Name: Microcristallografia dei cristalli proteici e In Cellulo Diffrazione (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-07-21T14:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 35 s
Description: Impara la cristallografia a raggi X applicata ai microcristalli proteici prodotti in vivo nelle cellule viventi. Questo metodo semplifica la produzione e l'analisi, eliminando complessi processi di purificazione per gli studi strutturali.

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Gli autori vorrebbero riconoscere Chan-Sien Lay per fornire immagini di microcristalli purificati, Daniel Eriksson e Tom Caradoc-Davies per il supporto alla linea MX2 del Synchrotron australiano e Kathryn Flanagan e Andrew Fryga della struttura FlowCore presso la Monash University per la loro Un&#39;assistenza inestimabile.

<ol><li>Tari, L. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+utility+of+structural+biology+in+drug+discovery%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol+Bio+%28Clifton%2C+N.J%29%22%5BJournal%5D)">The utility of structural biology in drug discovery.</a> Methods Mol Bio (Clifton, N.J). 841, 1-27 (2012).</li>
<li>Gati, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Serial+crystallography+on+in+vivo+grown+microcrystals+using+synchrotron+radiation%5BTitle%5D)+AND+%22IUCrJ%22%5BJournal%5D)">Serial crystallography on in vivo grown microcrystals using synchrotron radiation.</a> IUCrJ. 1 (2), 0(2014).</li>
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<li>Smith, J. L., Fischetti, R. F., Yamamoto, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Micro-crystallography+comes+of+age%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Opin+Struct+Biol%22%5BJournal%5D)">Micro-crystallography comes of age.</a> Curr Opin Struct Biol. 22 (5), 602-612 (2012).</li>
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<li>Li, D., Boland, C., Aragao, D., Walsh, K., Caffrey, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Harvesting+and+Cryo-cooling+Crystals+of+Membrane+Proteins+Grown+in+Lipidic+Mesophases+for+Structure+Determination+by+Macromolecular+Crystallography%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Harvesting and Cryo-cooling Crystals of Membrane Proteins Grown in Lipidic Mesophases for Structure Determination by Macromolecular Crystallography.</a> J Vis Exp. (67), (2012).</li>
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<li>Koopmann, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vivo+protein+crystallization+opens+new+routes+in+structural+biology%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Methods%22%5BJournal%5D)">In vivo protein crystallization opens new routes in structural biology.</a> Nature Methods. 9 (3), 259-262 (2012).</li>
<li>Gallat, F. -X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vivo+crystallography+at+X-ray+free-electron+lasers%3A+the+next+generation+of+structural+biology%5BTitle%5D)+AND+%22Phil+Trans+R+Soc+B%22%5BJournal%5D)">In vivo crystallography at X-ray free-electron lasers: the next generation of structural biology.</a> Phil Trans R Soc B. 369 (1647), 20130497(2014).</li>
<li>Duszenko, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vivo+protein+crystallization+in+combination+with+highly+brilliant+radiation+sources+offers+novel+opportunities+for+the+structural+analysis+of+post-translationally+modified+eukaryotic+proteins%5BTitle%5D)+AND+%22Acta+Cryst.+F%22%5BJournal%5D)">In vivo protein crystallization in combination with highly brilliant radiation sources offers novel opportunities for the structural analysis of post-translationally modified eukaryotic proteins.</a> Acta Cryst. F. 71 (8), 929-937 (2015).</li>
<li>Axford, D., Ji, X., Stuart, D. I., Sutton, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+cellulo+structure+determination+of+a+novel+cypovirus+polyhedrin%5BTitle%5D)+AND+%22Acta+Cryst+D%22%5BJournal%5D)">In cellulo structure determination of a novel cypovirus polyhedrin.</a> Acta Cryst D. 70 (5), 1435-1441 (2014).</li>
<li>Sawaya, M. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Protein+crystal+structure+obtained+at+2.9+%C3%85+resolution+from+injecting+bacterial+cells+into+an+X-ray+free-electron+laser+beam%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Protein crystal structure obtained at 2.9 Å resolution from injecting bacterial cells into an X-ray free-electron laser beam.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 111 (35), 12769-12774 (2014).</li>
<li>Tsutsui, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+Diffraction-Quality+Protein+Crystal+Processed+as+an+Autophagic+Cargo%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Cell%22%5BJournal%5D)">A Diffraction-Quality Protein Crystal Processed as an Autophagic Cargo.</a> Mol Cell. 58 (1), 186-193 (2015).</li>
<li>Boudes, M., Garriga, D., Fryga, A., Caradoc-Davies, T., Coulibaly, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+pipeline+for+structure+determination+of+in+vivo-grown+crystals+using+in+cellulo+diffraction%5BTitle%5D)+AND+%22Acta+Cryst+D%22%5BJournal%5D)">A pipeline for structure determination of in vivo-grown crystals using in cellulo diffraction.</a> Acta Cryst D. 72, 576-585 (2016).</li>
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<li>Foadi, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Clustering+procedures+for+the+optimal+selection+of+data+sets+from+multiple+crystals+in+macromolecular+crystallography%5BTitle%5D)+AND+%22Acta+Cryst+D%22%5BJournal%5D)">Clustering procedures for the optimal selection of data sets from multiple crystals in macromolecular crystallography.</a> Acta Cryst D. 69 (8), 1617-1632 (2013).</li>
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<li>Ishchenko, A., Cherezov, V., Liu, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Preparation+and+Delivery+of+Protein+Microcrystals+in+Lipidic+Cubic+Phase+for+Serial+Femtosecond+Crystallography%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Preparation and Delivery of Protein Microcrystals in Lipidic Cubic Phase for Serial Femtosecond Crystallography.</a> J Vis Exp. (115), e54463(2016).</li>
<li>Zander, U., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((MeshAndCollect%3A+an+automated+multi-crystal+data-collection+workflow+for+synchrotron+macromolecular+crystallography+beamlines%5BTitle%5D)+AND+%22Acta+Cryst.+D%22%5BJournal%5D)">MeshAndCollect: an automated multi-crystal data-collection workflow for synchrotron macromolecular crystallography beamlines.</a> Acta Cryst. D. 71, 2328-2343 (2015).</li>
<li>Fan, G. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vivo+calcineurin+crystals+formed+using+the+baculovirus+expression+system%5BTitle%5D)+AND+%22Micros+Res+Tech%22%5BJournal%5D)">In vivo calcineurin crystals formed using the baculovirus expression system.</a> Micros Res Tech. 34 (1), 77-86 (1996).</li>
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</ol>

Gli autori non hanno niente da rivelare.

Questo protocollo fornisce due approcci per analizzare i microcristalli allo scopo di facilitare l&#39;analisi di cristalli molto piccoli che sarebbero stati trascurati in passato. Fasi critiche per la purificazione microcristallina Il protocollo presentato è stato ottimizzato utilizzando il polyhedrin Bombyx mori CPV1 espresso in cellule Sf9 come sistema di modello. Tuttavia, i microcristalli in vivo presentano una grande variabilità nella resistenz...

L&#39;uso della cristallografia a raggi X per la determinazione di strutture ad alta risoluzione di macromolecole biologiche ha registrato una costante progressione negli ultimi due decenni. La crescente assunzione di cristallografia a raggi X da ricercatori non esperti esemplifica la democratizzazione di questo approccio in molti settori della scienza della vita 1 . Storicamente, i cristalli con dimensioni inferiori a ~ 10 μm sono state considerate come impegnative, se non inutilizzabili, per la determinazione della struttura. La crescente disponibilità di microfocus dedicate a fonti di radiazione di sincrotrone in tutto il mondo e progressi tecnologici, come lo sviluppo di strumenti per la manipolazione dei microcristalli, hanno rimosso gran parte di queste barriere che hanno ostacolato l&#39;ampio utilizzo della microcristallografia a raggi X. Avanzamenti nella microcristallografia a raggi X seriali 2 , 3 e diffrazione a micro elettronica 4 haVe ha mostrato che l&#39;uso di micro- e nanocristalli per la determinazione della struttura non è solo possibile ma anche a volte preferibile all&#39;uso di grandi cristalli 5 , 6 , 7 . Questi progressi sono stati applicati per lo studio dei peptidi 8 e dei cristalli naturali prodotti dai virus degli insetti 9 , 10 . Sono ora utilizzati per una vasta gamma di macromolecole biologiche tra cui i sistemi più difficili come le proteine ​​a membrana e grandi complessi 11 . Per facilitare l&#39;analisi di questi microcristalli, sono stati analizzati in meso, proteine di membrana 12 in particolare e in chips microfluidica 13. La disponibilità di queste metodologie microcristallografia nuovi ha sollevato la possibilità di utilizzare inCristallizzazione vivo come un nuovo percorso per la biologia strutturale 14 , 15 , 16 che offre un&#39;alternativa alla cristallogenesi classica in vitro . Purtroppo, anche quando si possono produrre cristalli in vivo , rimangono diversi ostacoli quali la degradazione o la perdita di ligandi durante la depurazione dalle cellule, la difficoltà nella manipolazione e la visualizzazione dei cristalli alla radiazione di sincrotrone e negli esperimenti di diffusione a raggi X. Come cristalli alternativi sono stati analizzati anche direttamente all&#39;interno della cella senza alcuna fase di purificazione 17 , 18 , 19 . Un&#39;analisi comparativa suggerisce che tali approcci cellulari possono essere più efficienti dell&#39;analisi dei cristalli purificati e dei dati di resa di maggiore risoluzione 20 . Questo protocollo è inTendeva ad aiutare i ricercatori alla microcristallografia delle proteine. Fornisce metodologie che si concentrano sulla preparazione e manipolazione del campione per gli esperimenti di diffrazione a raggi X in un beamline di sincrotrone. Si propongono due opzioni utilizzando cristalli isolati per microcristallografia classica o cellule contenenti cristalli ordinate per citometria a flusso per l&#39;analisi cellulare ( Figura 1 ).

<table><tbody><tr><td>Cellule Sf9</td><td>Life Technologies</td><td></td><td></td></tr><tr><td>SF900-SFM medium per insetti</td><td>Life Technologies</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Pallone per colture cellulari da 1 L</td><td>Thermofisher Scientific Incubatore</td><td></td><td></td></tr><tr><td>a scuotimento per colture cellulari di insetti</td><td>Eppendorf</td><td></td><td></td></tr><tr><td>50 mL provette coniche</td><td>Falcon</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Centrifuge con secchi oscillanti per 50 mL tubi</td><td>Eppendorf</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Sonicator dotato di sonda da 19 mm</td><td>MSE Soniprep 150&nbsp;</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Vetrini</td><td>Hampton Research</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Emacitometro</td><td>Sigma-Aldrich</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Ioduro di propidio</td><td>Thermofisher Scientific</td><td></td><td></td></tr><tr><td>BD Selezionatore di cellule di afflusso</td><td>BD Biosciences</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Hampton Schermi per atomi pesanti Le microcentrifughe</td><td>Hampton Research</td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td>Eppendorf</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Micromesh</td><td>Mitigen</td><td></td><td>700/25 offrono una superficie più ampia. Le mesh indicizzate possono essere acquistate per studi sistematici.</td></tr><tr><td>Stoppino di carta</td><td>Mitigen</td><td></td><td>La dimensione dello stoppino di carta può essere variata per un flusso ottimale. Ciò dipenderà in gran parte dalla natura dei cristalli e dal crioprotettore utilizzati.</td></tr><tr><td>Glicole etilenico</td><td>Sigma-Aldrich</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Trypan blue</td><td>Life Technologies</td><td></td><td></td></tr><tr><td>MX2 microfocus beamline</td><td>Australian Synchrotron</td><td></td><td>Un elenco delle linee di luce microfocus disponibili può essere trovato in Boudes et al. (2014) Reflections on the Many Facets of Protein Microcrystallography. Australian Journal of Chemistry 67 (12), 1793... 1806, doi:10.1071/CH14455.</td></tr></tbody></table>

microcristallografia dei cristalli proteici e<em&gt; in cellulo</em&gt; diffrazione

Microcrystallography of Protein Crystals and In Cellulo Diffraction

L&#39;avvento di linee di microfocus di alta qualità in molti impianti di sincrotrone ha consentito l&#39;analisi di routine di cristalli inferiori a 10 μm nella loro dimensione più grande, che rappresentavano una sfida. Presentiamo due flussi di lavoro alternativi per la determinazione della struttura di microcristalli proteici mediante cristallografia a raggi X con particolare attenzione ai cristalli in vivo . I microcristalli vengono estratti dalle cellule per ultrasuoni e purificati mediante centrifugazione differenziale o analizzati in cellulo dopo la selezione delle cellule mediante citometria a flusso di cellule contenenti cristalli. Opzionalmente, cristalli purificati o cellule contenenti cristalli vengono imbevuti in soluzioni di atomi pesanti per la fase di sperimentazione. Questi campioni vengono quindi preparati per esperimenti di diffrazione in modo analogo mediante applicazione su un supporto micromesh e raffreddamento a flash in azoto liquido. Breve descrizione e confronto di esperimenti di diffrazione seriale di microcristalli isolati e di cristallo-Contenenti le cellule utilizzando un beamline di sincrotrino microfocus per produrre set di dati adatti per la fase di fasi, la costruzione di modelli e la raffinatezza. Questi flussi di lavoro sono esemplificati con i cristalli del polyhedrin Bombyx mori cypovirus 1 (BmCPV1) prodotto dall&#39;infezione di cellule insettiche con un baculovirus ricombinante. In questo caso, l&#39;analisi cellulare è più efficace dell&#39;analisi dei cristalli purificati e produce una struttura in ~ 8 giorni dall&#39;espressione al raffinamento.

Viene presentata una panoramica di entrambi i metodi alternativi per la determinazione della struttura utilizzando microcristalli in vivo ( Figura 1 ). La polihedra può essere facilmente purificata mediante sonicazione e centrifugazione. A causa della loro densità, formano uno strato nella parte inferiore del tubo sotto uno strato di detriti che possono essere rimossi pipettando ( Figura 3a e 3b ). Il c...

Viene presentato un protocollo per la cristallografia a raggi X utilizzando microcristalli di proteine. Sono stati confrontati due esempi che analizzano microcristalli in vivo dopo la purificazione o in cellulo .

Microcristallografia dei cristalli proteici e<em&gt; In Cellulo</em&gt; Diffrazione

The advent of high-quality microfocus beamlines at many synchrotron facilities has permitted the routine analysis of crystals smaller than 10 &#181;m in ...

L'obiettivo generale di questo protocollo è presentare le metodologie della cristallografia a raggi X applicate ai microcristalli, in particolare a quelli prodotti all'interno di cellule, considerati cristalli in vivo. Il principale vantaggio di questo approccio è che fornisce un processo semplice ed efficiente per produrre, rilevare e analizzare microcristalli. Questo metodo mira a facilitare l'uso dei microcristalli impiegando cristalli sviluppati all'interno di cellule vive, eliminando la necessità di complessi processi di purificazione e di prove con sedazione da Aprocox.In questo video ci concentreremo sulla preparazione e manipolazione semplice per esperimenti di deflessione a raggi X presso una linea di fascio di sincrotrone. Mostreremo i passaggi che differiscono maggiormente dalla cristallografia classica. In questa dimostrazione utilizzeremo cristalli della proteina del poliedro vitale coltivati con successo, ma il metodo può essere applicato anche a proteine che formano cristalli in qualsiasi tipo di cellula batterica, insetto, mammifera o lievito.Per prima cosa, incubare 30 millilitri di cellule Sf9 che sovraesprimono la proteina poliedrica del cypovirus per tre giorni

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Valutazione bidimensionale (2D) prove di cristallizzazione per la formazione degli array ordered proteine ​​di membrana è un compito molto critico e difficile in cristallografia elettroni. Qui si descrive il nostro approccio nello screening per l'individuazione e cristalli 2D di proteine ​​di membrana prevalentemente piccole nel range di 15 - 90kDa.

Valutazione bidimensionale Prove di cristallizzazione delle proteine ​​di membrana per piccoli studi di biologia strutturale di Cristallografia Electron

Questo articolo descrive la metodologia di microscopia crioelettronica, che viene utilizzata per ottenere immagini microscopiche di alta qualità di macromolecole nel loro stato quasi nativo. Il metodo produce immagini adatte per un'ulteriore elaborazione computerizzata utilizzando l'approccio della singola particella, ideato per generare la ricostruzione 3D di una macromolecola.

Cosa fare e cosa non fare di Cryo-microscopia elettronica: A Primer su preparazione del campione e raccolta dati di alta qualità per la ricostruzione macromolecolare 3D

Questo protocollo descrive dettagliatamente come fabbricare e gestire dispositivi microfluidici per la raccolta di dati di diffrazione di raggi x a temperatura ambiente. Inoltre, viene descritto come monitorare la cristallizzazione della proteina di dispersione della luce dinamica e come elaborare e analizzare dati di diffrazione ottenuti.

Chip microfluidici per dispersione della luce dinamica In Situ diffrazione di raggi x di cristallo ed In Situ per la cristallografia seriale

Questo documento descrive in dettaglio il protocollo di fabbricazione dei chip microfluidici sviluppati per la cristallizzazione delle proteine su chip con il metodo della dialisi e gli esperimenti di diffrazione a raggi X in situ. Il processo di microfabbricazione consente di integrare una membrana semipermeabile di dialisi della cellulosa rigenerata con qualsiasi taglio di peso molecolare, tra due strati del chip.

Cristallizzazione delle proteine su chip mediante microdialisi per studi di diffrazione a raggi X in situ

Qui, descriviamo le procedure sviluppate nel nostro laboratorio per la preparazione di polveri di cristalli di piccole molecole per esperimenti di diffrazione elettronica microcristallina (MicroED).

Diffrazione elettronica microcristallina di piccole molecole

La determinazione della struttura dei complessi macromolecolari utilizzando il crioEM è diventata di routine per alcune classi di proteine e complessi. Qui, questa pipeline è riassunta (preparazione del campione, screening, acquisizione ed elaborazione dei dati) e i lettori sono indirizzati verso ulteriori risorse dettagliate e variabili che possono essere modificate nel caso di campioni più impegnativi.

Microscopia crioelettronica a particella singola: dal campione alla struttura

I monostrati lipidici sono stati utilizzati come base per la formazione di cristalli proteici bidimensionali (2D) per studi strutturali per decenni. Sono stabili all'interfaccia aria-acqua e possono fungere da materiale di supporto sottile per l'imaging elettronico. Qui presentiamo i passaggi comprovati sulla preparazione di monostrati lipidici per studi biologici.

Preparazione del campione utilizzando un metodo monostrato lipidico per studi cristallografici elettronici

Questo contributo descrive come impostare la cristallizzazione delle proteine su dispositivi cristallo su cristallo e come eseguire la raccolta automatica di dati seriali a temperatura ambiente utilizzando la piattaforma di cristallizzazione su chip.

Cristallizzazione su chip e diffrazione seriale su larga scala a temperatura ambiente

Le mappe crio-EM ad alta risoluzione delle macromolecole possono essere ottenute anche utilizzando microscopi TEM da 200 kV. Questo protocollo mostra le best practice per l'impostazione di allineamenti ottici accurati, schemi di acquisizione dati e selezione di aree di imaging che sono tutti essenziali per la raccolta di set di dati ad alta risoluzione utilizzando un TEM da 200 kV.

Raccolta di routine di set di dati crio-EM ad alta risoluzione utilizzando un microscopio elettronico a trasmissione da 200 KV

Il protocollo presentato descrive un approccio semplice per lo screening delle condizioni di cristallizzazione delle proteine e la crescita dei cristalli utilizzando una piastra di dialisi ad alto rendimento a 96 pozzetti. L'uso di tubi dializzatori per la crescita su larga scala di microcristalli è dimostrato anche per la cristallografia seriale e le applicazioni MicroED.

Cristallizzazione delle proteine ad alto rendimento tramite microdialisi

Impara la cristallografia a raggi X applicata ai microcristalli proteici prodotti in vivo nelle cellule viventi. Questo metodo semplifica la produzione e l'analisi, eliminando complessi processi di purificazione per gli studi strutturali.

Microcristallografia dei cristalli proteici e

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