Microcristallografia dei cristalli proteici e

L'obiettivo generale di questo protocollo è presentare le metodologie della cristallografia a raggi X applicate ai microcristalli, in particolare a quelli prodotti all'interno di cellule, considerati cristalli in vivo. Il principale vantaggio di questo approccio è che fornisce un processo semplice ed efficiente per produrre, rilevare e analizzare microcristalli. Questo metodo mira a facilitare l'uso dei microcristalli impiegando cristalli sviluppati all'interno di cellule vive, eliminando la necessità di complessi processi di purificazione e di prove con sedazione da Aprocox.

In questo video ci concentreremo sulla preparazione e manipolazione semplice per esperimenti di deflessione a raggi X presso una linea di fascio di sincrotrone. Mostreremo i passaggi che differiscono maggiormente dalla cristallografia classica. In questa dimostrazione utilizzeremo cristalli della proteina del poliedro vitale coltivati con successo, ma il metodo può essere applicato anche a proteine che formano cristalli in qualsiasi tipo di cellula batterica, insetto, mammifera o lievito.

Per prima cosa, incubare 30 millilitri di cellule Sf9 che sovraesprimono la proteina poliedrica del cypovirus per tre giorni a 27 gradi Celsius su una piattaforma rotante. Trasferire 500 microlitri di coltura cellulare Sf9 in una provetta da microcentrifuga utilizzando una pipetta sierologica sterile, avendo cura di mantenere la sterilità della coltura principale lavorando all'interno di un armadio di sicurezza biologica di classe II e seguendo le normali tecniche asettiche. Pipettare cinque microlitri di cellule dalla provetta da microcentrifuga su un vetrino.

Quindi, inclinare delicatamente un coprioggetto di vetro sul campione, appoggiando un bordo sulla goccia e abbassare con attenzione il coprioggetto sul liquido, evitando la formazione di bolle d'aria. Successivamente, acquisire un'immagine del vetrino mediante un microscopio invertito. Esaminare attentamente le cellule, iniziando con un ingrandimento di 200x e aumentando al massimo ingrandimento nel momento in cui si rileva un cristallo potenziale.

Cercare bordi netti e variazioni nella rifrattività. Se vengono identificati cristalli, esaminare la coltura quotidianamente per monitorare la crescita dei cristalli ripetendo i passaggi precedenti. Per le cellule Sf9, raccogliere trasferendo la coltura in un tubo da centrifuga.

Posizionare il tubo sul ghiaccio e procedere al passaggio successivo il prima possibile. Per l'isolamento di cellule contenenti cristalli, pipettare quattro millilitri di cellule Sf9 infette in un tubo adatto all'analisi mediante citometria a flusso. Preparare un secondo tubo con un numero equivalente di cellule Sf9 provenienti da una coltura mock-infetta come controllo.

Successivamente, aggiungere ioduro di propidio a entrambi i campioni fino a raggiungere una concentrazione finale di un microgrammo per millilitro, immediatamente prima della valutazione mediante citometria a flusso. Ora, applicare le cellule del campione di controllo a un citometro a flusso standard in grado di effettuare il sorting cellulare in base a FSC e SSC. Analizzare almeno 20.000 eventi.

Dopo aver escluso dalle analisi le cellule morte, gli aggregati cellulari e i detriti, generare il grafico FSC rispetto a SSC. Successivamente, analizzare almeno 20.000 eventi del campione contenente cristalli. Confrontare il grafico FSC rispetto a SSC con il controllo e verificare la comparsa di una popolazione distinta corrispondente a cellule contenenti cristalli.

Definire le porte intorno alla popolazione cellulare contenente cristalli, che di solito appare con valori più elevati di SSC o FSC. Utilizzando questo gating, separare circa 150.000-200.000 cellule contenenti cristalli in una provetta microcentrifuga da 1,5 millilitri precedentemente riempita con 50 microlitri di tampone PBS. Acquisire immagini dei campioni separati mediante microscopia ottica, come descritto in precedenza, per confermare quale popolazione è associata alle cellule contenenti cristalli.

A questo stadio, le cellule possono essere incubate con soluzioni di atomi pesanti se è richiesta la determinazione di fase sperimentale. Questo approccio segue lo screening di vari composti e tempi di incubazione come descritto nel testo e in altre revisioni. Preparare gli strumenti per il montaggio del campione attaccando innanzitutto una microgriglia montata su un perno all'estremità di un'asta magnetica.

Posizionare la bacchetta lateralmente nella fessura di un galleggiante per dialisi. Successivamente, prendere una micropompa di carta con una pinzetta e bloccarla. Verificare attentamente che l'allestimento sia completo prima di procedere.

Ora, mescolare le cellule con un volume uguale di soluzione di blu di tripano al 0,4% per ottenere una concentrazione finale dello 0,2%. Dopo aver risospeso le cellule, pipettare 0,5 microlitri delle cellule ordinate sulla micromaglia. Dopo aver lasciato depositare le cellule sulla superficie della micromaglia, rimuovere la maggior parte del liquido in eccesso asciugando con una micca di carta. Se la micromaglia non viene asciugata sufficientemente, le cellule si troveranno a diverse profondità all'interno del liquido in eccesso, il che complicherà il loro allineamento con il fascio di raggi X al sincrotrone.

Inoltre, l'eccesso di liquido aumenterà la diffusione di raggi X di fondo. Se la griglia microforata viene asciugata eccessivamente, il liquido verrà completamente rimosso e il campione non sarà trattenuto nelle aperture della griglia. Con un'asciugatura ottimale, rimane solo uno strato sottile di liquido sulla griglia microforata, che protegge il campione e lo costringe a entrare nelle aperture della griglia.

Alcuni cristalli richiederanno l'uso di un crioprotettore. Nel nostro caso ciò non è necessario, ma la procedura sarebbe la stessa di quella per l'applicazione del campione e successiva asciugatura. Assicurarsi che rimanga solo uno strato sottile di liquido.

Raffreddare immediatamente in modo rapido la griglia microscopica in azoto liquido e trasferirla su un puck robotizzato per il trasporto a una linea di luce microfocus di sincrotrone. A causa delle piccole dimensioni dei cristalli in vivo, raccogliere i dati di diffrazione su una linea di luce per cristallografia microfocus. Montare innanzitutto la griglia microscopica sul goniometro.

Ora, iniziare centrando la microgriglia con il percorso del fascio utilizzando le orientazioni frontale e laterale. Con la microgriglia orientata frontalmente, regolare finemente l'allineamento allineando il centro di una delle corsie orizzontali della microgriglia. Raccogliere i dati lungo questa corsia orizzontale con solo lievi ritocchi all'allineamento.

Dopo aver testato tutti i cristalli della corsia, passare alla corsia successiva e ripetere la procedura di allineamento. Assicurarsi che le corsie già processate siano chiaramente identificate in modo da non saltare cristalli né colpirli due volte, utilizzando il cambio di colore del blu di tripano come guida. Viene presentata una panoramica di due metodi per la determinazione della struttura mediante microcristalli in vivo.

La riga superiore descrive l'approccio classico che prevede la purificazione di cristalli da cellule, mentre la riga inferiore mostra l'approccio della cristallografia in cellulo, che mantiene i cristalli all'interno delle cellule ospiti per la raccolta dei dati. Per l'approccio in cellulo, il profilo di citometria a flusso delle cellule non infette viene confrontato con quello delle cellule contenenti cristalli ed è utilizzato per determinare quale popolazione cellulare selezionare al fine di separare le cellule contenenti cristalli dalle altre. In questo esempio, le cellule contenenti poliedri presentano una maggiore dispersione laterale rispetto alle cellule non infette.

Le cellule colorate con blu di tripano possono essere facilmente visualizzate utilizzando le telecamere disponibili nella maggior parte delle linee di luce di sincrotrone. Mentre i cristalli purificati sono laboriosi da identificare e allineare con il fascio di raggi X a causa delle loro piccole dimensioni, durante l'acquisizione dei dati è preferibile procedere secondo uno schema a griglia, al fine di minimizzare le procedure di centratura ed evitare di esporre due volte la stessa cellula o lo stesso cristallo oppure di saltare cellule e cristalli. Una volta acquisita padronanza, questo flusso richiede circa mezza giornata, dalla raccolta delle cellule contenenti i cristalli fino all'acquisizione dei dati.

Questa procedura è compatibile con immersioni in atomi pesanti per la determinazione sperimentale delle fasi. Nel caso del poliedro, la struttura normale è stata ottenuta in otto giorni a partire dall'inizio dell'espressione proteica. Non dimenticare che lavorare con azoto liquido può essere estremamente pericoloso e che devono essere adottate precauzioni contro soffocamento e ustioni.