Microscopio fotoacustico acustico e ottico In Vivo Piccolo animale Blood Imaging di Vasculature

L'obiettivo generale di questa procedura è dimostrare un sistema di microscopia fotoacustica a risoluzione acustica e ottica commutabile per l'imaging in vivo della vascolarizzazione del sangue di piccoli animali. La microscopia fotoacustica è una modalità di imaging in vivo in rapida crescita che combina ottica e ultrasuoni, fornendo una profondità di imaging oltre il percorso ottico con un'alta risoluzione. Questo lavoro presente è un sistema microscopico fotoacustico a risoluzione ottica acustica commutabile in grado di eseguire immagini a risoluzione più elevata a profondità ridotte e immagini di tessuti profondi a bassa risoluzione dello stesso campione in vivo.

A dimostrare la procedura saranno il Dr. Mohesh Moothanchery, un ricercatore del mio laboratorio, e Arunima Sharma, una dottoranda del mio laboratorio. Innanzitutto, costruisci un sistema laser sintonizzabile a nanosecondi da un laser Nd:YAG a stato solido pompato a diodi e un laser dittabile con una portata da 559 a 576 nanometri. Impostare il laser dittabile su 570 nan.

Montare su un tavolo ottico un serbatoio in acrilico con una finestra di imaging in polietilene di sette centimetri nel pavimento del serbatoio. Fissare una piastra di imaging a un perno ottico sotto la finestra di imaging. Sopra il serbatoio, montare una gabbia ottica contenente il sistema di imaging AR-OR-PAM su una piastra di commutazione fissata a uno stadio di traslazione motorizzato a tre assi controllato da computer.

Per configurare il sistema per AR-PAM, utilizzare un prisma ad angolo retto montato su uno stadio rotazionale continuo motorizzato per dirigere il fascio attraverso un filtro a densità neutra variabile verso un cavo in fibra multimodale con un accoppiatore in fibra 25 NA. Collegare l'uscita in fibra a uno stadio di traslazione XY nel sistema di imaging. Dirigere il raggio attraverso una lente convessa piana a 25 millimetri dall'uscita, quindi attraverso una lente conica per creare un raggio a forma di anello.

Focalizzare il fascio a forma di anello su un condensatore ottico attorno a un trasduttore ultrasonico da 50 megahertz con una lente acustica montata all'uscita del trasduttore. Successivamente, per configurare il sistema per OR-PAM, ruotare il primo prisma ad angolo retto di 90 gradi per dirigere il raggio laser attraverso un iride, un filtro a densità neutra variabile, una lente del condensatore e un foro stenopeico posizionato a 75 millimetri dalla lente del condensatore. Utilizzare un accoppiatore in fibra monomodale da 1 NA e una fibra monomodale per inviare il fascio allo stadio di traslazione Z nel sistema di imaging.

Dirigere il fascio attraverso una lente doppietta acromatica montata a 50 millimetri dall'uscita della fibra. Deviare il fascio con uno specchio ellittico cinematico controllabile verso una seconda lente doppietta acromatica in un tubo dell'obiettivo. Focalizzare il fascio su un prisma ad angolo retto separato da uno strato di olio di silicio proveniente da un prisma romboidale, dotato di una lente acustica e di un trasduttore ultrasonico da 50 megahertz, che forma la testa di scansione OR-PAM.

Prima di iniziare l'allineamento del sistema, riempire i serbatoi acrilici con acqua degassata. Quindi utilizzare il tavolino motorizzato a tre assi per spostare il gruppo di scansione sul serbatoio. Abbassare il gruppo fino a quando le lenti acustiche di entrambi i sistemi non sono sommerse.

Accendi il laser. Collegare i trasduttori a ultrasuoni a due amplificatori a guadagno fisso da 25 decibel. Posizionare la testina di scansione AR-PAM sopra la finestra di imaging.

Posizionare un vetrino avvolto in nastro isolante nero sul tavolino di imaging e sollevare il tavolino per portare il vetrino a contatto con la finestra di imaging. Regolare la lente conica fino a quando l'ampiezza del segnale fotoacustico generato dal vetrino raggiunge un massimo, indicando che le lenti ottiche e acustiche sono confocali. Quindi passare manualmente al sistema OR-PAM.

Regolare la lente doppietta acromatica fino a quando le lenti ottiche e acustiche non sono confocali, come indicato massimizzando l'ampiezza del segnale fotoacustico dal vetrino coperto di nastro. Per determinare la risoluzione laterale di ciascun sistema, posizionare prima 1 millilitro di una soluzione diluita di nanoparticelle d'oro a 100 nanometri in acqua su un vetrino coprioggetti. Posizionare il vetrino sul tavolino di imaging.

e sollevare il tavolino fino a quando la soluzione di nanoparticelle non entra in contatto con la finestra di imaging. Passare il laser e la testa di scansione al sistema AR-PAM. Configura il software dello strumento per una scansione AR-PAM ed esegui una singola scansione raster.

Ripetere questa procedura per il sistema OR-PAM. Quindi rimuovere il vetrino e pulire la finestra di imaging con un tampone imbevuto di alcol. Adattare le funzioni di diffusione dei punti determinate dalle immagini acquisite a una curva gaussiana.

L'intera larghezza a metà del massimo è la risoluzione laterale per il sistema di scansione corrispondente. Successivamente, per determinare la massima profondità di imaging nel tessuto, inserire prima una piastra metallica affilata avvolta in nastro adesivo nero in una piccola sezione di tessuto di pollo con un angolo poco profondo. Posizionare il fazzoletto nel serbatoio dell'acqua sotto la testina dello scanner.

Ottenere una singola immagine B-scan per ogni sistema. Misurare la profondità sotto la superficie del tessuto alla quale il nastro nero non è più chiaramente distinguibile. Prima dell'immagine, assicurarsi che la finestra di imaging in polietilene e il tavolino di imaging dell'animale siano entrambi puliti.

Quindi procurarsi un topo femmina di 25 grammi di quattro settimane per la procedura di imaging dopo aver anestetizzato il topo. Rimuovere i peli dalla superficie dell'orecchio con una crema depilatoria. Applicare un unguento oculare sterile sugli occhi del topo per prevenire la secchezza e bloccare i raggi laser diffusi.

Posizionare il mouse su un tavolino di imaging con la piastra per posizionare l'orecchio verso di me ripresa. Monitora le condizioni fisiologiche del topo con un pulsossimetro fissato alla coda o alla zampa del topo. Applicare il gel per ultrasuoni sull'orecchio da riprodurre.

Sollevare lentamente il tavolino di imaging per portare delicatamente l'orecchio a contatto con la finestra di imaging in polietilene. Acquisisci scansioni raster AR-PAM e OR-PAM dell'orecchio del topo, monitorando lo stato fisiologico del topo durante tutto il tempo. Consentire al mouse di riprendersi completamente dopo l'imaging.

Il sistema vascolare del sangue di un topo è stato ripreso in vivo con un sistema AR-OR-PAM commutabile. I vasi sanguigni più spessi di 45 micrometri erano chiaramente visibili nell'immagine AR-PAM. Singoli capillari di circa cinque micrometri di larghezza sono stati risolti con l'imaging OR-PAM.

Il sistema combinato AR-OR-PAM ha una risoluzione laterale di circa quattro micron. E a punta, imaging da quattro mm per l'OR-PAM e una risoluzione laterale di circa 45 micrometri e un imaging da 7,8 mm per l'AR-PAM. Il sistema combinato AR-OR-PAM commutabile consente l'imaging senza spostare il campione tra diversi sistemi di imaging.

Il sistema sviluppato può essere utilizzato per l'imaging preclinico. Le principali applicazioni precliniche includono l'imaging dell'androgenesi, i microambienti tumorali, la microcircolazione, la risposta ai farmaci, la funzione cerebrale, i biomarcatori e le attività geniche.