Campionamento non invasivo del rivestimento mucoso fluido per la quantificazione dei livelli di Immune-mediatore In Vivo delle vie respiratorie superiore
August 7th, 2017
Questo protocollo descrive una tecnica non invasiva per il campionamento del liquido di rivestimento mucoso indisturbati dalle vie respiratorie superiori. Può essere utilizzato per eseguire la quantificazione dei livelli in vivo dei mediatori di proteina, quali citochine e chemochine, in soggetti di tutte le età.
L'obiettivo generale di questo metodo di campionamento del fluido di rivestimento della mucosa è studiare la firma immunitaria locale delle vie aeree senza la necessità di procedure di stimolazione. Questo metodo consente di studiare le questioni chiave nell'area delle malattie respiratorie pediatriche come le infezioni, l'asma e le allergie. I vantaggi del metodo sono che è possibile misurare livelli molto bassi di mediatori immunitari nella mucosa delle vie aeree non stimolata in vivo.
La dimostrazione della procedura sarà effettuata dal Dr.Wolsk. Per la raccolta del campione nel neonato, tagliare prima almeno due strisce di tre per 15 millimetri da fogli filtranti in poliestere idrossilato fibroso. Quindi, posiziona il neonato su un letto e prendi nota di eventuali sintomi di infezione delle vie aeree.
Quindi, usa una pinza per inserire un pezzo di carta da filtro di circa un centimetro nella parte anteriore del turbinato inferiore di ciascuna narice del bambino e somministrare acqua zuccherata al neonato per il massimo comfort, se necessario. Prendere nota di eventuali starnuti, pianti persistenti o epistassi che si verificano durante il periodo di campionamento. Dopo due minuti di assorbimento, trasferire le carte da filtro in un tubo etichettato per la conservazione immediata a una temperatura negativa di 80 gradi Celsius.
A dimostrare la procedura sperimentale sarà Lisbeth Rosholm, un tecnico del mio laboratorio. Per la quantificazione del mediatore immunitario delle vie aeree, posizionare su ghiaccio fino a 10 campioni da una temperatura negativa di 80 gradi Celsius e registrare i relativi numeri di identificazione. Quando i campioni si sono scongelati, immergere entrambe le carte da filtro per soggetto in 150 microlitri di tampone appena preparato per carta da filtro, integrati con una compressa completa di inibitore della proteasi per 25 millilitri di soluzione madre tampone.
Trasferire i campioni in un agitatore a piastre a 400 giri/min per cinque minuti. Trasferire il tampone e la carta da filtro nelle tazze dei singoli filtri in tubo di acetato di cellulosa. Centrifugare i campioni per raccogliere l'estratto nasale filtrato sul fondo delle provette per microcentrifuga.
Quindi, rimuovere le coppette e posizionare i tubi sul ghiaccio. Successivamente, trasferire 150 microlitri di aliquote di estratto nasale in pozzetti individuali di piastre di conservazione a basso legame proteico e conservare le piastre a una temperatura negativa di 80 gradi Celsius fino all'analisi. Quindi, misurare la concentrazione dei mediatori immunitari nasali di interesse mediante un array multiplexato basato sull'elettrochemiluminescenza ad alta sensibilità secondo i protocolli di analisi standard.
In questa analisi rappresentativa di 620 neonati, la maggior parte dei mediatori immunitari misurati ha dimostrato un basso livello di rilevamento. I livelli di IFN gamma erano al di sotto del limite di rilevamento inferiore in quasi la metà dei campioni, mentre i livelli di TNF alfa, CCL4 e TGF beta erano al di sotto del limite di rilevamento inferiore in meno dell'1% dei campioni. Una forte multicollinearità era evidente per i 20 livelli di mediatore rilevati, come illustrato dalla mappa di calore.
Nei neonati asintomatici infetti da picornavirus, è stato osservato un profilo sovraregolato compromesso principalmente dai mediatori immunitari di tipo 1, suggerendo un ruolo immuno-scatenante della colonizzazione di batteri e virus nella prima parte della vita. È stata inoltre determinata un'associazione tra la presenza di fratelli in casa alla nascita e una specifica risposta immunitaria diretta della mucosa di tipo 1 di tipo 17, con prove di correlazione di questo fenomeno con un effetto di priming immunitario in utero che è inversamente correlato al tempo trascorso dall'ultimo parto. Inoltre, i bambini nati da madri che ricevevano integratori ad alto contenuto di placebo erano caratterizzati da una sovraregolazione di specifici mediatori immunitari, suggerendo che la vitamina D promuove una risposta immunitaria antibatterica indipendente da quella indotta da virus, batteri, fratelli o atopia materna.
Questo metodo di microcampionamento può essere utilizzato anche attraverso un broncoscopio, consentendo di studiare i mediatori immunitari nelle vie aeree inferiori. Dopo aver visto questo video, dovresti avere una buona comprensione di come misurare i mediatori nella mucosa delle vie aeree non stimolata in vivo nei neonati e nei bambini più grandi.
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Panoramica
Questo protocollo descrive una tecnica non invasiva per campionare il fluido del rivestimento mucosa non disturbato delle vie aeree superiori. Permette la quantificazione dei livelli in vivo di mediatori proteici, come citochine e chemochine, in soggetti di tutte le età.
Componenti chiave dello studio
Area della scienza
- Malattie respiratorie
- Immunologia
- Pediatria
Contesto
- Questo metodo studia la firma immunitaria locale delle vie aeree senza procedure di stimolazione.
- È applicabile alle malattie respiratorie pediatriche come infezioni, asma e allergia.
- La tecnica permette la misurazione di bassi livelli di mediatori immunitari nella mucosa delle vie aeree non stimolata in vivo.
- La dimostrazione della procedura è condotta dal Dr. Wolsk.
Obiettivo dello studio
- Indagare la risposta immunitaria nella mucosa delle vie aeree.
- Fornire informazioni sulle condizioni respiratorie pediatriche.
- Facilitare tecniche di campionamento non invasive per la ricerca.
Metodi utilizzati
- Raccolta del fluido del rivestimento mucosa dalle vie aeree superiori.
- Utilizzo di fogli filtranti in poliestere idrossilato fibroso per la raccolta dei campioni.
- Osservazione dei sintomi di infezione delle vie aeree nei neonati.
- Quantificazione di citochine e chemochine nei campioni raccolti.
Risultati principali
- Raccolta di successo del fluido del rivestimento mucosa senza procedure invasive.
- Capacità di misurare i mediatori immunitari in vivo.
- Informazioni sul profilo immunitario dei pazienti pediatrici.
- Possibili applicazioni nella comprensione delle malattie respiratorie.
Conclusioni
- Il metodo di campionamento non invasivo è efficace per studiare l'immunità delle vie aeree.
- Questa tecnica può migliorare la ricerca sulla salute respiratoria pediatrica.
- Studi futuri potrebbero ampliare le scoperte relative ai mediatori immunitari.
Domande frequenti
Executive Industry Relevance
This noninvasive mucosal lining fluid sampling method enables direct quantification of in vivo immune mediators in the upper airway mucosa without stimulation, providing a physiologically relevant readout of airway immune activity. The technique supports early-life immune profiling and longitudinal monitoring, facilitating mechanistic de-risking in respiratory therapeutic development by linking genetic and environmental exposures to immune phenotypes. Its application in neonatal and pediatric cohorts offers predictive value for endotyping and monitoring disease progression, particularly in asthma, allergy, and infectious disease contexts.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Enables interrogation of therapeutic hypotheses by measuring baseline and induced levels of immune mediators in unstimulated mucosal tissue.
- Operational Value: Provides a reproducible, minimally invasive matrix for functional target validation in pediatric populations.
- Predictive Value: Supports biological de-risking through correlation of mediator profiles with clinical phenotypes such as asymptomatic viral infection and sibling exposure effects.
Screening & Assay Development
- Assay Readiness: Generates eluted protein samples compatible with high-sensitivity electrochemiluminescence multiplex arrays for quantitative immune profiling.
- Standardization: Uses consistent filter paper absorption and elution protocols to ensure reproducible recovery of analytes across subjects and timepoints.
- Scalability: Demonstrated feasibility in large neonatal cohorts (n=620), supporting high-throughput screening applications in epidemiologic and interventional studies.
Translational & Preclinical Research
- Translational Continuity: Enables longitudinal sampling from birth through childhood, linking early-life immune signatures to later respiratory disease outcomes.
- Biomarker Alignment: Detects upregulation of type 1 and type 17 immune mediators in asymptomatic picornavirus-infected neonates, suggesting utility in identifying immune endotypes.
- Mechanistic De-risking: Reveals associations between maternal vitamin D supplementation and antibacterial immune responses, supporting target prioritization for immunomodulatory interventions.
Pipeline & Workflow Integration
The method fits within the discovery biology phase by enabling direct measurement of immune mediators in vivo, informing target selection and pathway elucidation prior to lead identification.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing of immune pathway activation in mucosal tissue without ex vivo manipulation or stimulation artifacts.
- Screening: Produces standardized eluates suitable for multiplex immunoassay readouts, facilitating comparative analysis across treatment or exposure groups.
- Analytics: Generates quantitative mediator levels that allow statistical assessment of collinearity, immune network activity, and phenotype associations.
- Translational Research: Connects neonatal immune profiles to childhood respiratory symptoms and environmental exposures, supporting risk-stratified advancement decisions.
- Enterprise Reuse: Represents a platform-compatible sampling technique applicable across respiratory disease models and therapeutic modalities.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Provides predictive confidence in target validation by capturing endogenous immune activity in the native mucosal microenvironment.
- Operational Value: Ensures reproducibility through standardized collection, elution, and storage procedures, minimizing pre-analytical variability.
- Strategic Value: Improves go/no-go decisions by linking immunomodulatory mechanisms to early-life immune signatures, reducing late-stage biological risk in respiratory programs.
- Portfolio Impact: Enables risk-adjusted prioritization of candidates based on demonstrated effects on mucosal immune pathways in relevant, longitudinal human models.
Implementation Considerations
- Requires training in neonatal airway anatomy and gentle sampling technique to ensure subject comfort and sample integrity.
- Dependent on access to ultrafilter tubes, plate shakers, and electrochemiluminescence immunoassay infrastructure for analyte detection.
- Necessitates standardized buffer preparation with protease inhibitors to prevent mediator degradation during extraction.
- Requires adaptation of sampling duration or filter size when applied to older children or alternative mucosal sites.
- Limited by analyte abundance, with some mediators frequently below detection limit, necessitating assay sensitivity optimization for low-expression targets.
