Campionamento non invasivo del rivestimento mucoso fluido per la quantificazione dei livelli di Immune-mediatore In Vivo delle vie respiratorie superiore

L'obiettivo generale di questo metodo di campionamento del fluido di rivestimento della mucosa è studiare la firma immunitaria locale delle vie aeree senza la necessità di procedure di stimolazione. Questo metodo consente di studiare le questioni chiave nell'area delle malattie respiratorie pediatriche come le infezioni, l'asma e le allergie. I vantaggi del metodo sono che è possibile misurare livelli molto bassi di mediatori immunitari nella mucosa delle vie aeree non stimolata in vivo.

La dimostrazione della procedura sarà effettuata dal Dr.Wolsk. Per la raccolta del campione nel neonato, tagliare prima almeno due strisce di tre per 15 millimetri da fogli filtranti in poliestere idrossilato fibroso. Quindi, posiziona il neonato su un letto e prendi nota di eventuali sintomi di infezione delle vie aeree.

Quindi, usa una pinza per inserire un pezzo di carta da filtro di circa un centimetro nella parte anteriore del turbinato inferiore di ciascuna narice del bambino e somministrare acqua zuccherata al neonato per il massimo comfort, se necessario. Prendere nota di eventuali starnuti, pianti persistenti o epistassi che si verificano durante il periodo di campionamento. Dopo due minuti di assorbimento, trasferire le carte da filtro in un tubo etichettato per la conservazione immediata a una temperatura negativa di 80 gradi Celsius.

A dimostrare la procedura sperimentale sarà Lisbeth Rosholm, un tecnico del mio laboratorio. Per la quantificazione del mediatore immunitario delle vie aeree, posizionare su ghiaccio fino a 10 campioni da una temperatura negativa di 80 gradi Celsius e registrare i relativi numeri di identificazione. Quando i campioni si sono scongelati, immergere entrambe le carte da filtro per soggetto in 150 microlitri di tampone appena preparato per carta da filtro, integrati con una compressa completa di inibitore della proteasi per 25 millilitri di soluzione madre tampone.

Trasferire i campioni in un agitatore a piastre a 400 giri/min per cinque minuti. Trasferire il tampone e la carta da filtro nelle tazze dei singoli filtri in tubo di acetato di cellulosa. Centrifugare i campioni per raccogliere l'estratto nasale filtrato sul fondo delle provette per microcentrifuga.

Quindi, rimuovere le coppette e posizionare i tubi sul ghiaccio. Successivamente, trasferire 150 microlitri di aliquote di estratto nasale in pozzetti individuali di piastre di conservazione a basso legame proteico e conservare le piastre a una temperatura negativa di 80 gradi Celsius fino all'analisi. Quindi, misurare la concentrazione dei mediatori immunitari nasali di interesse mediante un array multiplexato basato sull'elettrochemiluminescenza ad alta sensibilità secondo i protocolli di analisi standard.

In questa analisi rappresentativa di 620 neonati, la maggior parte dei mediatori immunitari misurati ha dimostrato un basso livello di rilevamento. I livelli di IFN gamma erano al di sotto del limite di rilevamento inferiore in quasi la metà dei campioni, mentre i livelli di TNF alfa, CCL4 e TGF beta erano al di sotto del limite di rilevamento inferiore in meno dell'1% dei campioni. Una forte multicollinearità era evidente per i 20 livelli di mediatore rilevati, come illustrato dalla mappa di calore.

Nei neonati asintomatici infetti da picornavirus, è stato osservato un profilo sovraregolato compromesso principalmente dai mediatori immunitari di tipo 1, suggerendo un ruolo immuno-scatenante della colonizzazione di batteri e virus nella prima parte della vita. È stata inoltre determinata un'associazione tra la presenza di fratelli in casa alla nascita e una specifica risposta immunitaria diretta della mucosa di tipo 1 di tipo 17, con prove di correlazione di questo fenomeno con un effetto di priming immunitario in utero che è inversamente correlato al tempo trascorso dall'ultimo parto. Inoltre, i bambini nati da madri che ricevevano integratori ad alto contenuto di placebo erano caratterizzati da una sovraregolazione di specifici mediatori immunitari, suggerendo che la vitamina D promuove una risposta immunitaria antibatterica indipendente da quella indotta da virus, batteri, fratelli o atopia materna.

Questo metodo di microcampionamento può essere utilizzato anche attraverso un broncoscopio, consentendo di studiare i mediatori immunitari nelle vie aeree inferiori. Dopo aver visto questo video, dovresti avere una buona comprensione di come misurare i mediatori nella mucosa delle vie aeree non stimolata in vivo nei neonati e nei bambini più grandi.