Metodi per l'estrazione di Endosymbionts dalla Whitefly Bemisia tabaci

L'obiettivo generale di questo esperimento è quello di estrarre endosimbionti da piccoli insetti per ulteriori esperimenti. Questo metodo può aiutare a rispondere a domande chiave dal punto di vista dell'entomologia e della macrobiologia perché la maggior parte degli endosimbionti non può essere coltivata in vitro. Il metodo mostra che isolare quantità adeguate di batteri per ulteriori esperimenti è molto importante.

Il vantaggio principale di questa tecnica è che possiamo isolare comodamente gli endosimbionti batterici della mosca bianca. Questo può essere applicato anche all'isolamento di endosimbionti da altri insetti come afidi, cavallette e tripidi. Per iniziare, raccogli una singola mosca bianca adulta e omogeneizzala in 30 microlitri di tampone di lisi.

Incubare l'omogeneizzato a 65 gradi Celsius per un'ora. Poi 100 gradi Celsius per 10 minuti. Utilizzando il DNA del moscerino bianco e i primer mitodondiali della citocromo ossidasi 1, preparare reazioni di PCR da 25 microlitri utilizzando i seguenti reagenti.

Quindi, eseguire le reazioni di PCR utilizzando il programma mostrato qui. Successivamente, utilizzare un kit di estrazione del gel di DNA seguendo il protocollo raccomandato per pulire il prodotto PCR. Quindi, eseguire l'analisi della sequenza secondo il protocollo di testo.

Per amplificare geni specifici di ciascun endosimbionte all'interno della mosca bianca, eseguire la PCR sul DNA della mosca bianca. Secondo un protocollo precedentemente pubblicato, sottoporre il campione amplificato all'elettroforesi e al sequenziamento su gel di agarosio per determinare le specie batteriche all'interno della mosca bianca e identificare il gene specifico di ciascun batterio. Per sezionare e purificare il batterioma della mosca bianca, aggiungere 100 microlitri di soluzione 1x PBS su un vetrino da microscopio.

Quindi, raccogli le ninfe del terzo o quarto stadio dalle foglie di cotone. E immergili nel PBS. Al microscopio, usa aghi entomologici sottili per estrarre i batteriomi dal corpo della mosca bianca.

Prestare attenzione quando si isola il batterioma poiché è piccolo e fragile. Praticare delicatamente un foro su un lato della ninfa e premere leggermente l'altro lato per far uscire i batteriomi. Quindi, montare un microloader da 20 microloader su una pipetta da 0,5 a 10 microlitri ed estrarre il singolo batterioma dal PBS nel microloader.

Lavare il batterioma per eliminare la contaminazione di altri tessuti di mosca bianca pipettando il batterioma nel PBS ed estraendolo. Ripetere il lavaggio tre volte. Si consiglia vivamente di ripetere il lavaggio per eliminare il più possibile la contaminazione.

Pipettare immediatamente il batterioma lavato in una provetta da centrifuga contenente 60 microlitri di PBS. La siringa filtra il batterioma assemblato attraverso una membrana filtrante di cinque micrometri. Ripetere la filtrazione più volte per spostare completamente il liquido miscelato attraverso la membrana.

Per amplificare il filtrato, preparare il tampone D2 da utilizzare con il protocollo raccomandato per l'amplificazione del DNA genomico da sangue o cellule con alcune modifiche. Aggiungere direttamente 1,5 microlitri di filtrato a una provetta da centrifuga seguiti da 1,5 microlitri di tampone D2. Mescolare bene e incubare il campione su ghiaccio per 10 minuti. Quindi aggiungere 1,5 microlitri di soluzione di arresto.

Aggiungere 15 microlitri di tampone di reazione e un microlitro di DNA polimerasi e mescolare delicatamente. Incubare la miscela a 30 gradi Celsius per 16 ore, seguita da 65 gradi Celsius per tre minuti. Effettuare la PCR direttamente sul filtrato amplificato utilizzando primer specifici progettati per i batteri per confermare la specie batterica.

Condurre anche la PCR per confermare se c'è contaminazione dal genoma dell'ospite utilizzando primer per i geni della mosca bianca beta-actina ed EF1 secondo il metodo precedentemente pubblicato. Infine, eseguire il sequenziamento del metagenoma secondo il protocollo di testo. In questa figura sono mostrati il cotone per l'allevamento delle mosche bianche e diversi stadi di sviluppo delle mosche bianche.

Compreso un adulto e ninfe di primo, secondo e quarto stadio. L'analisi FISH degli endosimbionti Portiera e Hamiltonella all'interno della ninfa del quarto stadio di MEAM1 è mostrata qui. Si osserva una sovrapposizione dei due batteri ed entrambi sono confinati ai batteriociti della mosca bianca.

Qui sono mostrate le immagini al microscopio elettronico a trasmissione dell'endosimbionte di Portiera della mosca bianca che indicano che Portiera potrebbe perdere la sua parete cellulare. Dopo il sequenziamento e la pulizia dei dati di contaminazione per adattatori e duplicazioni, è stato acquisito il genoma completo del simbionte obbligato Portiera. Il risultato è un genoma circolare di 358.232 coppie di basi.

Inoltre, è stata ottenuta una bozza del genoma di Hamiltonella che includeva 138 contigs che sono stati assemblati in 89 scaffold basati su relazioni terminali accoppiate. Una volta padroneggiata questa tecnica, può essere eseguita in 20 ore se eseguita correttamente. Durante il tentativo di questa procedura, è importante ricordare di proteggere i campioni dalla contaminazione dei batteri ambientali.

Seguendo questa procedura, possono essere eseguite altre analisi come la sequenza AR e il batterioma di massa per rispondere a ulteriori domande come l'espressione genica e il metabolismo dell'endosimbionte. Dopo il suo sviluppo, questa tecnica ha aperto la strada ai ricercatori nel campo dell'entomologia e della microbiologia per esplorare la funzione degli endosimbionti negli insetti o negli artropodi. Dopo aver visto questo video, dovresti avere una buona comprensione di come estrarre i simbionti dai batteriomi degli insetti.

Non dimenticare che lavorare con alcuni dei reagenti può essere pericoloso e le precauzioni come indossare i guanti devono essere sempre prese durante l'esecuzione di questa procedura.