Uso di Immunolabeling per analizzare i microtubuli stabili, dinamici e nascenti nell'embrione di pesce zebra

L'obiettivo generale di queste procedure di marcatura è quello di ottenere immagini e quantificare microtubuli stabili, dinamici e nascenti nell'embrione di pesce zebra in via di sviluppo. Questo metodo può contribuire a rispondere a domande fondamentali nel campo della neurobiologia dello sviluppo, ad esempio in che modo i microtubuli partecipano all'instaurazione della polarità cellulare. Il principale vantaggio di questa tecnica è che ottimizza il rilevamento e la quantificazione di popolazioni distinte di microtubuli in situ.

Generalmente, le persone nuove rispetto a questo metodo incontreranno difficoltà a causa dei problemi nel mantenere l'integrità dei microtubuli. Dopo aver de-clorinato gli embrioni di pesce zebra stadiati seguendo il protocollo descritto nel testo, trasferirli in provette centrifughe da 1,5 mL, rimuovendo la maggior quantità possibile di mezzo. Aggiungere un millilitro di PFA al 4% in buffer di assemblaggio dei microtubuli o MAB, per fissare gli embrioni a 28,5 °C per cinque minuti.

Quindi utilizzare una pipetta per aspirare il fissativo e sostituirlo con un millilitro di fissativo fresco. Incubare i campioni su un agitatore orizzontale a temperatura ambiente per tre ore. Aspirare il fissativo e aggiungere un millilitro di tampone TBS NP-40.

Agitare delicatamente gli embrioni su un agitatore per cinque minuti. Ripetere il lavaggio altre due volte. Successivamente, dopo aver sostituito il tampone con un millilitro di TBS NP-40 fresco, conservare gli embrioni a quattro gradi Celsius per non più di sette giorni.

Dopo aver rimosso il tuorlo e aver incorporato gli embrioni in agarosio seguendo il protocollo descritto nel testo, posizionare la piastra per il taglio riempita con TBS NP-40 e utilizzare un vibratomo per ottenere sezioni di 40 micrometri lungo l'asse maggiore degli embrioni inclusi in agarosio. Utilizzare pinzette fini per trasferire le sezioni di interesse in 500 microlitri di TBS NP-40 in una piastra a 24 pozzetti. Rimuovere il tampone e aggiungere 500 microlitri di soluzione bloccante.

Quindi agitare le sezioni a temperatura ambiente per almeno un'ora. Sostituire la soluzione di blocco con 300 microlitri di anticorpi primari diluiti nel buffer di blocco e incubare i campioni su un agitatore a quattro gradi Celsius per 36-72 ore. Utilizzare 600 microlitri di TBS NP-40 per lavare i campioni due volte.

Posizionarli su un agitatore a temperatura ambiente per 30 minuti ciascuno. Aggiungere 300 microlitri di anticorpi secondari marcati con fluorocromo, diluiti nel buffer di blocco, alle sezioni e incubarli al buio su un agitatore a quattro gradi Celsius per 16-24 ore. Quindi lavare i campioni due volte come appena dimostrato.

Successivamente, aggiungere 500 microlitri di soluzione di DAPI agli embrioni e incubare a temperatura ambiente per 30 minuti. Quindi lavare i campioni tre volte con TBS NP-40 a temperatura ambiente per cinque minuti ciascuno. Dopo i lavaggi, posizionare una goccia di mezzo di montaggio con agente anti-sfalsamento al centro di un vetrino privo di polvere.

Utilizzare pinzette fini per trasferire le sezioni sulla goccia di mezzo di montaggio. Quindi posizionare un coprioggetto privo di polvere sopra il campione. Conservare i vetrini avvolti nella pellicola di alluminio, in un luogo asciutto, al buio e fresco fino all'acquisizione delle immagini.

Utilizzando i dettagli descritti nel protocollo testuale, acquisire immagini confocali in z stack con le impostazioni dei canali per i fluorocromi degli anticorpi secondari selezionati e salvare i file delle immagini. Con un software di analisi 3D come Image J, aprire una copia del file dati. Creare un'immagine fusa sovrapponendo i canali di interesse selezionando immagine, colore, unisci canali.

Selezionare i canali a 594 nanometri, 488 nanometri e DAPI da colorare artificialmente rispettivamente in rosso, verde e blu. Selezionare l'opzione per creare un'immagine composita e fare clic su OK. Visualizzare lo stack z unito come singola immagine 2D eseguendo una proiezione dell'intensità massima dello stack z utilizzando immagini, stack, z project.

Inserire le posizioni iniziale e finale dei piani z interni migliori come slide iniziale e slice di arresto, rispettivamente. Selezionare l'intensità massima come tipo di proiezione e fare clic su OK. Nel software di analisi 3D, selezionare "crea libreria" e fornire un nome descrittivo per la libreria di immagini.

Fare clic, creare e trascinare i file immagine grezzi nella libreria. Successivamente, selezionare un file da analizzare. Quindi, dal menu visualizzazione, scegliere fuoco esteso per mostrare l'immagine fusa per canale nella finestra principale.

Selezionare lo strumento ROI a mano libera e delimitare la regione di interesse da analizzare. Selezionare la scheda azioni, quindi ritaglia alla selezione per ritagliare l'immagine. Successivamente, salvare il file dell'immagine ritagliata con un nuovo nome.

Successivamente, fare clic sulla scheda misurazioni per creare il protocollo per filtrare oggetti specifici rilevanti per l'analisi 3D. Quindi trascinare l'opzione "trova oggetti" nella finestra del protocollo e rinominare il primo protocollo come DAPI. Selezionare il canale della beta tubulina nel menu a discesa.

Quindi trascinare le seguenti impostazioni nel protocollo della beta tubulina e posizionarle sotto "trova oggetti" nell'ordine seguente: riempi i buchi e gli oggetti, separa gli oggetti che si toccano, escludi gli oggetti in base alle dimensioni ed escludi quelli che non toccano le ROI. Ora selezionare "misura" in fondo a ciascun protocollo.

Quindi, per tutti i canali tranne DAPI, selezionare la misurazione dell'intensità e del volume e la lunghezza scheletrica per tutte le etichettature della tubulina. Disegnare un'area di interesse (ROI) attorno alla regione da misurare. Nella scheda riepilogo, osservare le misurazioni dopo che il software ha elaborato la regione.

Quindi copiare i dati e salvarli in un foglio di calcolo utilizzabile come mostrato qui. Per costruire un apparato a flusso attraverso pozzetti multipli, utilizzando un dispositivo di bloccaggio o una sega a nastro, dividere longitudinalmente un tubo da centrifuga da 50 millilitri in due metà. Da una rete in nylon da 70 micrometri, ritagliare sette semicerchi con un raggio di tre centimetri e modificarne i bordi in modo che si adattino perfettamente all'interno di una delle due metà del tubo da centrifuga diviso.

Utilizzando un sigillante siliconico sicuro per acquari, incollare le semicirconferenze all'interno del tubo da centrifuga in modo parallelo alle tacche di graduazione da 10 millilitri. Dopo aver lasciato asciugare il dispositivo per due giorni, sciacquarlo immergendolo in un becher d'acqua per due o tre ore. Rivestire l'estremità superiore filettata del tubo da centrifuga tagliato con argilla modellabile, in modo che l'altezza del liquido trattenuto nel dispositivo a flusso continuo sia di un quarto di pollice.

Preparare l'apparato di lavaggio rimuovendo lo stantuffo da una siringa da 50 millilitri e inserendo 12 pollici di tubo sottile nella punta. Spingere il tubo fino in fondo e utilizzare argilla modellabile per sigillare il giunto. Con il mezzo per embrioni, inumidire preventivamente la maglia in modo che il liquido possa scorrere attraverso l'intero dispositivo a flusso continuo.

Inclinare il dispositivo sul ghiaccio in modo che il liquido penetri in tutti i compartimenti, ma fuoriesca comunque dalla parte anteriore dove si trova il bordo di argilla. Sospendere l'apparato di lavaggio su un treppiede sopra il dispositivo a flusso continuo, mantenendolo sul ghiaccio. Raffreddare 200 millilitri di mezzo per embrioni sul ghiaccio e versarne una quantità sufficiente nell'apparato di lavaggio per assicurare l'eliminazione di tutte le bolle d'aria e ottenere una portata di circa sette millilitri al minuto.

Regolare la portata modificando l'altezza della siringa. Dopo aver de-clorinato gli embrioni e preparato il nocodazolo secondo il protocollo descritto nel testo, utilizzare 10 millilitri di soluzione lavorativa fredda di nocodazolo per sostituire il mezzo degli embrioni del gruppo trattato con nocodazolo. Collocare le piastre di Petri sul ghiaccio per un tempo appropriato in base allo stadio di sviluppo.

Quindi, utilizzando una pipetta di vetro da un millilitro con estremità arrotondata a fiamma, trasferire gli embrioni nell'apparato a flusso continuo usando compartimenti separati per ciascun gruppo sperimentale. Iniziare il lavaggio del nocodazolo versando il mezzo per embrioni freddo di ghiaccio nella parte superiore della siringa da 50 millilitri. Permettere ai microtubuli di rigenerarsi dopo 20 minuti di lavaggio a temperatura ambiente, utilizzando una pipetta di vetro da un millilitro con estremità arrotondata a fiamma per trasferire gli embrioni in piatti di Petri di vetro contenenti mezzo per embrioni caldo.

Non appena gli embrioni vengono trasferiti, avviare un cronometro. Infine, fissare gli embrioni di controllo e quelli di washout a uno, cinque e dieci minuti prelevando con pipetta circa 10 embrioni e trasferendoli in una provetta da centrifuga da 1,5 millilitri riempita con un millilitro di fissativo MAB al 4% di PFA, quindi fissare i campioni come dimostrato in precedenza in questo video. Utilizzando glu-tubulina e tyr-tubulina come marcatori per microtubuli stabili e dinamici.

Si è dimostrato che microtubuli dinamici predominano nel cervello posteriore allo stadio di placca neurale. Mentre la placca si sviluppa nel cordone neurale, uno stadio caratterizzato da un potenziamento dell'epitelializzazione, qualitativamente si osserva una minore reattività immunologica ai microtubuli con l'anticorpo anti-tir-tubulina, in particolare nel cordone neurale ventrale. Al contrario, la glu-tubulina è distribuita in modo disperso e puntiforme in tutta la placca neurale, ma risulta arricchita nel cordone neurale ventrale lungo il tratto dei microtubuli.

Le teste delle frecce indicano specifici fasci o strutture microtubulari in cui l'etichettatura è aumentata. Il trattamento con nocodazolo depolimerizza i microtubuli, provocando un'etichettatura diffusa. Mentre i microtubuli ricolonizzano, si estendono a partire dal centrosoma.

Tuttavia, ciò potrebbe non essere evidente in un singolo piano a causa delle loro traiettorie non planari. Nondimeno, alcuni software di analisi delle immagini sono in grado di misurare le lunghezze in 3D, permettendo una valutazione della crescita dei microtubuli dopo il lavaggio del nocodazolo. La lunghezza media dei microtubuli sembra aumentare nel tempo dopo il lavaggio del nocodazolo in tutte le regioni del tubo neurale analizzate.

Una volta completata l'analisi dei dati mediante il software di analisi delle immagini 3D e controllata la qualità, è possibile recuperare informazioni utili dai dati grezzi, come la lunghezza media dei microtubuli totali e dei microtubuli stabili, oltre al rapporto tra microtubuli stabili e microtubuli totali. Una volta padroneggiata, questa tecnica richiede non più di una settimana dall'inizio alla fine. Durante l'esecuzione di questa procedura, è importante ricordare di raccogliere ed elaborare i campioni tempestivamente, poiché i microtubuli si depolimerizzano facilmente.

Questa procedura può essere applicata anche all'analisi di mutanti. Dopo aver visto questo video, dovresti avere una buona comprensione di come catturare popolazioni distinte di microtubuli nell'embrione intatto.