Sviluppare corpi embrioni liberi del siero derivato da HiPSC per l'interrogazione di colture a cellule staminali a 3 dosi utilizzando saggi fisiologicamente rilevanti

L'obiettivo generale di questo protocollo per i corpi embrioidi liberi dal siero di iPSC umane 3D è quello di fornire un sistema in vitro che si avvicini allo sviluppo corticale precoce umano, che può essere utilizzato per la scoperta di farmaci. Questo metodo può aiutare a rispondere a domande chiave nel campo delle cellule staminali, come ad esempio come i neuroni derivano dalle iPSC, formano reti funzionali nei tessuti 3D. Il vantaggio principale di questa tecnica è che ci consente di modellare aspetti dello sviluppo corticale in un piatto, da tessuto umano contenente la genetica di individui malati, quindi il sistema funge da piattaforma cellulare per lo screening dei farmaci che è scalabile e può essere utilizzata per studiare molti diversi disturbi neurobiologici.

Sebbene questo metodo possa fornire informazioni sui disturbi neurobiologici o dello sviluppo neurologico, può essere applicato anche ad altri sistemi, come quelli che si concentrano su modelli di funzione neuroimmune o informazioni neurali. Per questo protocollo, inizia con la creazione di cellule fetali. Per stabilire questa coltura, piastrate 600.000 cellule fetali in ciascun pozzetto di una piastra a sei pozzetti, con 300 millilitri di terreno per pozzetto.

Dopo aver coltivato le cellule fetali per 48 ore, sostituire il terreno. Incubare le piastre per un'ora, mentre si preparano le cellule staminali. Scongelare le cellule staminali in un bagno d'acqua a 37 gradi Celsius.

Una volta scongelate, trasferire le cellule in una provetta conica da 15 millilitri e riempire la provetta fino a cinque millilitri con il terreno di coltura, aggiunto goccia a goccia. Successivamente, centrifugare delicatamente le cellule per quattro minuti, aspirare il surnatante e risospendere delicatamente il pellet in un millilitro di terreno di cellule staminali con inibitore ROCK. Dopo aver quantificato la densità cellulare, piastrate 300.000 cellule staminali sulle cellule di alimentazione.

Quindi crescere ed espandere le colture, selezionando periodicamente le cellule sane, dopo l'espansione e congelando le cellule per il backup. Far crescere le colonie di cellule staminali su piastre standard fino a raggiungere la confluenza dal 50% al 70%. Quindi, utilizzare un trattamento enzimatico delicato e una triturazione delicata con la punta della pipetta da un millilitro per raccogliere le hiPSC per la differenziazione delle cellule neuroprecursori.

Centrifugare delicatamente la sospensione, aspirare il surnatante e risospendere il pellet in un mezzo iPSC umano da cinque millilitri. Quindi, trasferire la sospensione cellulare in una piastra di coltura cellulare da cinque centimetri rivestita di gelatina allo 0,1% e incubare la piastra per un'ora. Dopo un'ora, trasferire le cellule non aderenti in una provetta da centrifuga da 15 millilitri.

Quindi sciacquare delicatamente la piastra con tre millilitri di terreno e trasferirla nello stesso tubo. Successivamente, ripetere la fase di risospensione con una centrifugazione delicata, quindi determinare la densità cellulare e piastrare le cellule in una piastra inferiore a V a 96 pozzetti a bassa adesione a 9.000 celle per pozzetto. Ora, gira la piastra per tre minuti e inizia a coltivare le cellule.

Nei successivi 14 giorni, a giorni alterni, sostituisci mezzo mezzo mezzo con uno medio differenziante fresco. Dopo due settimane di coltura delle cellule, preparare piastre a sei pozzetti con inserti per colture cellulari da 40 micron e un millilitro di terreno DM1. Incubare queste piastre per almeno quattro ore prima di aggiungere le cellule in coltura.

Successivamente, utilizzando un puntale per pipetta a bocca larga da 200 microlitri, raccogliere aggregati cellulari di due settimane per un valore di circa 20 microlitri di terreno. Trasferire da quattro a sei aggregati su ciascun inserto con una soluzione minima, rimuovere l'eccesso. Durante questa fase, è importante lavorare rapidamente e con una mano ferma, mentre si rimuove il fluido intorno agli SFEB, è possibile che gli SFEB si muovano attraverso la soluzione a causa della tensione superficiale.

Va bene riposizionarli dopo aver rimosso il mezzo. Una volta che tutti gli aggregati sono stati caricati sugli inserti, cambiare il terreno con un millilitro di DM2 e continuare a coltivare le cellule a giorni alterni. Sostituire i tre quarti del terreno con un prodotto fresco.

Dopo 14 giorni di coltura, iniziare ad aggiungere DM3 medium alle colture. Continuare la coltura per altri 16 giorni per far crescere gli SFEB. Staccare delicatamente gli SFEB dall'inserto, utilizzando un puntale per pipetta a bocca larga da 200 microlitri.

Trasferire gli SFEB in piastre da 12 pozzetti, caricando da quattro a otto per pozzetto. Quindi, colorali come contorno nel protocollo di testo. Per preparare i 12 pozzetti e gli otto piatti, lavarli prima tre volte con acqua sterile.

Quindi, lavateli una volta con etanolo al 75% e ancora una volta con etanolo al 100%. Quindi, cuocere le piastre a 50 gradi Celsius per quattro o cinque ore capovolte, per completare il processo di sterilizzazione. Dopo la cottura, aggiungere 500 microlitri di soluzione di PEI allo 0,2% in ogni pozzetto e lasciare riposare la piastra a temperatura ambiente per un'ora.

Quindi, aspirare il PEI e lavare i pozzetti quattro volte con l'acqua distillata sterile e asciugarli all'aria durante la notte. Il giorno successivo, preparare il laminante fresco in terreno L15 e aggiungere 10 microlitri al centro di ogni pozzetto. Quindi, aggiungere acqua distillata ai serbatoi circostanti per evitare l'evaporazione e incubare la piastra per un'ora a 37 gradi Celsius.

Assicurati di fasciare il laminante al centro degli elettrodi, facendo attenzione a non superare lo spazio degli elettrodi di messa a terra, se questo spazio viene superato, i neuroni cresceranno sopra gli elettrodi di messa a terra, causando artefatti di rumore e compromettendo la fedeltà della registrazione. Ora, aggiungere uno SFEB preparato in ciascun pozzetto, utilizzando un'aspirazione delicata con una pipetta a foro largo. Quindi, aggiungere 200 microlitri di DM2 a ciascun pozzetto e coltivare la piastra per una notte.

Successivamente, per registrare l'attività neurale, inserire una piastra nel lettore di piastre. Preriscaldalo a 37 gradi Celsius. Quindi, utilizzare il software per registrare 10 minuti di attività da ciascun pozzo.

SFEB viene coltivato utilizzando il metodo descritto, ha prodotto tessuto con caratteristiche morfologiche che assomigliano a una zona corticale sub-ventricolare in via di sviluppo precoce piena di estesi neuroni Tuj1 positivi, nonché neuroprogenitori. Numerose rosette corticali in via di sviluppo sono state osservate negli strati esterni e negli strati interni dei corpi. Il bordo esterno dei corpi assomiglia a una placca corticale in via di sviluppo contenente neuroni postmitotici, questo è supportato dall'espressione di Brn2, un marcatore per i neuroprogenitori e gli strati corticali esterni più ventralizzati.

Gli strati esterni contengono anche cellule Reelin positive che possono essere cellule gratzel casuali o i loro progenitori. I corpi esprimevano anche marcatori coerenti con l'origine mista degli immenanti gangliari codali e mediali. Basato sull'espressione di marcatori TF2 e Nkx2.1 cotti.

Gli SFEB in coltura producono interneuroni positivi sia per CalR che per CalB. Inoltre, i neuroni eccitatori VGLUT positivi e i progenitori neurali glutammatergici Tbr1 positivi. Coerentemente con altri rapporti, il 61% delle cellule dei corpi era VGLUT positivo e il 43% era Tbr1 positivo.

Le registrazioni MEM effettuate dai corpi possono essere effettuate per lunghi periodi di tempo e le registrazioni hanno mostrato lo sviluppo di uno scoppio a livello di rete corticale. Dopo aver visto questo video, dovresti avere una buona comprensione di come far crescere SFEB da iPSC umane, caratterizzare il contenuto neurule delle rosette corticali in via di sviluppo punitive con NSFEB. ed eseguire saggi neurofisiologici su SFEB in maturazione.

In generale, gli individui che non conoscono questo metodo potrebbero avere difficoltà perché ci vuole tempo e pratica per sviluppare il campo scientifico necessario affinché il comportamento delle iPSC e le iPSC arrivino ai neuroni in coltura. Le cellule coltivate devono essere monitorate quotidianamente. Dopo questa procedura, è possibile eseguire altri metodi come l'imaging del calcio per rispondere a ulteriori domande, come ad esempio quali trattamenti farmacologici potrebbero fare alle oscillazioni della rete corticale.