Microcristallografia dei cristalli proteici e In Cellulo Diffrazione

L'obiettivo generale di questo protocollo è quello di introdurre le metodologie di cristallografia a raggi X applicate ai microcristalli e in particolare a quelli prodotti in cellule che sono considerate cristalli in vivo. Il vantaggio principale di questo approccio è che fornisce un processo semplice ed efficiente per produrre, rilevare e analizzare i microcristalli. Questo metodo mira a facilitare l'uso di microcristalli utilizzando cristalli cresciuti all'interno di cellule viventi, eliminando la necessità di complessi processi di purificazione e prove di sedazione con Aprocox.

In questo video ci concentreremo sulla semplice preparazione e manipolazione per esperimenti di deflessione dei raggi X su una linea di luce di sincrotrone. Mostriamo i passaggi che si differenziano maggiormente dalla cristallografia classica. In questa dimostrazione utilizzeremo cristalli della proteina poliedrica vitale cresciuta con successo, ma il metodo può essere applicato anche alle proteine che formano cristalli in qualsiasi cellula batterica, di insetto, di mammifero o di lievito.

In primo luogo, incubare 30 millilitri di cellule Sf9 che esprimono la proteina poliedrica del cypovirus per tre giorni a 27 gradi Celsius su una piattaforma rotante. Trasferire 500 microlitri di coltura cellulare Sf9 in una provetta da microcentrifuga utilizzando una pipetta sierologica sterile, avendo cura di garantire che la sterilità della coltura principale sia mantenuta utilizzando una cappa di sicurezza biologica di classe II e seguendo tecniche asettiche standard. Pipettare cinque microlitri di cellule dalla provetta della microcentrifuga su un vetrino.

Quindi, inclinare delicatamente un vetrino di copertura sul campione con un bordo a contatto con la goccia e abbassare con cautela il vetrino coprioggetti sul liquido, evitando la formazione di bolle d'aria. Quindi, visualizza il vetrino con un microscopio invertito. Esamina attentamente le celle, iniziando con un ingrandimento di 200x e ingrandendo al massimo ingrandimento quando rilevi un potenziale cristallo.

Cerca spigoli vivi e cambiamenti nella rifrazione. Se vengono identificati cristalli, esaminare quotidianamente la coltura per monitorare la crescita dei cristalli ripetendo i passaggi precedenti. Per le cellule Sf9, raccogliere trasferendo la coltura in una provetta da centrifuga.

Metti il tubo sul ghiaccio e procedi al passaggio successivo il prima possibile. Per l'isolamento di cellule contenenti cristalli, pipettare quattro millilitri di cellule Sf9 infette in una provetta adatta all'analisi in citometria a flusso. Preparare una seconda provetta con un numero equivalente di cellule Sf9 da una coltura infetta simulata come controllo.

Quindi, aggiungere ioduro di propidio a entrambi i campioni fino a una concentrazione finale di un microgrammo per millilitro, appena prima della valutazione citofluorimetrica. A questo punto, è possibile applicare le cellule del campione di controllo a un citometro a flusso standard in grado di selezionare le cellule secondo FSC e SSC. Analizza almeno 20.000 eventi.

Dopo aver scartato le cellule morte, i grumi cellulari e i detriti dall'analisi, generare il grafico da FSC a SSC. Successivamente, analizzare almeno 20.000 eventi del campione contenente cristalli. Confronta il grafico FSC con SSC con il controllo e cerca l'aspetto di una popolazione distinta corrispondente a cellule contenenti cristalli.

Definire i cancelli attorno alla popolazione cellulare contenente cristalli, che di solito appaiono a SSC o FSC più alti. Utilizzando questo gating, selezionare da 150.000 a 200.000 cellule contenenti cristalli in una provetta per microcentrifuga da 1,5 millilitri preriempita con 50 microlitri di tampone PBS. Visualizzare i campioni ordinati mediante microscopia ottica come descritto in precedenza per confermare quale popolazione è associata alle cellule contenenti cristalli.

In questa fase le cellule possono essere incubate con soluzioni di atomi pesanti se è necessaria la fase sperimentale. Questo approccio segue lo screening di vari composti e i tempi di incubazione come descritto nel testo e in altre recensioni. Impostare gli strumenti per il montaggio del campione fissando prima una micro rete montata su un perno all'estremità di una bacchetta magnetica.

Posizionare la bacchetta lateralmente nella fessura di una boa galleggiante per dialisi. Quindi, prendi uno stoppino di carta con un paio di pinzette e bloccali. Ricontrolla che la configurazione sia completa prima di procedere.

Ora, mescolare le cellule con un volume uguale di soluzione di blu di tripano allo 0,4% fino a una concentrazione finale dello 0,2%Dopo aver risospeso le cellule, pipettare 0,5 microlitri delle cellule selezionate sulla micro rete. Dopo aver lasciato depositare le cellule sulla superficie della micro rete, rimuovere la maggior parte del liquido in eccesso tamponando con uno stoppino di carta. Se la micro mesh non è sufficientemente tamponata, le cellule si troveranno a diverse profondità all'interno del liquido in eccesso, il che complicherà il loro allineamento al fascio di raggi X al sincrotrone.

Inoltre, il liquido in eccesso aumenterà la diffusione dei raggi X di fondo. Se la micro rete viene tamponata in eccesso, il liquido verrà completamente rimosso e il campione non verrà trattenuto nelle aperture della griglia. Con un blotting ottimale, sulla microrete rimane solo un sottile strato di liquido, proteggendo il campione e costringendolo nelle aperture della griglia.

Alcuni cristalli richiedono l'uso di un crioprotettore. Questo non è richiesto nel nostro caso, ma la procedura sarebbe la stessa dell'applicazione del campione e poi del blotting. Assicurarsi che rimanga solo un sottile strato di liquido.

Raffreddare immediatamente la micro mesh in azoto liquido e trasferirla su un disco robotico per il trasporto su una linea di luce microfocus di sincrotrone. A causa delle piccole dimensioni dei cristalli in vivo, raccogliere i dati di frazione su una linea di luce per cristallografia microfocus. Per prima cosa, monta la micro mesh sul goniometro.

Ora, inizia centrando la micro mesh con il percorso del raggio utilizzando gli orientamenti faccia e lato. Con la micro mesh frontale, regolare l'allineamento allineando il centro di una delle corsie orizzontali della micro mesh. Raccogli i dati lungo questa corsia orizzontale con solo piccole modifiche all'allineamento.

Una volta testati tutti i cristalli della corsia, passare alla corsia successiva e ripetere la procedura di allineamento. Assicurati che le corsie che sono state lavorate siano chiaramente identificate in modo che i cristalli non vengano persi o sparati due volte utilizzando il cambio di colore blu del tripano come guida. Viene presentata una panoramica di due metodi per la determinazione della struttura utilizzando microcristalli in vivo.

La riga superiore descrive l'approccio classico che prevede la purificazione dei cristalli dalle cellule, mentre la riga inferiore mostra l'approccio della cristallografia in cellulo che mantiene i cristalli nelle cellule ospiti per la raccolta dei dati. Per l'approccio in cellulo, il profilo di citometria a flusso di cellule non infette viene confrontato con un profilo di cellule contenenti cristalli e utilizzato per determinare quale popolazione cellulare deve essere selezionata per separare le cellule contenenti cristalli dalle altre cellule. In questo esempio, le cellule contenenti poliedri hanno una dispersione laterale più elevata rispetto alle cellule non infette.

Le cellule colorate con blu di tripano possono essere facilmente visualizzate utilizzando le telecamere disponibili nella maggior parte delle linee di luce di sincrotrone. Mentre i cristalli purificati sono laboriosi da identificare e allineare con il fascio di raggi X a causa delle loro piccole dimensioni, quando si raccolgono i dati è meglio procedere in uno schema a griglia per ridurre al minimo le procedure di centratura ed evitare di esporre due volte la stessa cella o cristallo o di perdere celle e cristalli. Una volta padroneggiato, questo flusso richiede circa mezza giornata dalla raccolta delle cellule contenenti cristalli alla raccolta dei dati.

Questa procedura è compatibile con i soak di atomi pesanti per la fasatura sperimentale. Nel caso del poliedro, la struttura normale è stata ottenuta in otto giorni dall'inizio dell'espressione proteica. Non dimenticare che lavorare con l'azoto liquido può essere estremamente pericoloso e che è necessario prendere precauzioni contro il soffocamento e le ustioni.