Name: Sezione delle ghiandole mammarie per tutti gli attacchi per identificazione delle lesioni (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-07-24T14:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 22 s
Description: Impara a preparare sezioni istologiche da montaggi integrali di tessuto mammario murino per l'identificazione microscopica delle lesioni. Questa tecnica migliora la valutazione istopatologica in studi riproduttivi e di sviluppo.

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Gli autori vorrebbero riconoscere Pam Ovwigho, Tenette Jones e Natasha Clayton, NIEHS, per la loro esperienza tecnica e supporto con questo progetto.

Tutti gli usi animali e le procedure per questo studio sono state approvate dall&#39;animale NIEHS Laboratory Comitato per la cura e l&#39;uso e condotto in un&#39;associazione per la valutazione e l&#39;accreditamento di Impianto accreditato per la cura degli animali da laboratorio. 1. Mammary Preparazione a tutto sesto 2 , 3 , 6 , 7 <ol><li> Rimuovere le ghiandole mammarie inguinali da un lato di un mouse femminile non pregnant CD-1, come descritto nel riferimento 3 , e posizionarle su uno scivolo elettrostaticamente caricato. </li><li> Coprire la ghiandola con carta o pellicola antiaderente e inserire un&#39;altra diapositiva in cima. Aggiungere la pressione ( cioè i pesi dell&#39;acqua) alla diapositiva per spargere la ghiandola in modo che la ghiandola rimanga sullo scivolo per fissarla. </li><li> Immergere le diapositive in fissativo ( es. 100% etanolo, cloroformio e acido acetico glaciale in rapporto 6: 3: 1)Pernottamento a temperatura ambiente. </li><li> Rimuovere le ghiandole dal fissativo e lavare in etanolo per 15-30 min. Dopo il lavaggio di 30 minuti, passare gradualmente all&#39;acqua versando 1/3 dell&#39;etanolo e aggiungendo acqua. Lasciate che il lavaggio rimanga per circa 5 minuti ogni volta e ripeti con l&#39;aggiunta dell&#39;acqua 3 volte. </li><li> Macchiare (per esempio, soluzione aluminica di carminio) per 12-24 h. NOTA: I tessuti più spesso richiedono tempi di colorazione più lunghi. Vedere il riferimento 3 per la colorazione dei dettagli. </li><li> Versare la macchia dopo il tempo assegnato e sciacquare le diapositive in acqua per 30 s. Deidirli i tessuti lavando le vetrini in etanolo al 70% per 15 minuti, seguite da un lavaggio di 15 minuti in etanolo al 95% ed un lavaggio finale in etanolo al 100% per 20 minuti. </li><li> Eliminare il grasso dai tessuti, collocandoli in xilene per un minimo di 24 ore, o più a lungo se il tessuto è spesso, in modo da rimuovere tutte le aree opache o bianche. </li><li> Rimuovere il tessuto dal xilene e aggiungere rapidamente mMettere il medesimo al diapositiva per evitare la disidratazione dei tessuti; Posizionare un coperchio sulla parte superiore. Lasciare asciugare la diapositiva per almeno 48 ore. </li><li> Valutare il tessuto interamente montato per le anomalie, come descritto in 2 . NOTA: quando le lesioni vengono rilevate in montagne intere e la sezione è necessaria per stabilire la loro identità, seguire le seguenti fasi. </li></ol> 2. Rimozione del Mammary Whole Mount da una diapositiva di vetro <ol><li> Rimuovere la copertura e il supporto di montaggio sommersando la scivolata del mammifero in un recipiente di vetro colorato pieno di xilene durante la notte. NOTA: I tessuti e le diapositive più alte con una soluzione di montaggio eccessiva possono richiedere tempi aggiuntivi per la rimozione del coperchio. </li><li> Dopo il primo bagaglio di notte, posizionare le diapositive in xilene fresco e immergere per 6 ore. Effettuare un ultimo ammollo in xilene fresco durante la notte. NOTA: La copertura copre facilmente la diapositiva dopo l&#39;ultima immersione. </li><li> Con agAmate la mano, tenete la diapositiva e rimuovete accuratamente la coperta con una coppia di pinze per assicurarne la rimozione in un solo pezzo. NOTA: Nel caso in cui il coperchio sia ancora fissato al vetrino, continuare a immergerlo finché non si può rimuovere con poco sforzo. </li><li> Una volta rimossa la copertura, tenere la diapositiva perpendicolarmente ad un piatto di vetro di Petri contenente xilene, prendete attentamente una lama di rasoio tagliente e usa e scorri la lama in un solo movimento verso il basso. </li><li> Una volta che il tessuto viene rimosso, immettere rapidamente il tampone mammario in un piatto di vetro Petri pieno di xilene per assicurare che il tessuto non si asciughi. NOTA: Attenersi a questo passaggio. L&#39;intero supporto è sottile (≤ 1 mm) e fragile dall&#39;elaborazione di xilene. Ogni impressione o lacrime può cambiare la morfologia del tessuto e complicare le valutazioni successive. </li></ol> 3. Trattamento dei tessuti <ol><li> Una volta che il tessuto è nel piatto di Petri, trasferirlo con curaA una cassetta di istologia etichettata. Afferrare il bordo del tampone di grasso con punte a punta a punta liscia, per ridurre al minimo i danni ai tessuti. <ol><li> Usando un rasoio, tagliate a metà i tessuti più grandi (specialmente per i topi) e collocarli in due cassette etichettate separate che accolgono le dimensioni del tessuto. Posizionare il tessuto a destra con l&#39;alto (utilizzare il linfonodo come riferimento). Assicurarsi che il tessuto senza il linfonodo sia mantenuto nella stessa posizione in posizione verticale quando viene trasferito nella cassetta. </li></ol></li><li> Posizionare la cassetta in un contenitore di xilene per un massimo di 2 ore prima di collocarlo nel processore del tessuto. NOTA: Si raccomanda di elaborare i campioni nello stesso giorno in cui vengono collocati nella cassetta. L&#39;imbottitura estesa in xilene non è stata testata. </li><li> Caricare il numero massimo di cassette nel processore del tessuto a mano. </li><li> Prima di iniziare, programma tutti i reagenti che verranno utilizzati per questo processo nell&#39;elenco dei reagenti del processore. Per automatizzare il movimentoDa una stazione all&#39;altra, utilizzare le opzioni del menu e creare un nuovo programma. Una volta completati tutti i passaggi, selezionare &#39;OK&#39; per procedere. NOTA: Il processore consentirà la revisione di tutti i dettagli della stazione prima di avviare. <ol><li> Automatizzare il processore per immergere le cassette in xilene per 30 minuti a 37 ° C, seguita da una seconda immersione in xilene fresco nelle stesse condizioni. Automatizzare il processore per rimuovere le cassette dalla soluzione xilene e trasferire i tessuti nella stazione successiva contenente una miscela di paraffina fusa di 1: 1, impostata a 60 ° C, per 30 min. NOTA: Il processore trasferirà le cassette in una nuova camera che contiene paraffina fusa per 1 ora. Dopo 1 ora i campioni saranno automaticamente trasferiti in una nuova camera di paraffina fusa fresca e saranno trattati per altri 2 h. Entrambe le fasi vengono eseguite a 60 ° C. </li><li> Il processore poi trasferisce le cassette alla stazione contenente para paraFfin per 1 h. Quindi, i campioni vengono automaticamente trasferiti alla stazione finale di paraffina fusa fresca e trattati per altri 2 h. Entrambe le fasi vengono eseguite a 60 ° C. </li></ol></li></ol> 4. Incorporare il tessuto mammario lavorato <ol><li> Posizionare le cassette nel serbatoio della paraffina 58 ° C della stazione di incorporazione fino a quando non sarà pronto per incorporare il tessuto nello stampo. </li><li> Rimuovere il coperchio della cassetta per determinare la migliore dimensione dello stampo per il tessuto. Assicurarsi che lo stampo sia abbastanza grande per accogliere il tessuto e lasciare abbastanza spazio per avere un bordo di paraffina privo di tessuti attorno al perimetro. </li><li> Aggiungere 3-4 mm di paraffina fusa allo stampo e orientare la superficie del mammifero interamente montata, che era adiacente al fondo della vetretta di vetro e al fondo della cassetta, rivolta verso l&#39;alto nello stampo. </li><li> Trasferire lo stampo su una piastra di raffreddamento e regolare rapidamente il tessuto secondo necessità in modo che sia parallelo allo stampo bottom. NOTA: Una volta che la paraffina si indurisce, il tessuto verrà bloccato in posizione. </li><li> Usando le pinze calde, posizionare la metà inferiore della cassetta sulla parte superiore dello stampo; Premere saldamente con la pinza. </li><li> Aggiungere una ulteriore paraffina fusa allo stampo in un movimento continuo per coprire l&#39;intera cassetta. Spostare lo stampo dalla piastra calda a una piastra fredda per completare l&#39;indurimento del blocco. </li><li> Rimuovere il blocco dallo stampo quando la paraffina si solidifica completamente per evitare crepe o bolle d&#39;aria. NOTA: Conservare i tessuti incorporati in paraffina a temperatura ambiente fino a quando non è pronto per la sezione. </li></ol> 5. Sezione del tessuto mammario incorporato in paraffina sul microtomo <ol><li> Prima della sezionatura, incubare i blocchi di paraffina a -20 ° C per 1 h. NOTA: Ci sarà un supporto di montaggio residuo nel blocco dal tessuto originale completo di copertina. Il raffreddamento del blocco migliora la sezione di blocco e il nastro. </li><li> Preparare il microfonoGirare accendendo il bagno d&#39;acqua, contenente acqua fresca distillata e regolare la temperatura a 42-45 ° C. Posizionare una lama fresca a basso profilo sul microtomo e impostarla a 4 μm. NOTA: La qualità della sezione viene ridotta con sezioni più spesse di 4 μm a causa della presenza di un supporto di montaggio residuo nel tessuto. </li><li> Inserire il blocco nel microtomo con la cera rivolta verso la lama e allineare al piano verticale. Quindi, inumidire una sezione di rilievo in acqua fredda e metterlo sul blocco per alcuni minuti. </li><li> Sezione il blocco ruotando la ruota grande in un movimento in senso orario, in combinazione con la ruota avanzata avanzata, fino a ottenere una faccia piena o una sezione rappresentativa del blocco. NOTA: Il tessuto è sottile a causa della radura di xilene durante il processo di montaggio. Allineare correttamente il blocco con la lama per ridurre al minimo il numero di tagli per ottenere una sezione rappresentativa. </li><li> Scegli il nastroSpostare con attenzione il nastro nel bagno d&#39;acqua caldo (45 ° C) preparato in anticipo, consentire alle rughe dei tessuti di dissipare e galleggiano con cura un tratto su una lastra di vetro pulita. </li><li> Posizionare le diapositive verticalmente su un rack per asciugare per rimuovere l&#39;acqua in eccesso. Incubare le diapositive in una scivoletta leggermente aperta per una notte a 37 ° C. </li></ol> 6. H &amp; E automatizzata e manuale di colorazione dei tessuti mammari sezionati <ol><li> Prima della colorazione, le diapositive vengono conservate a temperatura ambiente. </li><li> Per la colorazione automatica, selezionare H &amp; E dalle opzioni di colorazione nel menu principale. La deparaffinazione, la colorazione e la disidratazione sono tutti completati sul macchinario automatizzato. Utilizzare un supporto di montaggio e una copertura per montare le sezioni. </li><li> Se si colorano manualmente le diapositive, deparaffinare le sezioni immersando le diapositive in xilene per 5 min. Trasferire in xilene fresco e ripetere per 5 minuti. </li><li> Riabilita le diapositive immersing thEm due volte in etanolo al 100% per 3 minuti ciascuno, seguiti da due ripetizioni in etanolo fresco al 95% e due lavaggi separati in tampone di lavaggio 1X a 5 minuti ciascuno. </li><li> Sciacquare le diapositive in acqua distillata. </li><li> Aggiungere le diapositive all&#39;ematossilina per 1-2 minuti. Rimuovere le diapositive e sciacquarle con acqua corrente per 5 minuti. NOTA: filtrare l&#39;ematoxilina prima di ogni utilizzo. </li><li> Posizionare le diapositive nell&#39;acido acetico glaciale del 1% per 30 secondi per favorire la differenziazione del colore e poi sciacquare nell&#39;acqua di rubinetto corrente per 1 minuto. </li><li> Aggiungere le diapositive a 1X PBS per 30 secondi fino a 1 min in blu le sezioni del tessuto, seguite da un risciacquo di 5 minuti in acqua di rubinetto e poi in alcool al 95% per 15-20 sec. </li><li> Conteggio con soluzione eosina da 30 a 1 min. Successivamente, disidratare le diapositive due volte nell&#39;etichetta fresca del 95%, seguita da due ripetizioni fresche in etanolo al 100%. Eseguire ogni lavaggio per 5 minuti. </li><li> Cancella le diapositive in xilene, con due cambiamenti in xilene per 5 minuti ciascuno. </li><li> CoverslipLa sezione tissutale con supporto di montaggio e asciugare piano a notte a temperatura ambiente. </li></ol>

<ol><li>Rudel, R. A., Fenton, S. E., Ackerman, J. M., Euling, S. Y., Makris, S. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Environmental+exposures+and+mammary+gland+development%3A+State+of+the+science%2C+public+health%2C+implications%2C+and+research+recommendations%5BTitle%5D)+AND+%22Environ+Health+Perspect%22%5BJournal%5D)">Environmental exposures and mammary gland development: State of the science, public health, implications, and research recommendations.</a> Environ Health Perspect. 119 (8), 1053-1061 (2011).</li>
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Gli autori non hanno interessi conflittuali da dichiarare in relazione alla ricerca, alla pubblicazione e / o alla pubblicazione di questo articolo.

Il supporto integrale della ghiandola mammaria è un potente strumento che può essere utilizzato per illustrare lo sviluppo normale del mammifero e le alterazioni morfologiche che possono sorgere e persistono dopo l&#39;esposizione a sostanze chimiche, inclusi i disgregatori endocrini. Quando un insieme completo e la sezione H &amp; E dello stesso animale vengono valutati insieme, possono fornire un&#39;istantanea precisa di alterazioni precoci, che possono avanzare in uno stato più malato. L...

Il montascale mammario è un metodo utile e poco costoso, realizzato in molti studi su ratti e mouse, per comprendere sia lo sviluppo anomalo normale che chimico-indotto. In generale, una ghiandola mammaria raccolte a vari stadi durante lo sviluppo roditore (cioè, l&#39;adolescenza, pubertà, metà a fine gestazione, e la fase di involuzione) mostrerà cambiamenti morfologici nel tessuto e architettura cellulare influenzato da paracrino, endocrini, e fattori autocrini 1 . Nel ratto di invecchiamento, le porzioni epiteliali e stromali della ghiandola diventano sempre più densi, rendendo difficili i parametri morfologici di misura in un intero monte. Quindi, è pratica comune raccogliere una ghiandola per la valutazione istologica per identificare i cambiamenti a livello microscopico. Entrambi i processi sono particolarmente utili in studi che implicano esposizione chimica ( cioè ambientale o farmaceutica) o per esaminare i cambiamenti morfologici accompagnati da alterazioni genetichezioni. Le tecniche e le capacità di utilizzare la ghiandola mammaria nella valutazione del rischio continuano ad evolversi. Mentre la preparazione a tutto montaggio è routine e standardizzata, le modifiche alla sezione continuano 2 , 3 . Molti gruppi di ricerca di diversi ambiti (ad esempio, università, governo e industria) hanno adattato le sezioni coronali / longitudinali del tessuto mammario come un metodo preferito, mentre alcuni laboratori utilizzano ancora sezioni trasversali attraverso la pelle 4 . Quest&#39;ultimo metodo produce un&#39;incredibile rappresentazione dell&#39;epidermide (pelle), anziché del tessuto di interesse: l&#39;epitelio della ghiandola mammaria 2 . Le sezioni coronali o longitudinali sono più utili per caratterizzare il tessuto normale 5 e migliorare notevolmente la rilevazione di anomalie e lesioni dovute all&#39;aumento della superficie e al numero di strutture presenti. Nel complesso, questo rende tutto il moUn metodo adeguato per la valutazione comparativa istopatologica della ghiandola mammaria 1 , 2 . Sia che si utilizzi un topo o un ratto, il recupero e conservazione del 4 ° e 5 ° ghiandole inguinali è altamente raccomandato per il confronto di tutta montare una sezione controlaterale H &amp; E. Se utilizzati in combinazione, la sezione H &amp; E e l&#39;intero supporto forniscono un accurato esame dei cambiamenti cellulari e morfologici indotti dall&#39;esposizione ambientale. Ciò è particolarmente vero in alcuni ceppi di roditori in cui il modello possiede una bassa suscettibilità alla formazione del tumore o un tumore non è grossolanamente visibile. In alcune circostanze, l&#39;ottenimento del tessuto richiesto può non essere sempre possibile utilizzando entrambe le tecniche ( ossia quantità insufficiente di tessuti, risorse o risultati sperimentali inaspettati). Nel nostro caso, anomalie sono state osservate nel montante intero mammario, mentre istopatoI risultati logici nella ghiandola H &amp; E contralaterale erano per lo più normali. La divergenza enorme tra le ghiandole contralaterali ci ha portati a sviluppare una procedura economica ed efficiente per individuare le anomalie in tutti i montanti. Utilizzando una procedura di trasformazione e di incorporazione modificata, le sezioni trattate con H &amp; E di alta qualità sono state preparate da supporti interamente incorporati in paraffina. Immaginiamo che questo protocollo diventi uno strumento di rilevazione potente per gli effetti di esposizione chimica, migliorando i confronti tra laboratori.

<table><tbody><tr><td>Xilene</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>214736</td><td></td></tr><tr><td>Permount</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>SP15-100</td><td>supporti di montaggio per il montaggio di montature intere e H& </td></tr><tr><td>Processore automatizzato Leica</td><td>Biosystems Modello</td><td># ST5020</td><td></td></tr><tr><td>HM 355S Microtomo automatico</td><td>Thermo Fisher Scientific&nbsp;</td><td>905200</td><td></td></tr><tr><td>Paraffina</td><td>Leica Biosystems</td><td>EM-400</td><td></td></tr><tr><td>Superfrost plus vetrini per microscopio</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>4951PLUS-001</td><td>caricato elettrostaticamente</td></tr><tr><td>Fisher Finest 24x60x1</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>12-548-5P</td><td>vetrini coprioggetti</td></tr><tr><td>Varistain Gemini ES Coloratore automatico per vetrini</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>A78000014</td><td></td></tr><tr><td>Sta-On</td><td>Leica Biosystems</td><td>3803107</td><td>adesivo liquido; utilizzato a bagnomaria durante il sezionamento</td></tr><tr><td>Ematossilina Harris modificata 72711</td><td>Richard-Allan Scientific (parte di Thermo Scientific)</td><td>72711</td><td></td></tr><tr><td>Eosin</td><td>Leica Biosystems</td><td>3801600</td><td></td></tr><tr><td>Carbonato di litio</td><td>SkyTech Laboratories</td><td>LCQ500</td><td></td></tr><tr><td>Acido acetico glaciale</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>A38-500</td><td>necessario nel fissativo di Carnoy</td></tr><tr><td>Cloroformio</td><td>Macron Fine Chemicals</td><td>4440-04</td><td>necessario nel fissativo di Carnoy</td></tr><tr><td>100% Etanolo</td><td>The Warner Graham Company</td><td>6505001050000</td><td>necessario nel fissativo di Carnoy e vetrini di lavaggio</td></tr><tr><td>95% Etanolo</td><td>The Warner Graham Company</td><td>6505011137320190</td><td></td></tr><tr><td>Carmine Alum</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C1022-25G</td><td></td></tr><tr><td>Solfato di alluminio e potassio dodecaidrato, Sigma Ultra</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A7210-500G</td><td></td></tr><tr><td>Tampone di lavaggio per automazione, 20X</td><td>Biocare Medical</td><td>TWB945</td><td></td></tr></tbody></table>

sezione delle ghiandole mammarie per tutti gli attacchi per identificazione delle lesioni

Sectioning Mammary Gland Whole Mounts for Lesion Identification

Lo sviluppo della ghiandola mammaria normale può essere alterato dall&#39;esposizione a tossiche ambientali e ai prodotti farmaceutici, esposizione eccessiva agli ormoni e alterazioni genetiche. I supporti interiori della ghiandola mammaria sono un metodo poco costoso per catturare la progressione dei cambiamenti morfologici che possono sorgere dopo l&#39;esposizione. Tuttavia, nella vita successiva, quando le anomalie sono più inclini a svilupparsi, la sola dipendenza da questo metodo può non fornire sempre informazioni sufficienti per fare una corretta diagnosi dell&#39;anomalia. Storicamente, negli studi di orientamento chimico della prova, una singola ghiandola mammaria viene rimossa in necrosi e preparata come una sezione ematossilina e eosina (H &amp; E). L&#39;incorporazione della raccolta e dell&#39;analisi contralaterale di mammiferi integrali diminuisce la probabilità di una valutazione falsa-negativa. La valutazione dell&#39;intero supporto è limitata dalla presenza di una o due intere ghiandole mammarie su uno scivolo e in alcuni casi le anomalie osservate nell&#39;intero supporto non sonoT uniformemente rappresentato nella sezione H &amp; E. L&#39;obiettivo di questo studio è stato quello di sviluppare un protocollo per la conversione di supporti interni di mammary coperti in H &amp; E, in modo che le lesioni che altrimenti sarebbero state perdute o che sono difficili da diagnosticare possono essere identificate. Qui, abbiamo dettagliato un metodo per produrre una sezione H &amp; E di alta qualità incorporata in paraffina da una ghiandola mammaria inizialmente preparata come supporto intero. In confronto ad un tessuto che è stato intenzionalmente preparato per la sezione H &amp; E, l&#39;intero supporto richiede ulteriori preparazioni per la rimozione e l&#39;elaborazione dei tessuti. Tuttavia, questo metodo è considerato poco costoso, in quanto richiede comuni reagenti di laboratorio e poco tempo supplementare. Di conseguenza, questo metodo può fornire informazioni preziose su come le esposizioni chimiche e ambientali alterano il normale sviluppo mammario, oltre a visualizzare le modifiche che si verificano a causa di modifiche genetiche.

Questo metodo è efficace nell&#39;assistere le diagnosi che altrimenti potrebbero essere perse se l&#39;originale sezione H &amp; E del tampone mammario non ha mostrato alcun cambiamento istologico. Tuttavia, l&#39;esito sarà utile solo se si prende cura durante la preparazione iniziale a tutto tondo, come pure durante la preparazione del tessuto per la valutazione istologica. L&#39;incorporazione di paraffina fornirà protezione e contribuirà a preservare il tessuto per future sezioni. <...

Abbiamo sviluppato un metodo per eliminare, elaborare, tagliare e colorare con successo, per la valutazione istopatologica, il tessuto mammario che era stato originariamente fissato su diapositive come supporti interi. Questo metodo può promuovere la raccolta e la valutazione dei supporti integrali delle ghiandole mammarie negli studi di orientamento test riproduttivo e di sviluppo.

Sezione delle ghiandole mammarie per tutti gli attacchi per identificazione delle lesioni

Normal mammary gland development may be altered by exposure to environmental toxicants and pharmaceutical products, excessive exposure to hormones, and ...

L'obiettivo generale di questa procedura è ottenere sezioni colorate di alta qualità da tessuto mammario murino montato intero, per l'identificazione delle lesioni a livello microscopico. Questo metodo può contribuire a rispondere a domande fondamentali relative alla valutazione della ghiandola mammaria, come l'identificazione istopatologica dei tipi di lesione individuati macroscopicamente nei preparati interi della mammella. Il vantaggio principale di questa tecnica è che aumenta la probabilità di identificare lesioni che potrebbero essere presenti all'interno delle ghiandole mammarie quando si utilizzano tessuti montati interi.L'idea per questo metodo è nata quando abbiamo confrontato i fenotipi in montaggio intero con i referti di istopatologia per le ghiandole controlaterali dello stesso animale, fissate in formalina e colorate con ematossilina ed eosina. Abbiamo osservato una discordanza nelle diagnosi: erano evidenti più lesioni nei preparati in montaggio intero. La dimostrazione visiva di questo metodo è importante poiché le fasi di rimozione e inclusione in montaggio intero sono fondamentali per il successo della procedura.La ghiandola è delicata a causa della sua natura sottile e friabile. Dopo aver preparato i campioni di memoria in montaggio completo e aver analizzato il tessuto alla ricerca di anomalie secondo il protocollo descritto nel testo, rimuovere le copri-oggetti e il mezzo di montaggio immergendo i vetrini in un barattolo di vetro per colorazione riempito con xilene. Incubare tutta la notte o più a lungo.Trasferire i vetrini in xilene fresco e lasciare in ammollo i campioni per sei ore. Successivamente, trasferire nuovamente i campioni in xilene fresco e lasciare in ammollo tutta la notte. Poi, con una mano guantata, tenere il vetrino e utilizzare una pinzetta per rimuovere con cura il coprioggetto in un unico pezzo.Potrebbe esserci variabilità nella facilità di rimozione del vetrino coprioggetto a seconda dello spessore del mezzo di montaggio e del tempo trascorso da quando il preparato è stato coperto. Pertanto è fondamentale che il vetrino rimanga nello xilene fino a quando il coprioggetto non si stacca facilmente. Una volta rimosso il coprioggetto, utilizzare una lametta monouso affilata per rimuovere il campione facendo scorrere la lametta con un unico movimento lungo il vetrino.Quindi immergere rapidamente il cuscinetto adiposo in una capsula di Petri di vetro contenente xilene, per evitare che il tessuto si secchi all'aria. Utilizzare un rasoio per tagliare in due parti i tessuti di dimensioni maggiori. Successivamente, per minimizzare i danni al tessuto, utilizzare pinze con punta seghettata e punta arrotondata per afferrare il bordo del cuscinetto adiposo e posizionare le due metà con il lato superiore rivolto verso l'alto in due cassette separate e contrassegnate, adatte alle dimensioni del tessuto.Posizionare la cassetta in un contenitore di xilene per un massimo di due ore prima di inserirla nel processore di tessuti. Successivamente, caricare manualmente il numero massimo di cassette nel processore di tessuti. Prima di iniziare, programmare il processore per la lavorazione dei tessuti.Per automatizzare la procedura, selezionare la stazione, la temperatura e il vuoto su on. Automatizzare il processore per immergere le cassettes in xilene per 30 minuti a 37 gradi Celsius, seguito da un secondo bagno in xilene fresco nelle stesse condizioni. Successivamente, automatizzare il processore per rimuovere le cassettes dalla soluzione di xilene e trasferire i tessuti in una camera all'interno del processore contenente una miscela uno a uno di xilene e paraffina fusa impostata a 60 gradi Celsius per 30 minuti.Una volta completati tutti i passaggi, selezionare ok o inizia per procedere. Posizionare le cassetine nel serbatoio di un bagno di paraffina a 58 gradi celsius fino al momento di inserirle nello stampo. Rimuovere i coperchi delle cassetine per determinare la dimensione ottimale dello stampo per i tessuti.Aggiungere tre o quattro millimetri di paraffina fusa dal beccuccio allo stampo, quindi orientare il tessuto nella paraffina fusa in modo che la superficie del preparato intero della mammella, che era adiacente al fondo del vetrino e al fondo della cassetta, sia rivolta verso l'alto nello stampo. Trasferire lo stampo su una piastra di raffreddamento e regolare rapidamente il tessuto secondo necessità, in modo che risulti parallelo al fondo dello stampo. Utilizzando pinzette, posizionare saldamente la cassetta etichettata sulla parte superiore dello stampo.Distribuire ulteriore paraffina fusa nello stampo con un movimento continuo per coprire interamente la cassetta. Spostare lo stampo dalla piastra calda a una piastra fredda per favorire la fissazione nella posizione esatta scelta per la sezionatura. Quando il blocco di paraffina si è completamente solidificato, separare il blocco dallo stampo.E conservarla a temperatura ambiente fino al momento del taglio. Prima del taglio, incubare i blocchi di paraffina a meno 20 gradi Celsius per un'ora. Quindi preparare il microtomo accendendo il bagnomaria contenente acqua distillata fresca e regolare la temperatura tra 42 e 45 gradi Celsius.Successivamente, posizionare una nuova lama bassa sul microtomo e regolarla a quattro micrometri. Inserire il blocco nel microtomo con la paraffina rivolta verso la lama e allineata al piano verticale. Quindi inumidire una sezione di garza con acqua fredda e appoggiarla sul blocco per alcuni minuti.Tagliare il blocco ruotando la grande manopola in senso orario in combinazione con la manopola di avanzamento grossolano, fino a ottenere una sezione completa o rappresentativa del blocco. Trasferire quindi a mano la sezione di tessuto in un bagnomaria caldo prima di prelevarla con un vetrino pulito. Posizionare i vetrini su un supporto per l'essiccazione per rimuovere l'acqua in eccesso.Quindi conservare le sezioni di tessuto a 37 gradi Celsius durante la notte. Dopo aver rimosso i vetrini dall'incubatrice a 37 gradi Celsius, conservarli a temperatura ambiente fino al momento della colorazione. Per la colorazione automatica, selezionare H e E tra le opzioni di colorazione nel menu principale per colorare i vetrini.La disparaffinizzazione, la colorazione e la disidratazione vengono tutte completate sul coloratore automatico. Utilizzare un mezzo di montaggio e un coprioggetti per montare le sezioni. Per determinare lo spessore ideale del tessuto mammario sono state preparate sezioni di quattro micrometri e di sei micrometri.Le sezioni di quattro micrometri hanno prodotto risultati ottimali, in cui le aree epiteliali e stromali e i corrispondenti tipi cellulari sono stati facilmente distinguibili. Queste immagini rappresentano sezioni istologiche di ghiandole normali. Entrambe le ghiandole mostrano strutture duttali circondate da una popolazione ricca di adipociti, robusta e omogenea.Ogni dotto è rivestito da un singolo strato di cellule epiteliali cuboidali semplici ed è mantenuto da un secondo strato di cellule basali. I preparati interi del lato controlaterale presentavano un'area di opacità aumentata che coinvolgeva i dotti delle ghiandole della memoria. Tuttavia, non era chiaro se l'opacità fosse dovuta a una modificazione iperplastica, infiammatoria o neoplastica.Vengono mostrati qui preparati interi controlaterali. Queste sezioni sono state diagnosticate come infiammazione perivascolare a causa dell'aumentato numero di linfociti attorno a un grosso vaso sanguigno nella sezione delle ghiandole mammarie. In questi campioni, l'architettura lobulare della ghiandola mammaria era mantenuta, ma risultava ingrandita a causa dell'aumento del numero e delle dimensioni degli alveoli e dei dotti normali, riscontrabile nell'iperplasia alveolare lobulare.I lobuli ingranditi contenevano un numero aumentato di alveoli e dotti rivestiti da cellule epiteliali ben differenziate, spesso vacuolate, che formavano lumi contenenti un fluido proteico. Durante il tentativo di questa procedura, è importante ricordare che il tessuto è fragile a causa del xilene e potrebbe rompersi facilmente, distruggendo il campione. Si raccomanda di ottenere foto ad alta qualità dei preparati interi utilizzando uno scanner a piano prima di tentare questo metodo.Questa è un'opportunità per il campo della patologia tossicologica di orientarsi verso la valutazione di preparati interi per lo screening chimico. Così, quando vengono identificate lesioni a questo livello, ora è possibile produrre sezioni di alta qualità per la diagnosi istopatologica. Dopo aver visto questo video, si dovrebbe avere una buona comprensione di come rimuovere, includere e sezionare preparati interi della mammella per l'identificazione delle lesioni.Ricordare che, quando si lavora con xilene, è necessario indossare dispositivi di protezione come camici da laboratorio e guanti e che l'operazione deve essere eseguita sotto cappa.

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