Campionamento non invasivo del rivestimento mucoso fluido per la quantificazione dei livelli di Immune-mediatore In Vivo delle vie respiratorie superiore
7 agosto 2017
Questo protocollo descrive una tecnica non invasiva per il campionamento del liquido di rivestimento mucoso indisturbati dalle vie respiratorie superiori. Può essere utilizzato per eseguire la quantificazione dei livelli in vivo dei mediatori di proteina, quali citochine e chemochine, in soggetti di tutte le età.
L'obiettivo generale di questo metodo di campionamento del fluido di rivestimento della mucosa è studiare la firma immunitaria locale delle vie aeree senza la necessità di procedure di stimolazione. Questo metodo consente di studiare le questioni chiave nell'area delle malattie respiratorie pediatriche come le infezioni, l'asma e le allergie. I vantaggi del metodo sono che è possibile misurare livelli molto bassi di mediatori immunitari nella mucosa delle vie aeree non stimolata in vivo.
La dimostrazione della procedura sarà effettuata dal Dr.Wolsk. Per la raccolta del campione nel neonato, tagliare prima almeno due strisce di tre per 15 millimetri da fogli filtranti in poliestere idrossilato fibroso. Quindi, posiziona il neonato su un letto e prendi nota di eventuali sintomi di infezione delle vie aeree.
Quindi, usa una pinza per inserire un pezzo di carta da filtro di circa un centimetro nella parte anteriore del turbinato inferiore di ciascuna narice del bambino e somministrare acqua zuccherata al neonato per il massimo comfort, se necessario. Prendere nota di eventuali starnuti, pianti persistenti o epistassi che si verificano durante il periodo di campionamento. Dopo due minuti di assorbimento, trasferire le carte da filtro in un tubo etichettato per la conservazione immediata a una temperatura negativa di 80 gradi Celsius.
A dimostrare la procedura sperimentale sarà Lisbeth Rosholm, un tecnico del mio laboratorio. Per la quantificazione del mediatore immunitario delle vie aeree, posizionare su ghiaccio fino a 10 campioni da una temperatura negativa di 80 gradi Celsius e registrare i relativi numeri di identificazione. Quando i campioni si sono scongelati, immergere entrambe le carte da filtro per soggetto in 150 microlitri di tampone appena preparato per carta da filtro, integrati con una compressa completa di inibitore della proteasi per 25 millilitri di soluzione madre tampone.
Trasferire i campioni in un agitatore a piastre a 400 giri/min per cinque minuti. Trasferire il tampone e la carta da filtro nelle tazze dei singoli filtri in tubo di acetato di cellulosa. Centrifugare i campioni per raccogliere l'estratto nasale filtrato sul fondo delle provette per microcentrifuga.
Quindi, rimuovere le coppette e posizionare i tubi sul ghiaccio. Successivamente, trasferire 150 microlitri di aliquote di estratto nasale in pozzetti individuali di piastre di conservazione a basso legame proteico e conservare le piastre a una temperatura negativa di 80 gradi Celsius fino all'analisi. Quindi, misurare la concentrazione dei mediatori immunitari nasali di interesse mediante un array multiplexato basato sull'elettrochemiluminescenza ad alta sensibilità secondo i protocolli di analisi standard.
In questa analisi rappresentativa di 620 neonati, la maggior parte dei mediatori immunitari misurati ha dimostrato un basso livello di rilevamento. I livelli di IFN gamma erano al di sotto del limite di rilevamento inferiore in quasi la metà dei campioni, mentre i livelli di TNF alfa, CCL4 e TGF beta erano al di sotto del limite di rilevamento inferiore in meno dell'1% dei campioni. Una forte multicollinearità era evidente per i 20 livelli di mediatore rilevati, come illustrato dalla mappa di calore.
Nei neonati asintomatici infetti da picornavirus, è stato osservato un profilo sovraregolato compromesso principalmente dai mediatori immunitari di tipo 1, suggerendo un ruolo immuno-scatenante della colonizzazione di batteri e virus nella prima parte della vita. È stata inoltre determinata un'associazione tra la presenza di fratelli in casa alla nascita e una specifica risposta immunitaria diretta della mucosa di tipo 1 di tipo 17, con prove di correlazione di questo fenomeno con un effetto di priming immunitario in utero che è inversamente correlato al tempo trascorso dall'ultimo parto. Inoltre, i bambini nati da madri che ricevevano integratori ad alto contenuto di placebo erano caratterizzati da una sovraregolazione di specifici mediatori immunitari, suggerendo che la vitamina D promuove una risposta immunitaria antibatterica indipendente da quella indotta da virus, batteri, fratelli o atopia materna.
Questo metodo di microcampionamento può essere utilizzato anche attraverso un broncoscopio, consentendo di studiare i mediatori immunitari nelle vie aeree inferiori. Dopo aver visto questo video, dovresti avere una buona comprensione di come misurare i mediatori nella mucosa delle vie aeree non stimolata in vivo nei neonati e nei bambini più grandi.
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Panoramica
Questo protocollo descrive una tecnica non invasiva per il campionamento di fluido mucoso intatto dalle vie aeree superiori. Permette la quantificazione dei livelli in vivo di mediatori proteici, come citochine e chemochine, in soggetti di tutte le età.
Componenti Chiave dello Studio
Ambito Scientifico
- Malattie respiratorie
- Immunologia
- Pediatria
Sfondo
- Questo metodo studia la firma immunitaria locale delle vie aeree senza procedure di stimolazione.
- È applicabile a malattie respiratorie pediatriche come infezioni, asma e allergie.
- La tecnica consente la misurazione di basse concentrazioni di mediatori immunitari nella mucosa delle vie aeree non stimolata in vivo.
- La dimostrazione della procedura è effettuata dal Dott. Wolsk.
Scopo dello studio
- Studiare la risposta immunitaria nella mucosa delle vie aeree.
- Fornire informazioni sulle patologie respiratorie pediatriche.
- Facilitare tecniche di campionamento non invasive per la ricerca.
Metodi Utilizzati
- Prelevamento del fluido della mucosa dalle vie aeree superiori.
- Utilizzo di fogli filtranti in poliestere idrossilato fibroso per il prelievo dei campioni.
- Osservazione dei sintomi di infezione delle vie aeree nei neonati.
- Quantificazione di citochine e chemochine nei campioni raccolti.
Risultati principali
- Prelievo riuscito del fluido della mucosa senza procedure invasive.
- Capacità di misurare i mediatori immunitari in vivo.
- Informazioni sul profilo immunitario dei pazienti pediatrici.
- Potenziali applicazioni nella comprensione delle malattie respiratorie.
Conclusioni
- Il metodo di campionamento non invasivo è efficace per lo studio dell'immunità delle vie aeree.
- Questa tecnica può migliorare la ricerca sulla salute respiratoria pediatrica.
- Studi futuri potrebbero ampliare le scoperte relative ai mediatori immunitari.
Domande frequenti
Rilevanza Industriale del Progetto
Questo metodo non invasivo di campionamento del fluido della mucosa consente una quantificazione diretta degli immunomediatori in vivo nella mucosa delle vie aeree superiori senza stimolazione, fornendo un’indicazione fisiologicamente rilevante dell’attività immunitaria delle vie aeree. La tecnica permette il profilo immunitario nei primi stadi della vita e il monitoraggio longitudinale, facilitando la riduzione del rischio meccanicistica nello sviluppo di terapie respiratorie collegando esposizioni genetiche e ambientali ai fenotipi immunitari. La sua applicazione in coorti neonatali e pediatriche offre un valore predittivo per l’endotipizzazione e il monitoraggio dell’evoluzione della malattia, in particolare nei contesti di asma, allergia e malattie infettive.
Applicazioni Strategiche nella Ricerca e Sviluppo in Biopharma
Scoperta Precoce e Convalida del Target
- Valore scientifico: Permette l'analisi di ipotesi terapeutiche misurando i livelli basali e indotti di mediatori immunitari in tessuti mucosali non stimolati.
- Valore operativo: Fornisce una matrice riproducibile e minimamente invasiva per la validazione funzionale di bersagli in popolazioni pediatriche.
- Valore predittivo: Supporta la riduzione del rischio biologico attraverso la correlazione tra profili di mediatori e fenotipi clinici, come infezioni virali asintomatiche ed effetti dell'esposizione tra fratelli.
Sviluppo di screening e saggi
- Prontezza del saggio: Genera campioni di proteine eluite compatibili con matrici multiplex elettrochemiluminescenti ad alta sensibilità per il profilo immunitario quantitativo.
- Standardizzazione: Utilizza protocolli costanti di assorbimento e di eluizione su carta filtro per garantire un recupero riproducibile degli analiti tra soggetti e punti temporali.
- Scalabilità: Ha dimostrato fattibilità in ampie coorti neonatali (n=620), supportando applicazioni di screening ad alto rendimento in studi epidemiologici e interventistici.
Ricerca Translazionale e Preclinica
- Continuità traslazionale: Permette campionamenti longitudinali dalla nascita all'infanzia, collegando le firme immunitarie dell'età precoce agli esiti successivi di malattie respiratorie.
- Allineamento dei biomarcatori: Rileva l'upregolazione di mediatori immunitari di tipo 1 e di tipo 17 nei neonati asintomatici infettati dal picornavirus, suggerendo un'utilità nel riconoscimento di endotipi immunitari.
- Riduzione del rischio meccanicistico: Rivela associazioni tra la supplementazione materna di vitamina D e le risposte immunitarie antibatteriche, supportando la priorizzazione degli obiettivi per interventi immunomodulatori.
Integrazione di Pipeline e Flusso di Lavoro
Il metodo si inserisce nella fase di biologia della scoperta consentendo la misurazione diretta di mediatori immunitari in vivo, fornendo informazioni per la selezione del bersaglio e la chiarificazione del percorso prima dell'identificazione del capostazione.
- Biologia della scoperta: Supporta la verifica di ipotesi sull'attivazione dei percorsi immunitari nei tessuti mucosi senza manipolazioni o stimolazioni ex vivo che potrebbero introdurre artefatti.
- Screening: Produce eluati standardizzati adatti per letture mediante saggi immunoanalitici multiplex, facilitando l'analisi comparativa tra gruppi sottoposti a diversi trattamenti o esposizioni.
- Analisi: Genera livelli quantitativi di mediatori che consentono la valutazione statistica di collinearità, dell'attività delle reti immunitarie e delle associazioni con fenotipi.
- Ricerca traslazionale: Collega i profili immunitari neonatali ai sintomi respiratori nell'infanzia e alle esposizioni ambientali, sostenendo decisioni di avanzamento basate sulla stratificazione del rischio.
- Riutilizzo aziendale: Rappresenta una tecnica di campionamento compatibile con piattaforme, applicabile in diversi modelli di malattie respiratorie e modalità terapeutiche.
Impatto Operativo ed Aziendale
- Valore scientifico: Fornisce una previsione affidabile nella validazione degli obiettivi catturando l'attività immunitaria endogena nel microambiente mucosale nativo.
- Valore operativo: Garantisce la riproducibilità attraverso procedure standardizzate di raccolta, eluizione e conservazione, riducendo la variabilità pre-analitica.
- Valore strategico: Migliora le decisioni di avanzamento o interruzione dei progetti collegando i meccanismi immunomodulatori a firme immunitarie precoci, riducendo il rischio biologico in fase avanzata nei programmi respiratori.
- Impatto sul portafoglio: Permette una priorizzazione dei candidati aggiustata per il rischio, basata sugli effetti dimostrati sui percorsi immunitari mucosali in modelli umani pertinenti e longitudinali.
Considerazioni sull'Implementazione
- Richiede una formazione nell'anatomia delle vie aeree neonatali e nell'uso di tecniche di campionamento delicate per garantire il comfort del soggetto e l'integrità del campione.
- Dipende dalla disponibilità di tubi con filtro ultrafine, agitatori per piastre e infrastrutture per saggi immunoanalitici a chemiluminescenza elettrochimica per il rilevamento degli analiti.
- Necessita di una preparazione standardizzata del buffer con inibitori delle proteasi per prevenire il degrado dei mediatori durante l'estrazione.
- Richiede l'adattamento della durata del campionamento o delle dimensioni del filtro quando applicato a bambini più grandi o a siti mucosi alternativi.
- Limitato dall'abbondanza degli analiti, con alcuni mediatori spesso al di sotto del limite di rilevabilità, richiedendo un'ottimizzazione della sensibilità del saggio per bersagli a bassa espressione.
