Precondizionamento ipossico delle cellule progenitori derivate dal midollo osseo come fonte per la generazione di cellule Schwann mature

L'obiettivo generale di questa tecnica di coltura cellulare è arricchire i progenitori neurali del midollo osseo per facilitarne la differenziazione in cellule di Schwann funzionali. Questo metodo affronta un problema fondamentale nella medicina rigenerativa e nelle cellule staminali: come utilizzare una fonte limitata di neuroprogenitori per generare cellule gliali che assistano nella rigenerazione assonale post-traumatica e nella rimielinizzazione. Un vantaggio di questa tecnica è l'uso di un condizionamento della coltura efficiente per favorire l'espansione delle cellule neurali a partire da cellule stromali del midollo osseo, al fine del loro impiego in terapie cellulari autologhe.

Dopo due giorni di coltura, rimuovere il 75% del mezzo usato e le cellule non aderenti e lavare le cellule aderenti con tre risciacqui di PBS da 10 millimetri. Dopo il terzo risciacquo, sostituire il PBS con 10 millilitri di mezzo di crescita per cellule stromali del midollo, o MSC, e reinserire la coltura nell'incubatore. Colonie visibili dovrebbero apparire entro il sesto-settimo giorno.

Al giorno 10, lavare la coltura in PBS fresco e staccare le cellule con 1,5 millilitri di reagente enzimatico ricombinante per la dissociazione cellulare. Dopo cinque minuti a 37 gradi Celsius, aggiungere tre millilitri di mezzo di crescita per MSC per neutralizzare la reazione e raccogliere le cellule staccate mediante centrifugazione. Risospendere il pellet in cinque millilitri di mezzo di crescita per MSC fresco e seminare le cellule a una densità di quattro volte 10 alla quarta cellule per centimetro quadrato in una nuova piastra per colture cellulari da 10 centimetri.

Le cellule dovrebbero raggiungere una confluenza dell'80-90% entro due giorni dal passaggio. Per il precondizionamento ipossico, rimuovere prima la pinza ad anello e pulire le parti esposte con etanolo al 70%. Smontare ulteriormente la camera da ipossia in componenti e posizionarli all'interno di una cappa a flusso laminare per la sterilizzazione sotto luce UV per 15 minuti.

Successivamente, lavare una coltura di MSC al 80-90% di confluenza con 10 millilitri di PBS come appena dimostrato e trattare le colture con mezzo di crescita per MSC fresco integrato con 25 millimoli di hepes. Posizionare la coltura trattata nella camera per ipossia rimontata e serrare la fascetta a anello. Sigillare le estremità di collegamento della camera per assicurarsi che non vi siano perdite di gas e far fluire nella camera una miscela gassosa composta da 99% di azoto e 1% di ossigeno a una portata di 10 litri al minuto.

Dopo cinque minuti, posizionare la camera nell'incubatrice per colture cellulari per 16 ore. La mattina seguente, staccare le cellule come appena dimostrato e raccoglierle mediante centrifugazione. Risospendere il pellet nel mezzo per progenitori neurali e seminare sei volte 10 alla terza cellule per centimetro quadrato in piastre a 6 pozzetti con superficie non aderente per la loro coltura a 37 gradi Celsius e 5%CO2 per 12 giorni.

Già dal sesto al settimo giorno dovrebbero essere osservate ampie sfere cellulari non aderenti. Un numero maggiore di neurosfere sarà evidente nelle colture condizionate in ipossia rispetto a quelle in normossia tra il decimo e il dodicesimo giorno. Al dodicesimo giorno, utilizzare una pipetta da 10 millilitri per trasferire le neurosfere in un tubo conico da 15 millilitri e raccogliere le neurosfere mediante centrifugazione.

Risospendere le sferoidi in DMEM/F12 e seminare da cinque a dieci neurosfere per centimetro quadrato su piastre da 6 pozzetti rivestite con poli-D-lisina e laminina, aggiungendo 1,5 millilitri di mezzo di induzione gliale per pozzetto. Mantenere la coltura cellulare delle sferoidi per almeno sette giorni, rinnovando il mezzo ogni tre giorni. Per raccogliere i gangli delle radici dorsali, trasferire il primo embrione in una piastra da coltura da 10 centimetri contenente PBS a temperatura ambiente, posizionandolo in posizione prona sotto un microscopio stereoscopico e inserire pinzette da dissezione microscopica lungo entrambi i lati del midollo spinale.

Mediante dissezione ottusa, separare il midollo spinale dai tessuti molli circostanti utilizzando pinzette per escindere il midollo spinale lungo l'apertura del collo e il moncone della coda. Rimuovere il tessuto molle residuo dal midollo spinale liberato finché rimangono soltanto il midollo spinale, le radici nervose e il ganglio della radice dorsale ad esso attaccato. Staccare i singoli gangli delle radici dorsali dalle rispettive radici nervose a cui sono collegati.

Quindi, utilizzare una pipetta manuale dotata di una punta da un millilitro per trasferire fino a 100 gangli delle radici dorsali in una provetta microcentrifuga da 1,5 millilitri contenente PBS. Raccogliere i gangli mediante centrifugazione e risospendere i pellet in 200 microlitri di reagente enzimatico ricombinante per la dissociazione cellulare per provetta. Dopo 10 minuti a 37 gradi Celsius, centrifugare nuovamente i gangli delle radici dorsali utilizzando una punta da 200 microlitri per triturare delicatamente i pellet nel mezzo di mantenimento per neuroni del ganglio della radice dorsale.

Sezionare le cellule dei gangli delle radici dorsali a una densità di cinque volte 10 alla terza cellule per centimetro quadrato su piastre da 6 pozzetti rivestite con poli-D-lisina e laminina, utilizzando 1,5 millilitri di mezzo di mantenimento per neuroni dei gangli delle radici dorsali per ogni pozzetto. Dopo due giorni di coltura a 37 gradi Celsius e 5% CO₂, lavare le cellule e reinserire le colture neuronali nell'incubatrice con mezzo fresco di purificazione per neuroni dei gangli delle radici dorsali per altri due giorni. Dopo tre o quattro cicli di mantenimento e purificazione, le colture cellulari dei gangli delle radici dorsali dovrebbero risultare positive per il marcatore neuronale Tuj-1 e negative per il marcatore delle cellule gliali S100 beta.

Al settimo giorno della coltura di cellule simili a cellule di Schwann, risciacquare le cellule con PBS seguito dalla dissociazione con 0,5 millilitri di reagente enzimatico ricombinante per la dissociazione cellulare per pozzetto a 37 gradi Celsius per cinque minuti. Sospendere il pellet cellulare nel mezzo di co-coltura e seminare le cellule simili a cellule di Schwann sulla coltura purificata di neuroni del ganglio della radice dorsale a una densità di 1 × 10³ cellule per centimetro quadrato per 14 giorni di co-coltura a 37 gradi Celsius e 5% CO₂. Le MSC sane mostrano una morfologia affusolata, in contrasto con l'aspetto quadrangolare delle MSC mantenute per un elevato numero di passaggi e che hanno perso la loro multipotenza.

Le colonie di MSC espanse dovrebbero dimostrare l'espressione dei marcatori dei MSC, l'assenza di marcatori delle cellule staminali ematopoietiche e la capacità di differenziarsi in linee adipogeniche, osteogeniche e condrogeniche. Colture sane di MSC sottoposte a condizionamento ipossico mostrano neurosfere più numerose e di dimensioni maggiori. La purezza della rete neuronale del ganglio della radice dorsale può essere confermata dall'espressione del marcatore neuronale Tuj-1 e dalla contemporanea assenza del marcatore delle cellule di Schwann S100.

Dopo 14 giorni di co-coltura con neuroni del ganglio della radice dorsale, le cellule di tipo Schwann acquisiscono le caratteristiche e le proprietà funzionali di cellule di Schwann mature e già differenziate. Una volta acquisita, la sottopopolazione di progenitori neurali può essere espansa in BMSC umani o di ratto in 10 giorni, a condizione che la tecnica di espansione cellulare venga eseguita correttamente. Durante il tentativo di questa procedura, è importante ricordare di verificare che il campione di BMSC possieda progenitori neurogenici positivi per la nestina e che tutti i progenitori ematopoietici positivi per CD45 siano stati rimossi.

Dopo aver visionato questo video, si dovrebbe avere una buona comprensione di come ottenere le cellule staminali mesenchimali del midollo osseo (BMSCs), arricchire la sottopopolazione di progenitori neurali e indirizzare la differenziazione dei progenitori neurali verso cellule di Schwann compromesse nel destino, da utilizzare per potenziare la rigenerazione assonale post-traumatica e la rimielinizzazione. Seguendo questa procedura, è possibile ottenere glia mielinizzanti, come le cellule di Schwann mature, da impiegare nello sviluppo di terapie per lesioni e malattie demielinizzanti del sistema nervoso periferico e centrale.