>Vaglio additivo ANGSTROM&trade; &nbsp;</td><td>Molecular Dimensions Ltd</td><td>MD1-100</td><td>Congelato in blocco di pozzetti profondi a 96 pozzetti (1 mL per pozzetto).</td></tr><tr><td>Schermo additivo MORPHEUS® Molecular</td><td>Dimensions Ltd</td><td>MD1-93</td><td>Congelato in coltura cellulare a 96 pozzetti Piastra Costar® reg; con pozzetti a forma di V (100 &micro; L per pozzetto).</td></tr><tr><td>Vaglio additivo ANGSTROM&trade; &nbsp;</td><td>Molecular Dimensions Ltd</td><td>MD1-100-FX</td><td>Congelato in coltura cellulare a 96 pozzetti Piastra Costar&reg; con pozzetto a forma di V (100 &; micro; L per pozzetto).</td></tr><tr><td>HIPPOCRATES additivo screening</td><td>Molecular Dimensions Ltd</td><td>n/a</td><td>48 singoli additivi (composti farmacologici trovati in MORPHEUS&reg; III).</td></tr><tr><td>Altri materiali di consumo</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>96-well MRC 2-drop plate</td><td>Swissci</td><td>MRC 96T-UVP</td><td>Sitting-drop, piastra di diffusione del vapore. Volume del serbatoio consigliato: 80&nbsp; &micro;L. Gamma di volumi utili di goccioline: 10-1000 nL. Trasmissibile ai raggi UV.</td></tr><tr><td>Piastra MRC a 48 pozzetti a 1 goccia&nbsp; ('MAXI targa')</td><td>Swissci</td><td>MMX01-UVP&nbsp;</td><td>Piastra di diffusione del vapore a goccia seduta per scale-up/ottimizzazione. Volume del serbatoio consigliato: 200&nbsp; &micro;L. Gamma di volumi utili di goccioline: 0,1-10 &micro;L. Trasmissibile ai raggi UV.</td></tr><tr><td>Guarnizione a goccia sospesa MRC</td><td>Swissci</td><td>n/a</td><td>Hanging-drop, compatibile con entrambe le piastre di diffusione del vapore MRC (MRC 96T-UVP e MMX01-UVP ). Trasmissibile ai raggi UV e ai raggi X.</td></tr><tr><td>Nastro sigillante adesivo</td><td>Hampton Research</td><td>HR4-50</td><td>3 pollici di larghezza Duck&reg; HD Chiaro e commerciale; per sigillatura e sigillatura manuale.</td></tr><tr><td>Foglio di alluminio adesivo</td><td>Beckman Coulter</td><td>538619</td><td>Utilizzato per risigillare gli schermi additivi.</td></tr><tr><td>Cartuccia d'inchiostro</td><td>Markem-Imaje</td><td>9651</td><td>System 1 (stampante a getto d'inchiostro).</td></tr><tr><td>Cartuccia solvente</td><td>Markem-Imaje</td><td>8652</td><td>System 1 (stampante a getto d'inchiostro).</td></tr><tr><td>50 &micro; L suggerimenti&nbsp;</td><td>Hamilton</td><td>235947</td><td>System 2 (gestore di liquidi STAR&trade). Scatola da 6 set con 1920 x CO-RE&trade; punte in pile usa e getta.</td></tr><tr><td>Contenitore per reagenti</td><td>Hamilton</td><td>194052</td><td>Utilizzato per erogare una condizione in una o più piastre durante i protocolli di screening degli additivi.</td></tr><tr><td>piastra PCR</td><td>Thermo Scientific&trade;</td><td>AB-2150</td><td>System 2 (contiene proteine da trasferire al Mosquito). Abgene Diamond ultra, 384 pozzetti a forma di V.</td></tr><tr><td>microsiringhe</td><td>TTP Labtech</td><td>4150-03020</td><td>Bobina da 26.000 microsiringhe per l'erogatore di nanolitri Mosquito&reg; (spaziatura 9 mm).</td></tr><tr><td>blocco portastrisce</td><td>TTP Labtech</td><td>3019-05013</td><td>Dispositivo SSB per le strisce Mosquito&reg;, noto anche come "4-way Reagent Holder".</td></tr><tr><td>2 &micro; L Striscia a 8 pozzetti</td><td>TTP Labtech</td><td>4150-03110</td><td>Contiene proteine sul ponte del Mosquito. Scatola da 40 strisce, il volume massimo in pozzetto è di 3,2 &micro;L.</td></tr><tr><td>5 &micro; L Striscia a 8 pozzetti</td><td>TTP Labtech</td><td>4150-03100</td><td>Contiene proteine sul ponte del Mosquito. Scatola da 40 strisce, il volume massimo in vasca è di 7,5 &micro;L.</td></tr><tr><td>Siringhe da 5 mL</td><td>TTP Labtech</td><td>4150-07100</td><td>Corpo siringa e pistone per il gestore di liquidi Dragonfly®. Confezione da 100.</td></tr><tr><td>Abbeveratoi/Serbatoi</td><td>TTP Labtech</td><td>4150-07103</td><td>Contiene soluzioni di serie sul ponte del Dragonfly. Confezione da 50.</td></tr><tr><td>Agitatore orbitale per micropiastre</td><td>CamLab Limited</td><td>n/a</td><td>Variomag® per condizioni di miscelazione in una singola piastra (0-2000 giri/min).</td></tr><tr><td>Miscelatore per micropiastre</td><td>TTP Labtech</td><td>3121-01015</td><td>MxOne. Stato di miscelazione in un'unica piastra con 96 perni vibranti.</td></tr></tbody></table>

automatizzato di protocolli per cristallizzazione macromolecolare al mrc laboratorio di biologia molecolare

Automated Protocols for Macromolecular Crystallization at the MRC Laboratory of Molecular Biology

Quando si ottengono cristalli di alta qualità che diffrangono i raggi x, la struttura di cristallo può essere risolto a vicino a risoluzione atomica. Le condizioni di cristallizzare le proteine, DNA, RNA e loro complessi possono tuttavia non essere previsto. Impiegando un'ampia varietà di condizioni è un modo per aumentare il rendimento dei cristalli di diffrazione di qualità. Due sistemi completamente automatizzati sono stati sviluppati presso il MRC Laboratorio di biologia molecolare (Cambridge, Inghilterra, MRC-LMB) che facilitano la selezione di cristallizzazione contro 1.920 condizioni iniziali di diffusione del vapore in goccioline nanolitro. Inoltre sono stati sviluppati protocolli semi-automatici per ottimizzare le condizioni modificando le concentrazioni dei reagenti, il pH, o con l'introduzione di additivi che potenzialmente migliorare le proprietà dei cristalli risultanti. Tutti i protocolli corrispondenti saranno descritti in dettaglio e brevemente discussi. Presi insieme, esse consentono di cristallizzazione macromolecolari altamente efficiente e conveniente in una struttura multi-utente, dando il users controllo sui parametri chiave dei loro esperimenti.

Sistemi automatizzati e protocolli per la preparazione sistematica di un gran numero di schermi e goccioline di cristallizzazione nanolitro per gli esperimenti di diffusione del vapore sono descritti e discussi.

Automatizzato di protocolli per cristallizzazione macromolecolare al MRC Laboratorio di biologia molecolare

When high quality crystals are obtained that diffract X-rays, the crystal structure may be solved at near atomic resolution. The conditions to crystallize ...

L'obiettivo generale di questa procedura è ottenere cristalli di alta qualità a partire da condizioni iniziali di schermatura della cristallizzazione. I cristalli possono essere utilizzati per studiare le strutture di proteine, DNA, RNA e dei loro complessi. Lo studio delle strutture macromolecolari è diventato sempre più impegnativo.E fornire una vasta gamma di condizioni iniziali aumenta il rendimento di cristalli utili, riducendo al contempo la necessità di ottimizzazione del campione e dei cristalli. I due sistemi completamente automatizzati, il LMB, facilitano la preparazione di fino a 1.920 esperimenti di diffusione in fase di vapore in gocce di volume nanolitrico. Per brevità, si assume che gli utenti siano già familiari con le funzioni di base e la manutenzione del dispensatore nanolitrico, della stampante a getto d'inchiostro e del sigillante adesivo per piastre.Prima di eseguire la procedura, assicurarsi che i robot del sistema siano stati inizializzati e che il software di controllo sia aperto. Accendere il refrigeratore del supporto di raffreddamento per provette circa 30 minuti prima dell'avvio del programma principale. Posizionare una piastra di prova sul supporto SBS motorizzato del sigillatore di piastre.Eseguire il sigillatore per piastre e verificare che il film sia applicato correttamente. Ripetere questo test altre due volte per accertarsi che il sigillatore sia pronto. Quindi aggiungere 20 litri di acqua deionizzata al contenitore principale del distributore automatico di liquidi.Scollegare gli inserti di accoppiamento dal contenitore più piccolo contenente la soluzione di risciacquo al 20% di etanolo e collegare gli inserti al contenitore principale. Immettere il nome dello schermo appropriato sul touchscreen della stampante a getto d'inchiostro. Quindi aprire e chiudere la porta del caricatore per attivare la rotazione del caricatore.Aprire la porta quando appare il primo scaffale. Caricare completamente il primo scaffale con 22 piastre di cristallizzazione, ognuna con la colonna uno rivolta verso l'esterno. Caricare completamente i successivi due scaffali nello stesso modo.Caricare le rimanenti sei piastre nelle posizioni più alte del quarto stack, quindi chiudere lo sportello del carousel. Verificare che sul display del refrigeratore sia indicato 14 gradi Celsius. Invertire delicatamente e ripetutamente i kit di screening selezionati per un minuto.Quindi, aprire il pannello frontale del manipolatore di liquidi. Aprire le provette e posizionarle nel portaprovette refrigerato secondo il layout standard a 96 pozzetti. Dopo aver posizionato ogni provetta nel portaprovette, appoggiare il relativo coperchio sul vassoio seguendo lo stesso layout a 96 pozzetti.Quando si utilizza il Sistema 1, i cavi dell'etichetta vengono posizionati sul vassoio secondo la disposizione a 96 pozzetti per consentire il controllo incrociato che i tubi siano disposti correttamente. Verificare le posizioni dei tubi e assicurarsi quindi che tutti i tubi siano in piano e ben alloggiati nel supporto. Chiudere quindi il pannello frontale.Nella finestra Iniziale del software del manipolatore di liquidi, selezionare Esegui Manutenzione e aprire il programma di Sfiato. Eseguire il programma per eliminare il 20% di etanolo dal sistema e per lavare le parti esterne dei puntali di erogazione dei liquidi. Al termine dello sfiato, fare clic su Annulla per tornare alla schermata Iniziale.Selezionare Esegui un processo esistente e fare clic su Inizia la selezione. Aprire il programma di dispensazione del kit MRC. Compilare il campo Istanze con 18" nella schermata di configurazione ed eseguire il programma. Monitorare il sistema mentre le prime quattro piastre vengono etichettate, riempite e sigillate.Non lasciare il sistema incustodito fino al completamento della preparazione delle prime quattro piastre. Una volta che tutte e 72 le piastre sono state preparate e ricollocate nel carosello, sostituire gli inserti di accoppiamento dal contenitore di acqua deionizzata a quello di etanolo al 20%. Eseguire il programma di lavaggio iniziale utilizzando lo stesso procedimento di prima.Spegnere il refrigeratore e smaltire i tubi vuoti del kit di screening. Rimuovere con attenzione le 72 piastre preparate dal carosello. Smaltire le piastre riempite in modo errato o sigillate in modo inadeguato.Conservare le piastre pronte all'uso a 10 gradi Celsius. Verificare innanzitutto che i robot del sistema siano accesi, che il dispensatore di nanolitri sia inizializzato con il software aperto e che il gestore dei metodi del manipolatore di liquidi sia aperto. Accendere il supporto di raffreddamento per microtubi circa 15 minuti prima dell'avvio del programma principale.Posizionare una piastra di prova sul supporto SBS motorizzato del sigillatore per piastre. Eseguire il sigillatore per piastre e verificare che la piastra sia stata sigillata correttamente. Testare il sigillatore per piastre per tre volte.Quindi eseguire il dispensatore di nanolitri per depositare gocce da 100 nanolitri di soluzione di prova in una piastra di prova. Qui viene mostrata una microfotografia in luce di una goccia da 100 nanolitri, prodotta dal dispensatore di nanolitri, con la soluzione di prova preparata con un colorante rosso. Chiudere il software del dispensatore di nanolitri e rimuovere il blocco porta-strip dalla piattaforma.Successivamente, posizionare in un supporto per piastre appositamente progettato una piastra di cristallizzazione pre-riempita a 96 pozzetti contenente la quantità relativa più elevata di reagenti volatili nelle sue condizioni. Rimuovere il film adesivo dalla piastra. Aprire il pannello frontale del manipolatore di liquidi e posizionare la piastra non sigillata sul deck nella parte posteriore del primo carrello scorrevole.Coprire la piastra con un coperchio in alluminio SBS. Posizionare il coperchio verso l'angolo posteriore sinistro del supporto esercitando una leggera pressione sull'angolo opposto del coperchio. Quando si utilizza il Sistema 2, è consigliabile processare per primi i kit di screening contenenti quantità significative di reagenti volatili.Questo evita la formazione di condensa sui terminali SBS, che potrebbe compromettere la manipolazione automatizzata dei terminali o la sigillatura della piastra. Rimuovere il sigillo, caricare le piastre nei supporti scorrevoli e coprire le restanti 19 piastre nello stesso modo, procedendo dalle condizioni più a quelle meno volatili. Una volta che il supporto di raffreddamento per microtubi ha raggiunto i 4 gradi Celsius, come indicato da una luce verde, rimuoverne il coperchio.Tagliare il coperchio di una microprovetta contenente almeno 440 microlitri di un campione proteico. Assicurarsi che sul campione non sia presente schiuma al di sopra del menisco, poiché ciò interferirebbe con il sistema di rilevamento del liquido. Posizionare la provetta nella Posizione 1 del portaprovette refrigerato.Posizionare una piastra PCR sul deck del manipolatore di liquidi davanti al supporto dell'adattatore per lo spostamento delle piastre. Chiudere quindi il pannello frontale. Nell'interfaccia di gestione dei metodi del manipolatore di liquidi, selezionare Configura Piastre.Monitorare l'inizializzazione di entrambi i sistemi e compilare i parametri di esecuzione, inclusi il tipo di piastra e il numero di gocce per ogni condizione, la dimensione delle gocce, la posizione della prima piastra da elaborare e il numero di piastre. Fare clic su No quando viene chiesto se si desidera assistenza per il caricamento del deck. Dopo aver verificato che non ci siano rack di punte vuoti, fare clic su OK. Dopo aver verificato che ci siano abbastanza punte per l'esecuzione, fare clic su OK. Se necessario, aggiornare il sistema di gestione delle punte e fare clic su OK. Assicurarsi che il deck del dispensatore nanolitri sia libero dal blocco portastriscia e che il supporto sia nella parte posteriore delle pile di punte da 50 microlitri, che devono essere libere dai coperchi in alluminio SBS.Verificare nuovamente che tutti gli altri componenti necessari siano pronti e quindi avviare il processo. Monitorare il sistema mentre il dispensatore di nanolitri posiziona le gocce nella prima piastra e il sigillatore successivamente sigilla la piastra. Non lasciare il sistema incustodito fino al completamento della preparazione della prima piastra.Dopo aver preparato tutte e 20 le piastre con le gocce di cristallizzazione e averle fatte rientrare automaticamente nei supporti scorrevoli, aprire il pannello frontale ed estrarre delicatamente le piastre. Verificare che le piastre siano sigillate correttamente prima di riporle per la cristallizzazione. Pulire i coperchi SBS con la soluzione di etanolo al 20% prima di impilarli sul lato sinistro del manipolatore liquidi per l'immagazzinamento.Scartare la piastra PCR e la microprovetta. Spegnere il supporto refrigerato per microprovette e asciugare la condensa. Lasciare un tovagliolo di carta sulla superficie fredda per assorbire ulteriore condensa.Quindi sostituire il coperchio del portatore e chiudere il pannello anteriore. OmpF e MreB sono stati inizialmente analizzati utilizzando questi protocolli completamente automatizzati. Cristalli di OmpF di qualità sufficiente per la diffrazione a raggi X sono stati trovati nel pozzetto A4 della piastra LMB 7.Sono stati trovati cristalli di qualità adatta alla diffrazione per MreB nel pozzetto D12 della piastra LMB 20. Conservare le piastre pronte all'uso a 10 gradi Celsius rappresenta un compromesso per evitare il congelamento e la conservazione a 4 gradi, che potrebbe causare il deterioramento delle condizioni di cristallizzazione e problemi legati alla condensa. Se conservate in questo modo, le piastre possono essere utilizzate entro quattro o cinque mesi.Ogni anno vengono prodotte tra 4 e 8.000 piastre LMB con il Sistema 1, che vengono successivamente utilizzate per lo screening iniziale. I protocolli devono essere ottimizzati in modo diverso quando il numero previsto di piastre è molto inferiore. L'intero set di piastre pre-combustibile viene normalmente utilizzato come schermo iniziale su larga scala per un nuovo campione.Tuttavia, un numero inferiore di piastre può essere selezionato in base a requisiti specifici del campione. Dopo aver preparato le goccioline, le piastre vengono conservate su scaffali a bassa vibrazione con la temperatura rigorosamente controllata a 4 o 18 gradi Celsius. Gli esperimenti vengono valutati mediante microscopi con sorgente luminosa scorrevole.Dopo aver attentamente analizzato la natura dei cristalli, i tratti e le somiglianze tra diverse condizioni possono essere esaminati mediante strumenti basati sul web, come i database LMB o C6 Screen. Potrebbe essere ancora necessaria un'ulteriore ottimizzazione delle condizioni di cristallizzazione. Altri protocolli automatizzati, con metodi a quattro angoli e screening di additivi, sono descritti nel nostro manoscritto.

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