Precondizionamento ipossico delle cellule progenitori derivate dal midollo osseo come fonte per la generazione di cellule Schwann mature

L'obiettivo generale di questa tecnica di coltura cellulare è quello di arricchire i progenitori neurali del midollo osseo per facilitare la loro differenziazione in cellule di Schwann funzionali. Questo metodo affronta un problema chiave nelle cellule staminali e nella medicina rigenerativa: come utilizzare una fonte limitata di neuroprogenitori per generare glia per assistere nella ricrescita assonale post-traumatica e nella rimielinizzazione. Un vantaggio di questa tecnica è l'uso di un efficiente condizionamento della coltura per facilitare l'espansione delle cellule neurali dalle cellule stromali del midollo osseo per il loro utilizzo nella terapia cellulare autologa.

Dopo due giorni di coltura, rimuovere il 75% del terreno esaurito e le cellule non aderenti e sciacquare le cellule aderenti con tre lavaggi PBS da 10 millimetri. Dopo il terzo lavaggio, sostituire il PBS con 10 millilitri di cellule stomali del midollo, o MSC, terreno di crescita e rimettere la coltura nell'incubatore. Le colonie visibili dovrebbero apparire entro il sesto o il settimo giorno.

Il giorno 10, lavare la coltura in PBS fresco e staccare le cellule con 1,5 millilitri di reagente di dissociazione cellulare enzimatica ricombinante. Dopo cinque minuti a 37 gradi Celsius, aggiungere tre millilitri di terreno di crescita MSC per neutralizzare la reazione e raccogliere le cellule staccate mediante centrifugazione. Risospendere il pellet in cinque millilitri di terreno di coltura MSC fresco e seminare le cellule a una densità di quattro volte 10 per quarto centimetro quadrato in una nuova piastra di coltura tissutale da 10 centimetri.

Le cellule dovrebbero raggiungere l'80-90% di confluenza entro due giorni dal passaggio. Per il precondizionamento ipossico, rilasciare prima l'anello clamp e pulire le parti esposte con etanolo al 70%. Inoltre, smontare la camera di ipossia in componenti e posizionarli in una cappa a flusso laminare per la sterilizzazione sotto luce UV per 15 minuti.

Successivamente, lavare una coltura di MSC confluente all'80-90% con 10 millilitri di PBS, come appena dimostrato, e trattare le colture con terreno di crescita MSC fresco integrato con 25 millimolari di hepes. Posizionare la coltura trattata nella camera di ipossia riassemblata e serrare il morsetto ad anello. Sigillare le estremità di collegamento della camera per garantire che non vi siano perdite di gas e lavare una miscela di gas di azoto al 99% e ossigeno all'1% nella camera a una portata di 10 litri al minuto.

Dopo cinque minuti, posizionare la camera nell'incubatore per colture cellulari per 16 ore. La mattina successiva, staccare le cellule come appena dimostrato e raccoglierle mediante centrifugazione. Risospendere il pellet nel terreno progenitore neurale e seminare sei volte 10 al terzo di cellule per centimetro quadrato su piastre a 6 pozzetti a basso attacco per la loro coltura a 37 gradi Celsius e 5% di CO2 per 12 giorni.

Sfere di cellule considerevoli non aderenti dovrebbero essere osservate entro il sesto o il settimo giorno. Con più neurosfere evidenti nelle colture condizionate dall'ipossia rispetto a quelle sotto normossia dai giorni 10 a 12. Il giorno 12, utilizzare una pipetta da 10 millilitri per trasferire le neurosfere in una provetta conica da 15 millilitri e raccogliere le neurosfere mediante centrifugazione.

Risospendere le sfere in DMEM/F12 e piastrettare da cinque a 10 neurosfere per centimetro quadrato su piastre rivestite di poli-D-lisina laminina a 6 pozzetti in 1,5 millilitri di terreno di induzione gliale per pozzetto. Mantenere la coltura cellulare a sfera per almeno sette giorni, rinfrescando il terreno ogni tre giorni. Per raccogliere i gangli della radice dorsale, trasferire il primo embrione in una piastra di coltura di 10 centimetri contenente PBS a temperatura ambiente sotto un microscopio da dissezione in posizione prona e inserire una pinza da micro dissezione lungo entrambi i lati del midollo spinale.

Usando la dissezione smussata, separare il midollo spinale dai tessuti molli circostanti usando una pinza per asportare il midollo spinale lungo l'apertura del collo e il troncone della coda. Rimuovere il tessuto molle residuo dal midollo spinale liberato fino a quando rimangono solo il midollo spinale, le radici nervose e il ganglio della radice dorsale attaccato. Staccare i singoli gangli della radice dorsale dalle loro radici nervose di collegamento.

Quindi, utilizzare una pipetta a penna dotata di una punta da un millilitro per trasferire fino a 100 gangli radicolari dorsali in una provetta da microcentrifuga da 1,5 millilitri di PBS. Raccogliere i gangli mediante centrifugazione e risospendere i pellet in 200 microlitri di reagente di dissociazione cellulare enzimatica ricombinante per provetta. Dopo 10 minuti a 37 gradi Celsius, centrifugare nuovamente i gangli della radice dorsale utilizzando una punta di pipetta da 200 microlitri per triturare delicatamente i pellet nel terreno di mantenimento dei neuroni del ganglio della radice dorsale.

Seminare le cellule gangliari della radice dorsale a cinque volte 10 al terzo cellulare per centimetro quadrato su piastre a 6 pozzetti rivestite di poli-D-lisina laminina in 1,5 millilitri di terreno di mantenimento dei neuroni del ganglio della radice dorsale per pozzetto. Dopo due giorni di coltura a 37 gradi Celsius e 5% di CO2, lavare le cellule e rimettere le colture cellulari neuronali nell'incubatore in un terreno di purificazione fresco dei neuroni del ganglio della radice dorsale per altri due giorni. Dopo tre o quattro cicli di mantenimento e purificazione, le colture cellulari del ganglio della radice dorsale dovrebbero risultare positive per il marcatore neuronale Tuj-1 e negative per il marcatore delle cellule gliali S100 beta.

Il settimo giorno della coltura cellulare simile a cellule di Schwann, sciacquare le cellule in PBS seguito da dissociazione con 0,5 millilitri di reagente di dissociazione cellulare enzimatica ricombinante per pozzetto a 37 gradi Celsius per cinque minuti. Risospendere il pellet cellulare in terreno di co-coltura e seminare le cellule simili a cellule di Schwann sulla coltura purificata di neuroni gangliari della radice dorsale in una volta per 10 cellule per centimetro quadrato per 14 giorni di co-coltura a 37 gradi Celsius e 5% di CO2. Le MSC sane mostrano una morfologia affusolata in contrasto con l'aspetto quadrangolare delle MSC che sono state mantenute per un numero elevato di passaggi e hanno perso la loro multipotenza.

Le colonie espanse di MSC dovrebbero dimostrare l'espressione di marcatori MSC, l'assenza di marcatori di cellule staminali ematopoietiche e la capacità di differenziazione in linee adipogeniche, osteogeniche e condrogeniche. Le colture sane di MSC che sono state sottoposte a precondizionamento ipossico, dimostrano neurosfere più grandi sia in numero che in dimensioni. La purezza della rete neuronale gangliare della radice dorsale può essere confermata dall'espressione del marcatore neuronale Tuj-1 e dalla concomitante assenza del marcatore cellulare di Schwann S100.

Dopo 14 giorni di co-coltura con i neuroni gangliari della radice dorsale, le cellule simili a cellule di Schwann acquisiscono le caratteristiche e le proprietà funzionali delle cellule di Schwann mature impegnate nel destino. Una volta padroneggiata, la sottopopolazione progenitrice neurale può essere espansa in BMSC umane o di ratto in 10 giorni se la tecnica di espansione cellulare viene eseguita correttamente. Durante il tentativo di questa procedura, è importante ricordare di confermare che il campione di BMSC è dotato di neuroprogenitori nestina-positivi e che i progenitori ematopoietici CD45 positivi sono stati tutti rimossi.

Dopo aver visto questo video, dovresti avere una buona comprensione di come reperire le BMSC, arricchirle per la sottopopolazione progenitrice neurale e dirigere la differenziazione dei progenitori neurali in cellule di Schwann impegnate nel destino per l'uso nel migliorare la ricrescita assonale post-traumatica e la rimielinizzazione. Seguendo questa procedura, le glia mielinizzanti, come le cellule di Schwann mature, possono essere derivate per il loro utilizzo nello sviluppo di terapie per lesioni demielinizzanti e malattie del sistema nervoso periferico e centrale.