Predizione del silenziamento del gene attraverso il controllo spatiotemporale della siRNA rilasciata da nanocarrier polimerici sensibili alla foto

L'obiettivo generale di questi metodi è quello di non essere in grado di prevedere piccole efficienze di silenziamento genico mediate da RNA interferenti e facilitare il controllo dei livelli di espressione proteica risultanti, in modo spaziale e temporale. Questo metodo può chiarire struttura, funzione, relazioni e stimoli, veicoli di consegna reattivi. Ottenere un migliore controllo sul legame rispetto al rilascio può sbloccare piattaforme traducibili e la scoperta di farmaci, nonché tecnologie di medicina rigenerativa.

I principali vantaggi di questa tecnica sono che i cambiamenti nell'espressione genica possono essere controllati e previsti sulla base come un semplice saggio di rilascio di siRNA e modellazione cinetica. Sebbene questi metodi utilizzino nuovi polimeri foto-responsivi, questa serie di saggi può essere facilmente adattata per testare l'ampia varietà di altri sistemi sensibili agli stimoli. Per iniziare, preparare una soluzione di siRNA da 32 microgrammi per millilitro, aggiungendo siRNA a una soluzione HEPES da 20 micromolari a pH sei.

Quindi, preparare una soluzione polimerica aggiungendo i polimeri polyAPN BMA a blocchi mPEG disciolti a una soluzione HEPES da 20 millimolari a pH sei. Per raggiungere una concentrazione di 220 microgrammi per millilitro, questa concentrazione si tradurrà in un rapporto N / P di quattro, il che significa che ci saranno quattro volte più gruppi amminici sul polimero rispetto ai gruppi fosfato su siRNA. Quindi, aggiungere la soluzione polimerica goccia a goccia a un volume uguale della soluzione di siRNA, mescolando delicatamente su una macchina a vortice.

Continuare a vorticare per 30 secondi dopo l'aggiunta del polimero. Quindi, incubare i campioni al buio a temperatura ambiente per 30 minuti. Aggiungere la soluzione STS a ciascuna soluzione di nanocarrier goccia a goccia, mescolando delicatamente su una macchina a vortice.

Continuare a vorticare per 30 secondi dopo l'edizione SDS. Centrifugare i campioni a 3.000 g per cinque secondi, quindi incubare i campioni al buio a temperatura ambiente per 30 minuti. Calibra e imposta un laser UV con un filtro a 365 nanometri a un'intensità di 200 watt per metro quadrato.

Quindi, praticare un foro in una guarnizione di gomma, posizionare la guarnizione di gomma su un vetrino lavato e asciugato. Pipettare la soluzione nanocarrier SDS sul vetrino all'interno del foro della guarnizione in gomma. Caricare un eccesso di soluzione sul vetrino, evitando il contatto con la guarnizione in gomma.

Posizionare il secondo vetrino sopra la guarnizione del vetrino. Per evitare la generazione di bolle d'aria, posizionare prima un'estremità del carrello verso il basso e poi abbassare lentamente l'altra estremità. Fissare le clip del raccoglitore su ciascun lato della camera di vetro per tenerla chiusa.

Irradiare i campioni per il periodo di tempo desiderato, utilizzando il laser UV con il filtro a 365 nanometri a un'intensità di 200 watt per metro quadrato. Rimuovere le clip del raccoglitore e aprire la camera. Quindi, pipettare 25 microlitri di campioni SDS nanocarrier irradiati su provette per microcentrifuga.

Incubare le soluzioni al buio a temperatura ambiente per 30 minuti. Aggiungere cinque microlitri della soluzione tampone di caricamento a 25 microlitri di ciascun campione di nanocarrier SDS. Incubare i campioni al buio a temperatura ambiente per 10 minuti.

Quindi, caricare 30 microlitri di ciascun campione di nanocarrier SDS in un gel di agarosio al 2%, pre-colorato con bromuro di etidio. Far funzionare il gel al buio a 100 volt per 30 minuti. Immagine del gel, utilizzando un sistema di imaging su gel con filtri al bromuro di etidio.

Salvare i file immagine del gel e procedere alla quantificazione dell'intensità di curvatura come descritto nel protocollo di testo. Rimuovere i pezzi di carta da un distanziatore biadesivo per esporre la superficie adesiva. Fissare il distanziatore a un vetrino coprioggetti.

Pipettare la soluzione nanocarrier SDS sul vetrino coprioggetto. Quindi, posizionare un vetrino prelavato sopra il vetrino coprioggetti con il foro del distanziatore adesivo, centrato attorno al campione. Spingere il vetrino per assicurarsi che il vetrino e il vetrino coprioggetti siano ben fissati e formino una tenuta.

Utilizzare un microscopio confocale con un obiettivo apercromico immersivo in acqua 40x, con un'apertura numerica di 1,2 per le misurazioni FCS. Utilizzare il canale laser di eccitazione appropriato per raccogliere almeno 30 misurazioni di 10 secondi ciascuna, per campione. Quindi, inserire i dati di rilascio di siRNA da FCS in un modello cinetico per prevedere le risposte di silenziamento genico, come dettagliato nel protocollo di testo.

Per preparare la somministrazione di siRNA in vitro, aggiungere prima due millilitri di sospensione cellulare a ciascun pozzetto della piastra a sei pozzetti. Lasciare aderire e recuperare le cellule per 24 ore nell'incubatrice. Dopo aver lavato le cellule con soluzione fisiologica tamponata con fosfato, prepararle per la trasvezione aggiungendo 1,5 millilitri di siero e terreno di transvezione privo di antibiotici.

Quindi, aggiungere 25 microlitri di soluzione di nanocarrier, contenente 30 picomoli di siRNA per ogni pozzetto. Pipettare delicatamente il terreno su e giù per mescolare. Mettere le cellule nell'incubatore per tre ore.

Rimuovere il mezzo di trasvezione e lavare ogni pozzetto con PBS. Quindi, aggiungere un millilitro di terreno di coltura integrato e posizionare le cellule nell'incubatrice per recuperare per 30 minuti. Per preparare le cellule al trattamento con un fotostimolo, rimuovere il terreno di coltura integrato.

Quindi, aggiungere un millilitro di mezzo di trasvezione a ciascun pozzetto. Dopo aver calibrato il laser UV come descritto nel protocollo di testo, posizionare le celle su una piastra riscaldante impostata a 37 gradi Celsius. Rimuovere il coperchio dalla piastra a sei pozzetti.

Irradiare le celle da sopra la piastra per il tempo desiderato, utilizzando il laser UV con filtro a 365 nanometri ad un'intensità di 200 watt per metro quadrato. Rimuovere il mezzo di trasvezione e aggiungere due millilitri di terreno di coltura integrato. Mettere le cellule nell'incubatore fino a ulteriori analisi.

Per preparare una maschera fotografica che blocchi completamente la luce a 365 nanometri e riduca al minimo i riflessi, prima tagliare, punzonare e/o lavorare la forma desiderata nella maschera fotografica. Incollare la maschera fotografica sul fondo della piastra a sei pozzetti, con il motivo centrato sul pozzetto contenente le celle e il lato antiriflesso rivolto verso la piastra. Installa due supporti ad anello a circa 25 metri di distanza l'uno dall'altro e stacca una piattaforma da ciascun supporto ad anello, in modo che le piattaforme siano della stessa altezza.

Sospendere la piastra della cella tra i due supporti appoggiando la piastra sopra le piattaforme. Irradiare le cellule dal basso del campione per il tempo desiderato, utilizzando un laser UV con filtro a 365 nanometri, ad un'intensità di 200 watt per metro quadrato. Rimuovere il mezzo di trasvezione e aggiungere due millilitri di terreno di coltura integrato.

Quindi, mettere le cellule nell'incubatore per recuperare per almeno 24 ore. Visualizzare le cellule utilizzando la microscopia a fluorescenza come descritto in precedenza. Qui è mostrato un esempio di semplice modellazione cinetica delle dinamiche di silenziamento genico.

Il modello è stato eseguito per prevedere le concentrazioni di mRNA, proteine e siRNA, in funzione del tempo successivo al rilascio di siRNA fotoindotto. Le quantità relative di siRNA rilasciate a seguito di diversi dosaggi di luce, sono state inserite come concentrazione iniziale di siRNA nel modello cinetico. Le previsioni del modello risultante per i livelli di espressione proteica erano un accordo con i livelli di espressione determinati sperimentalmente ottenuti attraverso il western blotting.

Per la visualizzazione, le cellule che esprimono GFP sono state trattate con siRNA mirato a GFP e una fotomaschera anulare è stata posizionata sulla piastra prima dell'irradiazione per generare un pattern circolare. Le cellule che sono state protette dalla luce hanno mostrato un'intensità di fluorescenza indistinguibile dai campioni di controllo non trattati con siRNA e luce. Tuttavia, quasi tutte le cellule all'interno del modello circolare non hanno mostrato alcuna espressione di GFP, indicando un efficiente rilascio di siRNA e knockdown genico.

Inoltre, l'uso della luce è un fattore scatenante dell'espressione genica, da controllare su scale di lunghezza cellulare. In sintesi, questo metodo consente la rapida determinazione delle condizioni di irradiazione per controllare spazio-temporalmente il rilascio di siRNA e prevedere a priori il silenziamento genico. L'impiego di questo protocollo aiuterà a chiarire le relazioni struttura-funzione che regolano la stabilità e l'efficacia dei nanovettori.

Questa tecnica può consentire applicazioni nella medicina rigenerativa che richiedono il controllo spazio-temporale sull'espressione genica. Queste formulazioni sono anche adatte al trattamento di disturbi localizzati come il cancro della pelle, nonché di disturbi dermatologici.