Preparazione su media scala di Drosophila Estratti di embrioni per esperimenti proteomici

L'obiettivo generale di questo esperimento è quello di fornire un approccio semplice ed economico alla raccolta di embrioni di Drosofilia su media scala. E la preparazione di estratti proteici che possono essere utilizzati in applicazioni proteomiche a valle, come la spettrometria di massa per la purificazione di affinità. Questo metodo può aiutare a rispondere a domande chiave nel campo della segnalazione cellulare e della biologia dello sviluppo.

Ad esempio, come le proteine specifiche e le interazioni proteiche effettuano la comunicazione cellulare durante lo sviluppo dell'organismo. Il vantaggio principale di questa tecnica è che è un metodo facile ed economico per generare una lisi embrionale di Drosophila. Che può essere utilizzato per applicazioni a valle come la purificazione dell'affinità proteica.

Tradizionalmente, i ricercatori raccoglievano embrioni di Drosophila in gabbie di popolazione molto grandi. Ma presentiamo una procedura facile da usare per raccogliere embrioni in gabbie di medie dimensioni che possono essere facilmente allestite in qualsiasi laboratorio. Dopo aver preparato contenitori da cinque litri e tagliato quadrati di 25 per 25 centimetri di rete di nylon, secondo il protocollo di testo, posizionare la rete sopra il contenitore e premere con il coperchio.

Assicurarsi che la rete sia ben stretta e che il coperchio non sia inclinato. La gabbia è ora pronta per essere popolata da mosche. Dopo la preparazione di barattoli di plastica da un litro e quadrati di rete di nylon da 18 x 18 centimetri, posizionare la rete sul bordo superiore del barattolo e avvitare il coperchio per stringere.

Assicurati che la rete sia ben stretta e che il coperchio non sia inclinato. Amplificare le linee di mosca transgenica trasportano la proteina tipizzata di interesse. E trasferisci le bottiglie ogni due giorni fino a quando non si accumulano da 25 a 30 bottiglie per ogni lenza.

Amplifica un titolo di controllo in modo simile. Quindi, scalda i piatti di succo di mela a temperatura ambiente. Quindi, utilizzando un dito guantato, stendere un po' di pasta di lievito umido al centro dei piatti.

Facendo un cerchio di circa sei centimetri per un piatto di 15 centimetri. E un cerchio di quattro centimetri per un piatto da 10 centimetri. Dopo aver anestetizzato le mosche e averle trasferite nelle gabbie preparate con la rete rivolta verso il basso, coprire le gabbie con piatti di succo di mela.

Lascia che le mosche si sveglino. Quindi capovolgere le gabbie e incubare le mosche a temperatura ambiente per due o tre giorni. Cambiare le piastre due volte al giorno, capovolgendo la gabbia, e tenendo la piastra alla gabbia, staccare il nastro dalla piastra.

Picchietta delicatamente l'intera gabbia sulla panca e scambia rapidamente la vecchia piastra con una nuova, cercando di non permettere alle mosche di scappare. Lasciate che le mosche depongano gli embrioni su piatti di succo di mela freschi durante la notte o per qualsiasi altro periodo di tempo desiderato. La mattina seguente, contrassegnare e pesare i contenitori a rete per la raccolta degli embrioni.

Uno per ogni lenza utilizzata. Preparare 1 tampone di lisi in una provetta da 50 millilitri utilizzando reagenti precedentemente prodotti, aggiungendo 40 millilitri di acqua a 10 millilitri di 5 tampone di lisi concentrato in una provetta da 50 millilitri. Aggiungere 50 microlitri di un molare DTT a una concentrazione finale di un molare miliare.

Mescolare bene e dividere la soluzione in due provette da 50 millilitri. A una delle provette aggiungere una compressa di inibitore della proteasi. Posizionare il tubo su un rotatore a quattro gradi Celsius per 30 minuti.

Mentre la compressa si sta dissolvendo, inizia a raccogliere gli embrioni segnando le piastre di succo di mela sulle gabbie, con i genotipi delle linee di mosca utilizzate. E scambia i piatti con quelli freschi. Aggiungere abbastanza acqua da coprire ogni piatto di succo di mela.

Quindi, con un pennello morbido, rimuovere delicatamente gli embrioni dalla piastra. Versare gli embrioni nel contenitore a rete precedentemente pesato e contrassegnato e scolare l'acqua in eccesso. Quindi tamponare brevemente la rete su carta assorbente per rimuovere l'acqua in eccesso.

Per decoionare gli embrioni, riempire a metà una capsula di Petri di sei centimetri con il 50% di candeggina. Quindi preparare due piastre di Petri più grandi con acqua. Immergere il contenitore a rete con gli embrioni, in candeggina al 50% per 90 secondi.

Picchiettare delicatamente la rete durante l'incubazione un paio di volte, per sospendere gli embrioni nella soluzione di candeggina. Al termine dell'incubazione, utilizzare acqua per lavare il contenitore a rete in ciascuna delle due stoviglie, per circa 10 secondi. Quindi utilizzare 18,2 megaohm centimetri di acqua in un flacone a spruzzo, per sciacquare accuratamente il contenitore a rete, compresi i lati e l'esterno.

Nessun odore di candeggina deve essere rilevato dopo un lavaggio accurato. Tamponare il contenitore a rete su carta assorbente. Quindi pesare il contenitore a rete, con gli embrioni e sottrarre il peso del contenitore vuoto.

Registrare il peso risultante degli embrioni. Per preparare l'estratto embrionale, aggiungere un millilitro di tampone di lisi con inibitori della proteasi, a un omogeneizzatore di vetro Dounce e tenerlo in ghiaccio. Quindi trasferire gli embrioni dal contenitore a rete nell'omogeneizzatore.

Utilizzare un millilitro di tampone di lisi per lavare via gli embrioni rimanenti sulla rete. E aggiungere gli embrioni e il tampone al materiale nell'omogeneizzatore. Quindi lasciare che gli embrioni si depositino sul fondo dell'omogeneizzatore e aspirare con cura il surnatante.

Quindi, aggiungere il tampone di lisi con inibitori della proteasi all'omogeneizzatore, puntando a cinque o sei millilitri di tampone di lisi per grammo di embrioni. Quindi inserire un pestello largo per omogeneizzare gli embrioni con quattro o sei colpi. Durante i primi colpi, ci sarà più resistenza.

Cerca di muovere il pestello con un movimento continuo, per evitare schizzi di soluzione. Quindi passa a un pestello aderente. E omogeneizzare gli embrioni con 8-10 colpi.

Incubare l'omogeneizzante su ghiaccio per 20 minuti. Quindi trasferire l'omogeneizzante in provette da microcentrifuga. E centrifugare a 13.000 volte G e quattro gradi Celsius per 15 minuti.

Evitando i pellet nello strato lipidico superiore, trasferire i surnatanti in provette fresche per microcentrifuga su ghiaccio. Dopo aver ripetuto la centrificazione, utilizzare una punta da un millilitro per raccogliere con cura i surnatanti. E trasferiscili in siringhe refrigerate da 10 millilitri, con filtri da 045 micrometri attaccati.

Spingere tutta la soluzione in provette da microcentrifuga da due millilitri etichettate con ghiaccio. Congelare i campioni in azoto liquido e conservarli a una temperatura negativa di 80 gradi Celsius. Oppure utilizzare immediatamente per esperimenti di purificazione delle proteine.

Utilizzando il protocollo descritto in questo video, i lisati sono stati preparati da embrioni di Drosophila che esprimono ubiquitariamente la proteina EGFP-ERK, sotto il controllo del promotore del braccio odillo. L'espressione della proteina è stata confermata dal Western Blotting per la proteina ERK totale per rilevare simultaneamente i livelli di EGFP-ERK endogeno e transgenico, che migrano rispettivamente a 42 kilodalton e 69 kilodalton. Una singola banda, corrispondente a ERK endogena non marcata, è stata rilevata nella linea di controllo giallo bianco, confermando il successo dell'estrazione di ERK e EGFP-ERK dagli embrioni.

Per verificare se il protocollo di estrazione è adatto alla successiva purificazione delle proteine marcate, gli estratti delle mosche gialle bianche e delle mosche arm-EGFP-ERK sono stati sottoposti a purificazione per affinità, utilizzando perle di agarosio GFP. La colorazione all'argento dei campioni eseguiti su un gradiente SDS-PAGE, mostra una purificazione riuscita della proteina esca EGFP-ERK. Oltre a EGFP-ERK, la corsia sperimentale conteneva bande aggiuntive, non osservate nel campione di controllo, suggerendo che la purificazione ha recuperato potenziali proteine interagenti con ERK.

Una volta padroneggiato, il prelievo degli embrioni e le fasi di estrazione possono essere effettuate in circa due ore. Durante il tentativo di questa procedura è importante ricordarsi di eseguire le fasi di estrazione sul ghiaccio. E di utilizzare inibitori della proteasi per ridurre al minimo la degradazione delle proteine.

Dopo aver visto questo video, dovresti avere una buona comprensione di come allestire gabbie per la popolazione di Drosophila su media scala. E fare estratti di proteine di cellule intere da embrioni.