Name: Hypoxische preconditioning van merg-afgeleide progenitorcellen als bron voor de generatie van volwassen Schwann-cellen (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-06-14T13:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 16 s
Description: Leer hoe beenmergstroma cellen met hypoxische preconditioning te verrijken voor differentiatie naar volwassen Schwann-cellen. Deze methode ondersteunt autologe celtherapie bij zenuwherstel.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

De auteurs zouden graag Dr. Nai-Sum Wong willen erkennen voor het leveren van de hypoxie kamerapparatuur en mevrouw Alice Lui voor de technische ondersteuning.

Alle procedures met betrekking tot dieren werden uitgevoerd in strikte overeenstemming met de NIH Guide for Care and Use of Laboratory Animals en goedgekeurd door het Comité voor het gebruik van levende dieren voor onderwijs en onderzoek, Li Ka Shing Faculteit Geneeskunde, Universiteit van Hong Kong. Menselijke beenmergmonsters werden verkregen uit de iliac crest van gezonde donors na het verkrijgen van geïnformeerde toestemming. Protocollen werden goedgekeurd door de Institutional Review Board, De Universiteit van Hong Kong. 1. Bereiding van Rat MSC Cultures <ol><li> Oogst van MSC&#39;s van de femur <ol><li> Autoclaaf alle dissectie gereedschappen ( dwz fijne dissecteren van een schaar, stompe snijschaar en tandklemmen) bij minstens 180 ° C voor gebruik voorafgaand aan gebruik. </li><li> MSC groeimedium voorbereiden dat bestaat uit minimaal essentieel medium-alfa-modificatie (αMEM) aangevuld met 15% foetaal boviene serum (FBS) en penicilline / streptomycine (P / S, 1% v / v). </li><li> Offer jonge mannelijke Sprague Dawley ratten (200-250 g lichaamsgewicht) door pentobarbiton overdosis (240 mg / kg lichaamsgewicht, intraperitoneale). OPMERKING: Marrowmonsters van verschillende ratten moeten afzonderlijk worden verwerkt. </li><li> Plaats de opgeofferde dieren in de rugstand. Reinig hun buik en de onderste ledematen grondig met 70% ethanol. </li><li> Verwijder de huid en het subcutane weefsel over de mediale dijen met behulp van fijne dissecterende scharen en pincetjes. Verwijder de dijspieren periferisch totdat de femur wordt blootgesteld. Ga dit proximaal en distaal door tot de knie- en heupgewrichten worden gezien. Ontwricht de femur door de heup en kniegewricht door middel van stompe snijscharen. OPMERKING: Doe de femur niet om de murgholte op dit stadium bloot te leggen. Verplaats intacte femur naar een weefselkweekkap van laminair stroming voor verdere verwerking. </li><li> Gebruik stompe snijscharen om de distale en proximale uiteinden van de femur door middel van de metafyse te transverseren. </li><li> Plaats een 70 μm celzeef over een 50 ml conische buis. Voeg een 21 G, 10 ml injectiespuit met fosfaatgebufferde zoutoplossing (PBS, 10 mM Na 2 HPO 4 , pH 7,4) in de blootgestelde female kanaal en spoel het merggehalte in de conische buis door herhaaldelijk spoelen. OPMERKING: Ongeveer 20 ml PBS wordt gebruikt om elke femur te spoelen. Als de kleur van de gespoelde inhoud bloedbevlekte en troebel blijft, kan een groter volume worden gebruikt. </li><li> Verzamel de cellen door centrifugeren bij 480 xg gedurende 5 minuten. Gooi de supernatant weg. Resuspendeer de celpellet in 10 ml MSC groeimedium. Plaat de cellen op een weefselkweekschotel van 10 cm. Plaats de weefselkweekschotels in een cel incubator (37 ° C, 5% CO 2 ). Noteer de eerste dag van plating als dag 0. OPMERKING: In alle stappen die centrifugeren, zet de rem voor maximale vertraging. </li></ol></li><li> Oprichting en uitbreiding van MSC-kolonies OPMERKING: dit protocol rHet gaat hierbij om plastic adhesie van weefselkweek als middel om te kiezen voor MSC&#39;s van binnen de mergholte 11 . Het beenmerggehalte mag gedurende 2 dagen aan het weefselkweekplastic kleven. <ol><li> Op dag 2, spoel de kweekplaten drie keer met 10 ml PBS af om niet-hechtende cellen te verwijderen. Vervang PBS met 10 ml MSC groeimedium na het spoelen. Was de cellen met PBS en vul elke 3 dagen met MSC groeimedium aan. OPMERKING: MSC kolonies moeten zichtbaar zijn op dag 6-7 ( figuur 2A ). </li><li> Passeer de cellen op dag 10 door het groeimedium te verwijderen en de cellen te spoelen met PBS. Voeg 1,5 ml recombinante enzymatische celdissociatie-reagens toe en incubeer bij 37 ° C gedurende 5 minuten. Voeg 3 ml MSC groeimedium toe om de reactie te neutraliseren. Verzamel de losstaande cellen door centrifugeren bij 250 xg gedurende 5 minuten. </li><li> Kwantificeer de cellen in de pellet met behulp van een hemocytometer na een geschikte verdunning in PBS. </li><li> Zaad doorgegeven cellen bij een dichtheid van 40.000 cellen / cm2 in een cultuurplaat van 10 cm in MSC groeimedium. OPMERKING: Rat MSCs moeten 80-90% samenvloeiing bereiken binnen 2 dagen na het doorvoeren ( Figuur 2B ). Cellen kunnen passeren zoals beschreven in stap 1.2.2 voor maximaal 8 passages. MSC&#39;s kunnen worden gekenmerkt door immunocytochemie en hun capaciteit voor trilineage differentiatie ( Figuur 3 ) 12 . Alleen MSC culturen tussen passages 3 en 8 zijn onderworpen aan latere hypoxische preconditioning en neurale voorloper verrijking. MSC&#39;s met een groter doorgangsnummer nemen een afgeplatte morfologie aan ( Figuur 2C ) en produceren niet voldoende aantallen neurale voorvaders. Deze culturen moeten worden weggegooid. </li></ol></li></ol> 2. Bereiding van humane BMSC-culturen <ol><li> Verdun 1 ml menselijk beenmerg aspiraat met 9 ml MSC groeimedium en plaat deCellen op een 10 cm weefselkweekschotel. Onderhou de culturen in een cel incubator (37 ° C, 5% CO2). </li><li> Verwijder het medium na 2 dagen en schud de culturen drie keer zachtjes met 10 ml PBS om niet-aanhechtende cellen te verwijderen. Na de laatste spoeling verwijder de PBS en vervang deze met 10 ml MSC groeimedium. Vervang het groeimedium na elke 3 dagen van de cultuur na de PBS-spoel. OPMERKING: MSC kolonies moeten zichtbaar zijn op dag 6-7. Het aantal kolonies kan variëren tussen proefpersonen. </li><li> Passage de cellen op dag 10, zoals beschreven in stap 1.2.2. Kwantificeer de cellen in de pellet met behulp van een hemocytometer na een geschikte verdunning in PBS. Zaad de passaged cellen op een dichtheid van 40.000 cellen / cm2 op een cultuurplaat van 10 cm in MSC groeimedium. OPMERKING: Menselijke MSC&#39;s ( Figuur 2D ) tonen een soortgelijke morfologie aan rat MSCs en moeten ook 80 tot 90% samenvloeiing bereiken binnen 2 dagen na het passeren. Ze zouden chara moeten zijnGecertificeerde door middel van immunocytochemie en hun capaciteit voor trilineage differentiatie 12 . Zoals bij rat-MSC&#39;s, zijn menselijke MSC&#39;s die tussen passage 3 en 8 zijn onderworpen aan latere hypoxische preconditioning en neurale voorloperverrijking. </li></ol> 3. Hypoxische Voorbereiding <ol><li> Demonteer de hypoxiekamercomponenten ( bijv. Basis, deksel, bakken) nadat u de ringklem losgemaakt hebt en de afzonderlijke delen schoon maken met 70% ethanol. Plaats de kamercomponenten in een weefselkweekkap van laminair stromingsweefsel voor sterilisatie onder UV-licht gedurende 15 minuten. </li><li> Vóór de hypoxische preconditioning, verwijder het medium en spoel de rat en de menselijke MSC culturen (secties 1 en 2) met 10 ml PBS af. Vervang de PBS met 10 ml MSC groeimedium aangevuld met 25 mM HEPES. OPMERKING: De MSC&#39;s die op 10 cm gerechten zijn gekweekt, zouden 80-90% confluency moeten hebben bereikt voordat ze onderworpen zijn aan hypoxische preconditioning. </li><li> Plaats de culGerechten binnen de hypoxiekamer. Monteer de kamercomponenten en draai de ringklem aan. Spoel een gasmengsel van 99% N2 / 1% O2 in de kamer met een stromingssnelheid van 10 L / min gedurende 5 minuten. </li><li> Verzegel de aansluitende einden van de hypoxiekamer om te voorkomen dat er gaslekkage ontstaat. Plaats de kamer in de cel-incubator (37 ° C, 5% CO 2 ) gedurende 16 uur. </li><li> Na voltooiing van de hypoxische pre-conditionering, verwijder de culturen uit de kamer ter voorbereiding op de volgende neurale voorloperverrijkingskweek. </li></ol> 4. Neurale Progenitor Verrijking Cultuur <ol><li> Bereid neuraal progenitor medium op, dat bestaat uit Dulbecco&#39;s gemodificeerde arendmedium / Ham&#39;s voedermiddelmengsel F12 (DMEM / F12) aangevuld met B27 (2% v / v), basische fibroblastgroeifactor (bFGF, 20 ng / ml), epidermale groeifactor (EGF, 20 ng / ml) en P / S (1% v / v). </li><li> Verwijder de hypoxische voorgeschreven rat / menselijke MSC&#39;s, zoals beschreven in stap 1.2.2.Verzamel de losstaande cellen door centrifugeren bij 250 xg gedurende 5 minuten. Kwantificeer de cellen in de pellet met behulp van een hemocytometer na de juiste verdunning in PBS. </li><li> Resuspendeer de cellen in neuraal progenitor medium en zaad op laagbevestigende, 6-putjes platen met een dichtheid van 6.000 cellen / cm2. Plaats de cultuur gedurende 12 dagen in een cel-incubator (37 ° C, 5% CO2). Vervolgens 75% van het neurale progenitormedium elke 3 dagen. OPMERKING: Grootte niet-aaneengesloten celclusters dienen op dag 6-7 te worden waargenomen. Op dag 10-12 kunnen neurospheren met een diameter ≥ 100 μm worden waargenomen ( figuur 4 ). Hypoxische voorgeschreven MSC&#39;s zouden meer neurosferen moeten opleveren in vergelijking met MSC&#39;s die onder normoxische omstandigheden zijn gekweekt 9 . </li><li> Verzamel neurospheren op dag 12 door ze in een pipet van 10 ml te zuiveren en ze over te brengen naar een 15 ml conische buis. Centrifugeer de neurospheren bij 250 xg gedurende 5 minuten. OPMERKING: Neurospheren kunnen zijnGekenmerkt op dag 12 voor neurale voorloper markers, zoals nestin en GFAP 7 . </li></ol> 5. Generatie van Schadecathène door de Schade via de Coca-Cola met DRG Neuronen <ol><li> Bereiding van gezuiverde rat DRG neuronen <ol><li> Autoclaaf alle dissectie gereedschappen ( dwz dissectieschaar, pincet, twee microdissectie tang en microdissecterende schaar) bij 180 ° C gedurende tenminste 2 uur voor gebruik. </li><li> Coat 6-putjes weefselkweekplaten met poly-D-lysine (PDL, 10 μg / ml in PBS) bij 4 ° C overnacht. Verwijder de PDL en spoel met 1,5 ml PBS per putje. </li><li> Ga door met de coating van de platen met laminine (10 μg / ml in PBS) bij 37 ° C gedurende 2 uur. Spoel de platen met 1,5 ml PBS per putje. </li><li> Bereid DRG neuron onderhoudsmiddel op, bestaande uit neurobasaal medium aangevuld met B27 (2% v / v), L-glutamine (1% v / v), zenuwgroeifactor (NGF, 20 ng / ml) en P / S % V / v). </li><li>Bereid DRG neuron zuiveringsmedium op, bestaande uit neurobasaal medium aangevuld met B27 (2% v / v), L-glutamine (1%), NGF (20 ng / ml), P / S (1%), fluorodeoxyuridine (FDU, 10 Μg / ml) en uridine (10 μg / ml). </li><li> Zwangere ratten op zwangerschapsdag 14-15 bij overdosering van pentobarbital (240 mg / kg lichaamsgewicht, intraperitoneale) opleveren. </li><li> Plaats de opgeofferde dieren in de rugstand. Reinig hun buik grondig met 70% ethanol. </li><li> Snijd de onderbuikwand van het dier in de lengterichting met behulp van fijne dissecterende scharen en pincetjes. Identificeer en verwijder de baarmoeder met behulp van dissectieschaar. Knip de baarmoederwand om de embryo&#39;s bloot te stellen en te extraheren. Breng de embryo&#39;s over naar een steriele, 10 cm kweekschotel gevuld met PBS. Plaats de cultuurschotel op ijs. </li><li> Breng het embryo voor dissectie over naar een steriele, 10 cm kweekschotel gevuld met PBS (kamertemperatuur) en plaats het onder een dissectiemicroscoop. Laat het embryo in slechte positie. NIETE: Het witte wervelkolom en de bijgevoegde DRG&#39;s kunnen gezien worden via het dorsale aspect van het embryo, door middel van de doorschijnende huid. </li><li> Voeg microdissecterende tang in aan weerszijden van het ruggenmerg en gebruik stompe dissectie om het ruggenmerg van het omringende zachte weefsel te scheiden. Snijd het ruggenmerg vrij van het dier met behulp van microdissecterende tang langs de nekopening en staartstub. Voer verder stompe dissectie over het ventrale aspect van het koord om het te bevrijden van omringend zacht weefsel. </li><li> Gebruik microdissecterende tang om resterend zacht weefsel over het dorsale aspect van het bevroren ruggenmerg te verwijderen. OPMERKING: In dit stadium moet alleen het ruggenmerg, zenuwwortels en bijgevoegde DRG blijven. </li><li> Verwijder individuele DRG&#39;s van hun verbindende zenuwwortels met behulp van microdissecting tang. Gebruik een pipetpen die is bevestigd aan een 1 ml tip om de DRG&#39;s over te brengen naar een 1,5 ml, steriele centrifugebuis met PBS. OPMERKING: Voor elke 1,5 ml buis mag maximaalEr kunnen 100 DRG&#39;s worden meegenomen. </li><li> Centrifugeer de DRG&#39;s bij 250 xg gedurende 5 minuten en zet ze opnieuw in recombinante enzymatische celdissociatie-reagens (200 μL per buis). Incubeer (37 ° C, 5% CO2) gedurende 10 minuten. Centrifugeer de DRG&#39;s bij 250 xg gedurende 5 minuten, verwijder de supernatant en resuspendeer in DRG neuron onderhoudsmiddel. Dissocieer de pellet door zachte trituratie met behulp van een 200 μL pipet tip. Kwantificeer de cellen in de pellet met behulp van een hemocytometer na een passende verdunning. </li><li> Zaad de cellen bij een dichtheid van 5.000 cellen / cm2 in PDL / laminine beklede 6-putjes platen in 1,5 ml DRG neuron onderhoud medium per put. Na twee dagen cultuur verwijder het DRG neuron onderhoudsmiddel, spoel met PBS, en vervang met DRG neuron zuiveringsmedium. OPMERKING: Voor elke zuiveringscyclus, behandel de DRG culturen met zuiveringsmedium gedurende 2 dagen, gevolgd door 1 dag incubatie in onderhoudsmiddel. Na 3-4 zuiveringscycli wordt de remOvaal van alle endogene glia wordt verwacht 7 . Dit duurt ongeveer 14 dagen. Gezuiverde culturen testen positief voor de neuronale marker TUJ1 en zijn afwezig voor S100β expressie ( Figuur 5 ). </li></ol></li><li> Generatie van Schwann celachtige cellen <ol><li> Bereid glialinductiemedium dat bestaat uit aMEM aangevuld met P-Heregulin (100 ng / ml), bFGF (10 ng / ml), bloedplaatjes afgeleide groeifactor (PDGF-AA, 5 ng / ml), FBS (10%) en P / S (1% v / v). </li><li> Plaat de neurospheren die bereid zijn in sectie 4 in PDL / laminine beklede 6-putjes platen bij een dichtheid van 5-10 bolletjes per cm2 in 1,5 ml glial inductie medium per put. Vervang glialinductiemedium elke 2 dagen na het spoelen van de cellen met PBS. OPMERKING: Cellen uit gezaagde neurospheren worden gezien als dag 2 naar buiten migreren. Op dag 7 hebben migrerende cellen een taperende verschijning en moeten immunopositiviteit voor de Schwann-cel aantonenMarkers p75 neurotrofin receptor (p75) en S100β 7 . Deze cellen worden aangeduid als SCLCs. </li></ol></li><li> Coculture van SCLC&#39;s met DRG neuronen <ol><li> Bereid coculture-medium op, dat bestaat uit DRG-neuron onderhoudsmedium (stap 5.1.4) en glialinductiemedium (stap 5.2.1) bij een volumeverhouding van 1: 1. </li><li> Bereid Schwann-cel onderhoudsmedium bestaande uit DMEM / F12 aangevuld met FBS (5%), P-Heregulin (10 ng / ml) en P / S (1% v / v). </li><li> Verwijder het kweekmedium uit dag 7 SCLC&#39;s, spoel ze met PBS en incubeer ze 5 minuten met 5 ml / ml recombinante enzymatische celdissociatie-reagens bij 37 ° C. Resuspendeer de SCLC&#39;s in coculture medium. </li><li> Kwantificeer de cellen met behulp van een hemocytometer na een passende verdunning. </li><li> Zaai de SCLC&#39;s op gezuiverde DRG neuron culturen bij een dichtheid van 1000 cellen / cm2. Behou de coculturen gedurende 14 dagen, met een gemiddelde vervanging om de 2 dagen. OPMERKING: Tijdens cocultuur verwierf SCLCs de spindelachtige morfologie die typisch is voor volwassen Schwann-cellen ( Figuur 6 ). Deze cellen volgen in hun fenotype na de terugtrekking van groeifactoren en kunnen axonen in vitro en in vivo 7 , 10 mengen. De positiviteit van Schwann celmarkers ( dwz p75 en S100β) moet worden gecontroleerd door immunofluorescentie. </li><li> Na voltooiing van de cocultuur, zijn doorgangskader-toegewijde Schwann-cellen, zoals beschreven in stap 1.2.2. Gebruik 0,5 ml dissociatie-reagens per putje. Kwantificeer de cellen met behulp van een hemocytometer na een passende verdunning. </li><li> Resuspende schaduwcellen in Schwann-cel onderhoudsmedium bij een dichtheid van 10.000 cellen / cm2. Zaadcellen in PDL / laminine beklede 6-putjes platen voor immunofluorescentie. OPMERKING: Cocultures bevatten onvermijdelijk MSC&#39;s die een fibroblast hebben aangenomenCel lot 7 . Deze cellen worden doorgevoerd samen met schaduwcellen op het gebied van de noodlot bij de voltooiing van de cocultuur. Schwanncellen die bovenop dit fibroblast substratum liggen, kunnen gemakkelijk worden losgemaakt en verder uitgebreid na het spoelen met &quot;koude stralen&quot; van PBS (4 ° C), zoals elders beschreven 13 is . Schadeconservaten kunnen gedurende 1 maand in onderhoudsmedium worden uitgebreid. </li></ol></li></ol>

<ol><li>Wiliams, R. R., Bunge, M. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Schwann+cell+transplantation%3A+a+repair+strategy+for+spinal+cord+injury%3F%5BTitle%5D)+AND+%22Prog+Brain+Res%22%5BJournal%5D)">Schwann cell transplantation: a repair strategy for spinal cord injury?</a> Prog Brain Res. 201, 295-312 (2012).</li>
<li>Kanno, H., Pearse, D. D., Ozawa, H., Itoi, E., Bunge, M. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Schwann+cell+transplantation+for+spinal+cord+injury+repair%3A+its+significant+therapeutic+potential+and+prospectus%5BTitle%5D)+AND+%22Rev+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Schwann cell transplantation for spinal cord injury repair: its significant therapeutic potential and prospectus.</a> Rev Neurosci. 26 (2), 121-128 (2015).</li>
<li>Lindvall, O., Kokaia, Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Stem+cells+in+human+neurodegenerative+disorders--time+for+clinical+translation%3F%5BTitle%5D)+AND+%22J+Clin+Invest%22%5BJournal%5D)">Stem cells in human neurodegenerative disorders--time for clinical translation?</a> J Clin Invest. 120 (1), 29-40 (2010).</li>
<li>Terzic, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Directed+Differentiation+of+Oligodendrocyte+Progenitor+Cells+From+Mouse+Induced+Pluripotent+Stem+Cells%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Transplant%22%5BJournal%5D)">Directed Differentiation of Oligodendrocyte Progenitor Cells From Mouse Induced Pluripotent Stem Cells.</a> Cell Transplant. 25 (2), 411-424 (2016).</li>
<li>Takashima, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neuroepithelial+cells+supply+an+initial+transient+wave+of+MSC+differentiation%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Neuroepithelial cells supply an initial transient wave of MSC differentiation.</a> Cell. 129 (7), 1377-1388 (2007).</li>
<li>Felling, R. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neural+stem%2Fprogenitor+cells+participate+in+the+regenerative+response+to+perinatal+hypoxia%2Fischemia%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Neural stem/progenitor cells participate in the regenerative response to perinatal hypoxia/ischemia.</a> J Neurosci. 26 (16), 4359-4369 (2006).</li>
<li>Shea, G. K., Tsui, A. Y., Chan, Y. S., Shum, D. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bone+marrow-derived+Schwann+cells+achieve+fate+commitment--a+prerequisite+for+remyelination+therapy%5BTitle%5D)+AND+%22Exp+Neurol%22%5BJournal%5D)">Bone marrow-derived Schwann cells achieve fate commitment--a prerequisite for remyelination therapy.</a> Exp Neurol. 224 (2), 448-458 (2010).</li>
<li>Jessen, K. R., Mirsky, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+origin+and+development+of+glial+cells+in+peripheral+nerves%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Neurosci%22%5BJournal%5D)">The origin and development of glial cells in peripheral nerves.</a> Nat Rev Neurosci. 6 (9), 671-682 (2005).</li>
<li>Mung, K. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rapid+and+efficient+generation+of+neural+progenitors+from+adult+bone+marrow+stromal+cells+by+hypoxic+preconditioning%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cell+Res+Ther%22%5BJournal%5D)">Rapid and efficient generation of neural progenitors from adult bone marrow stromal cells by hypoxic preconditioning.</a> Stem Cell Res Ther. 7 (1), 146(2016).</li>
<li>Ao, Q., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+regeneration+of+transected+sciatic+nerves+of+adult+rats+using+chitosan+nerve+conduits+seeded+with+bone+marrow+stromal+cell-derived+Schwann+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Biomaterials%22%5BJournal%5D)">The regeneration of transected sciatic nerves of adult rats using chitosan nerve conduits seeded with bone marrow stromal cell-derived Schwann cells.</a> Biomaterials. 32 (3), 787-796 (2011).</li>
<li>Tondreau, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+of+BM+mesenchymal+stem+cells+by+plastic+adhesion+or+negative+selection%3A+phenotype%2C+proliferation+kinetics+and+differentiation+potential%5BTitle%5D)+AND+%22Cytotherapy%22%5BJournal%5D)">Isolation of BM mesenchymal stem cells by plastic adhesion or negative selection: phenotype, proliferation kinetics and differentiation potential.</a> Cytotherapy. 6 (4), 372-379 (2004).</li>
<li>Baksh, D., Song, L., Tuan, R. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Adult+mesenchymal+stem+cells%3A+characterization%2C+differentiation%2C+and+application+in+cell+and+gene+therapy%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cell+Mol+Med%22%5BJournal%5D)">Adult mesenchymal stem cells: characterization, differentiation, and application in cell and gene therapy.</a> J Cell Mol Med. 8 (3), 301-316 (2004).</li>
<li>Jirsova, K., Sodaar, P., Mandys, V., Bar, P. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cold+jet%3A+a+method+to+obtain+pure+Schwann+cell+cultures+without+the+need+for+cytotoxic%2C+apoptosis-inducing+drug+treatment%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurosci.+Methods%22%5BJournal%5D)">Cold jet: a method to obtain pure Schwann cell cultures without the need for cytotoxic, apoptosis-inducing drug treatment.</a> J. Neurosci. Methods. 78 (1-2), 133-137 (1997).</li>
</ol>

Alle auteurs van dit manuscript hebben geen onthullingen om te verklaren.

Het is essentieel om de &quot;stevigheid&quot; van MSC&#39;s te behouden voorafgaand aan de verrijking van neurale voorvaders via hypoxische preconditioning en neurosfeercultuur. Uit onze ervaring kunnen multipotente MSC&#39;s betrouwbaar worden geïdentificeerd door hun langwerpige fibroblastachtige morfologie. In tegenstelling hiermee, MSCs die een meer platgemaakte, vierhoekige morfologie, met prominente cytoskeletale stressvezels hebben aangenomen, nemen niet gemakkelijk neurale celpartijen vast en dienen weggegooid ...

De transplantatie van neurale progenitoren en hun derivaten toont belofte als een behandelingsstrategie na traumatische zenuwletsel 1 , 2 en neurodegeneratie 3 , 4 . Voorafgaand aan de klinische toepassing is het essentieel om te verzekeren: i) een methode om toegang te krijgen tot en uit te breiden op een autologe bron van stam- / stamcellen en ii) een middel om hen naar relevante volwassen cellen te brengen 3 . Onze interesse in celtherapie voor ruggenmergbesering heeft ons geleid tot het zoeken naar een robuuste, autologe celbron van neurale progenitoren uit volwassen weefsels. Een subpopulatie van MSC&#39;s komt uit de neurale kam en is gemakkelijk toegankelijk vanuit de mergholte. Deze cellen zijn neurale voorvaders die neuronen en glia 5 kunnen genereren. Diermodellen van cerebrale ischemie tonen aan dat hypoxie de proliferatie bevordert<html> Inferatie en multipotentie van neurale voorlopers in de hersenen 6 . Dit was de basis voor het gebruik van hypoxische pre-conditionering als middel om uit te breiden op merg-afgeleide neurale progenitoren. De transplantatie van Schwann-cellen in het gewonde ruggenmerg bevordert regeneratie 2 . SCLC&#39;s kunnen worden gegenereerd door MSC&#39;s door middel van supplementatie met gliogene factoren ( dwz β-Heregulin, bFGF en PDGF-AA) maar tonen fenotypische instabiliteit. Bij de terugtrekking van groeifactoren keren ze terug naar een fibroblastachtig fenotype 7 . Fenotypische instabiliteit is ongewenst bij celtransplantatie vanwege het risico op afwijkende differentiatie en carcinogenese. Aangezien de Schwann-celprecursoren geassocieerd zijn met axonbundels binnen de embryonale perifere zenuw 8 , werden we geleid tot cocultuur-SCLC&#39;s met gezuiverde embryonale DRG-neuronen 7 ,Ass = &quot;xref&quot;&gt; 9. Resultaat rijpe Schwanncellen zijn lotgevonden en tonen functie in vitro 7 , 9 en in vivo 10 . Ons protocol voor de verrijking van neurale progenitoren van MSC&#39;s is eenvoudig en efficiënt en resulteert in een toename van het celnummer voor latere analyses. De afleiding van door Schotse cellen geformuleerde schadecellen via het coculture platform zorgt voor de studie van glialifferentiatie en voor het genereren van stabiele en functionele Schwann-cellen voor potentiële klinische toepassing.

<table><tbody><tr><td>&alpha;MEM</td><td>Sigmaaldrich</td><td>M4526</td><td></td></tr><tr><td>DMEM/F12</td><td>Thermofisher scientific</td><td>12400-024</td><td></td></tr><tr><td>Neurobasal medium</td><td>Thermofisher scientific</td><td>21103-049</td><td></td></tr><tr><td>FBS</td><td>Biosera</td><td>FB-1280/500</td><td></td></tr><tr><td>B27</td><td>Thermofisher scientific</td><td>17504-001</td><td></td></tr><tr><td>Epidermal growth factor (EGF)</td><td>Thermofisher scientific</td><td>PHG0313</td><td></td></tr><tr><td>Basic fibroblast growth factor (bFGF)&nbsp;</td><td>Peprotech</td><td>100-18B/100UG</td><td></td></tr><tr><td>Nerve growth factor (NGF)&nbsp;</td><td>Millipore</td><td>NC011</td><td></td></tr><tr><td>Platelet-derived growth factor-AA (PDGF-AA)</td><td>Peprotech</td><td>100-13A</td><td></td></tr><tr><td>Heregulin beta-3, EGF domain (&beta;-Her)</td><td>Millipore</td><td>01-201</td><td></td></tr><tr><td>Uridine</td><td>Sigmaaldrich</td><td>U3003</td><td></td></tr><tr><td>5-Fluro-2' - deoxyuridine (FDU)</td><td>Sigmaaldrich</td><td>F0503</td><td></td></tr><tr><td>Poly-D-lysine (PDL)</td><td>Sigmaaldrich</td><td>P7886-1G</td><td></td></tr><tr><td>Laminin</td><td>Thermofisher scientific</td><td>23017015</td><td></td></tr><tr><td>GlutaMAX</td><td>Thermofisher scientific</td><td>35050061</td><td></td></tr><tr><td>Penicillin / streptomycin (P/S)</td><td>Thermofisher Scientific</td><td>15140-122</td><td></td></tr><tr><td>TrypLE Express</td><td>Thermofisher Scientific</td><td>12604-013</td><td></td></tr><tr><td>10 cm plate for adherent culture</td><td>TPP</td><td>93100</td><td>Gebaten voor selectie van MSC's door weefselcultuur adhesie</td></tr><tr><td>6-well plate for adherent culture</td><td>TPP</td><td>92006</td><td>Gebaten voor expansie van MSC's na overdracht</td></tr><tr><td>UltraLow 6-well plate for non-adherent culture</td><td>Corning</td><td>3471</td><td>Gebaten voor neurale voorlopervolverrijking</td></tr><tr><td>anti-human CD90(Thy-1)</td><td>BD Biosciences</td><td>555593</td><td></td></tr><tr><td>anti-human CD73</td><td>BD Biosciences</td><td>550256</td><td></td></tr><tr><td>anti-human/rat STRO-1</td><td>R&amp;D Systems</td><td>MAB1038</td><td></td></tr><tr><td>anti-human nestin</td><td>R&amp;D Systems</td><td>MAB1259</td><td></td></tr><tr><td>anti-human CD45</td><td>BD Biosciences</td><td>555480</td><td></td></tr><tr><td>anti-rat CD90(Thy-1)</td><td>BD Biosciences</td><td>554895</td><td></td></tr><tr><td>anti-rat CD73</td><td>BD Biosciences</td><td>551123</td><td></td></tr><tr><td>anti-rat nestin</td><td>BD Biosciences</td><td>MAB1259</td><td></td></tr><tr><td>anti-rat CD45</td><td>BD Biosciences</td><td>554875</td><td></td></tr><tr><td>Anti-S100&beta;</td><td>Dako</td><td>Z031101</td><td></td></tr><tr><td>Anti-p75</td><td>Millipore</td><td>MAB5386</td><td></td></tr><tr><td>Anti-GFAP</td><td>Sigmaaldrich</td><td>G3893</td><td></td></tr><tr><td>Anti-Class III-beta tubulin (Tuj-1)</td><td>Covance</td><td>MMS-435P</td><td></td></tr><tr><td>Anti-Human nuclei</td><td>Millipore</td><td>MAB1281</td><td></td></tr><tr><td>Hypoxia chamber</td><td>Billups-Rothenberg</td><td>MIC-101</td><td></td></tr><tr><td>HEPES buffer</td><td>Sigmaaldrich</td><td>H4034-100G</td><td></td></tr></tbody></table>

hypoxische preconditioning van merg-afgeleide progenitorcellen als bron voor de generatie van volwassen schwann-cellen

Hypoxic Preconditioning of Marrow-derived Progenitor Cells As a Source for the Generation of Mature Schwann Cells

Dit manuscript beschrijft een middel om te verrijken voor neurale voorliefhebbers van de MSC-populatie en daarna te leiden naar het volwassen Schwann-cellot. Wij ondervonden ratten- en menselijke MSC&#39;s voor transiente hypoxische condities (1% zuurstof gedurende 16 uur), gevolgd door uitbreiding als neurospheren bij substratum met een lage bindingstijd, met supplementatie van de epidermale groeifactor (EGF) / basis fibroblastgroeifactor (bFGF). Neurospheren werden gepolijst op poly-D-lysine / laminine-beklede weefselkweekplastic en gekweekt in een gliogene cocktail die β-Heregulin, bFGF en bloedplaatjes afgeleide groeifactor (PDGF) bevat om Schwann-celachtige cellen te genereren (SCLC&#39;s). SCLC&#39;s werden gedurende 2 weken door middel van cocultuur door middel van cocultuur geregeld met gezuiverde Dorsal root Ganglia (DRG) neuronen verkregen uit E14-15 zwangere Sprague Dawley ratten. Volwassen Schwann cellen tonen aanhoudendheid in S100p / p75 expressie en kunnen myeline segmenten vormen. Cellen die op deze manier zijn gegenereerd hebben potentieel aPplicaties bij autologe celtransplantatie na ruggenmergletsel, evenals bij ziekte-modellering.

Een overzicht van de belangrijkste fasen in ons protocol is geïllustreerd in figuur 1 . Samenvattend worden rat- en menselijke MSC&#39;s geselecteerd door aanhechting aan weefselkweekplastic. Uitgebreide MSC&#39;s zijn voorgeschreven met hypoxie en zijn dan onderworpen aan neurosfeervormende condities. Neurospheren zijn geplateerd en mogen onderscheiden in SCLC&#39;s. SCLC&#39;s worden gecultiveerd met gezuiverde DRG-neuronen om schaduwcellen te genereren. <...

Spiercellen (MSC&#39;s) met neurale potentieel bestaan ​​in het beenmerg. Ons protocol verrijkt deze populatie van cellen via hypoxische preconditioning en wijst hen vervolgens op om volwassen Schwann cellen te worden.

Hypoxische preconditioning van merg-afgeleide progenitorcellen als bron voor de generatie van volwassen Schwann-cellen

This manuscript describes a means to enrich for neural progenitors from the marrow stromal cell (MSC) population and thereafter to direct them to the ...

Het algemene doel van deze celkweektechniek is om neurale progenitorcellen uit het beenmerg te verrijken om hun differentiatie tot functionele Schwanncellen te vergemakkelijken. Deze methode pakt een cruciaal probleem in de stamcel- en regeneratieve geneeskunde aan: hoe een beperkte bron van neuroprogenitoren kan worden gebruikt om glia te genereren die helpen bij axonale hergroei en remyelinisatie na een trauma. Een voordeel van deze techniek is het gebruik van efficiënte kweekcondities om de expansie van neurale cellen uit beenmergstromale cellen te bevorderen voor gebruik in autologe celtherapie.Verwijder na twee dagen in cultuur 75% van het gebruikte medium en de niet-adherente cellen, en spoel de adherente cellen drie keer met 10 milliliter PBS. Vervang na de derde wasbeurt de PBS door 10 milliliter groeimedium voor beenmergstroomcellen, of MSC, en plaats de cultuur terug in de incubator. Zichtbare kolonies zouden tegen dag zes tot zeven moeten verschijnen.Was op dag 10 de cultuur met verse PBS en detacheer de cellen met 1,5 milliliter recombinant enzymatisch celdissociatiereagens. Voeg na vijf minuten bij 37 °C drie milliliter MSC-groeimedium toe om de reactie te neutralisere

hypoxic-preconditioning-marrow-derived-progenitor-cells-as-source-for

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Ontwikkelingsbiologie

Een methode om de verdeling van beenmerg hematopoietische stamcellen in flowcytometrie en efficiënt isoleren sterk gezuiverde hematopoietische stamcellen (HSC) analyse beschreven. De isolatie procedure is in hoofdzaak gebaseerd op magnetische verrijking van c-Kit + cellen en cel sortering tot HSCs voor cellulaire en moleculaire studies te zuiveren.

Fenotypische analyse en isolatie van Murine hematopoëtische stamcellen en Lineage-geëngageerde voorouders

This video demonstrates a method for obtaining Schwann cell-like cells from multipotent bone marrow stromal cells (BMSCs). Initially, the BMSCs undergo hypoxia treatment, followed by directed differentiation into neuronal progenitor cells. Subsequently, specific media and culture conditions are employed to induce the transformation of these progenitor cells into Schwann cell-like cells.

Generating Schwann Cell-Like Cells from Bone Marrow Stromal Cells

This video demonstrates a procedure for isolating dorsal root ganglion (DRG) neurons from rat embryos and co-culturing them with Schwann cell precursors to generate mature Schwann cells. The isolated DRGs are processed to isolate neurons and glial cells. The isolated cells are cultured to purify the neurons, which are then co-cultured with Schwann cell-like cells (SCLCs) in a co-culture medium. Interaction with the DRG neurons leads to the maturation of SCLCs into Schwann cells.

Isolation of DRG Neurons and Coculture with Schwann Cell Precursors to Generate Schwann Cells

Generatie van geïnduceerde pluripotente stamcellen biedt fascinerende perspectieven voor de afleiding van autologe transplantaties. Echter, de progressie door middel van een pluripotente toestand en moeizaam re-differentiatie nog belemmert klinische vertaling. Hier beschrijven we de afleiding van volwassen humane fibroblasten en hun directe omzetting in geïnduceerde neurale progenitor cellen en de daaropvolgende differentiatie tot neuronale lijnen.

Afleiding van volwassen menselijke fibroblasten en hun directe omzetting in Expandable Neural Progenitor Cellen

We laten zien hoe te identificeren en te isoleren 6 deelverzamelingen van myeloïde voorlopercellen uit lymfkliertest beenmerg met behulp van een combinatie van magnetische en fluorescentie sorteren (MACS en FACS). Dit protocol kan worden gebruikt voor in vitro cultuur assays (methylcellulose of vloeistof culturen), in vivo adoptief overdracht experimenten en RNA/eiwit analyses.

Identificatie en isolatie van de Oligopotent en Lineage-begaan myeloïde voorlopercellen uit beenmerg van de muis

De neuron-gliale interacties bij neurodegeneratie worden niet goed begrepen als gevolg van ontoereikende hulpmiddelen en methoden. Hier beschrijven we geoptimaliseerde protocollen om geïnduceerde neuronen, oligodendrocytenvoorlopercellen en oligodendrocyten te verkrijgen uit menselijke pluripotente stamcellen en geven we voorbeelden van de waarden van deze methoden bij het begrijpen van celtypespecifieke bijdragen bij de ziekte van Alzheimer.

Generatie van menselijke neuronen en oligodendrocyten uit pluripotente stamcellen voor het modelleren van neuron-oligodendrocyteninteracties

We beschrijven drie methoden van beenmergtransplantatie (BMT): BMT met total-body bestraling, BMT met afgeschermde bestraling en BMT-methode zonder pre-conditionering (adoptieve BMT) voor de studie van klonale hematopoiese in muismodellen.

Beenmergtransplantatieprocedures bij muizen om clonal hematopoiese te bestuderen

Dit protocol beschrijft de intrafemorale injectie van enkele hematopoëtische of leukemische stamcellen, waaronder gen-bewerkte cellen, in muizenxenotransplantaatmodellen, die niet alleen de snelle en veilige transplantatie van cellen mogelijk maken, maar ook seriële analyses van het beenmerg.

Vereenvoudigde intrafemorale injecties met levende muizen maken continue beenmerganalyse mogelijk

Hier hebben we in vivo osteo-organoïden ontwikkeld die worden getriggerd door botmorfogenetische eiwit-2-geladen gelatineschars om therapeutische hematopoëtische stam-/voorlopercellen te oogsten voor de reconstructie van een beschadigd hematopoëtisch en immuunsysteem. Over het algemeen kan deze aanpak een veelbelovende celbron zijn voor celtherapieën.

In vivo osteo-organoïde benadering voor het oogsten van therapeutische hematopoëtische stam-/voorlopercellen

In dit protocol wordt de afleiding van cardiale stamcellen van zowel muis- als menselijke embryonale stamcellen geïllustreerd. Een belangrijke strategie in dit protocol is het verrijken van cardiale stamcellen met middel van flowcytometrie met behulp van fluorescente reporters die in de embryonale stamcellijnen zijn ontworpen.

Afleiding van Cardiac stamcellen uit embryonale stamcellen

Leer hoe beenmergstroma cellen met hypoxische preconditioning te verrijken voor differentiatie naar volwassen Schwann-cellen. Deze methode ondersteunt autologe celtherapie bij zenuwherstel.

Hypoxische preconditioning van merg-afgeleide progenitorcellen als bron voor de generatie van volwassen Schwann-cellen

Meer video's verkennen