Facile manipolazione delle architetture in idrogel a base di proteine per applicazioni della coltura delle cellule

L'obiettivo generale di questa metodologia è quello di creare idrogel macroporosi con pori di diverse dimensioni per applicazioni di coltura cellulare. Questo metodo può aiutare a rispondere a domande chiave nel campo della coltura cellulare 3D, come la fattibilità principale di un nuovo materiale idrogel per applicazioni di coltura cellulare 3D. Il vantaggio principale di questa metodologia è che offre una gamma di tecniche per ottimizzare e adattare un nuovo materiale alle esigenze di diversi tipi di cellule.

Per iniziare, diluire un milligrammo del peptide RGD o di un peptide adesivo cellulare equivalente in 100 microlitri di acqua sterile per ottenere la soluzione di 10 milligrammi per millilitro. Quindi, rimuovere il fondo di una piastra a 96 pozzetti e sostituirla con un involucro di plastica per la rimozione. Miscelare 100 microlitri di soluzione madre BSA e 100 microlitri di soluzione madre THPC nella piastra a 96 pozzetti per ottenere 200 microlitri di idrogel.

Miscelare i componenti pipettando su e giù almeno cinque volte per garantire un idrogel uniforme dopo la polimerizzazione. Posizionare la piastra a 96 pozzetti a temperatura ambiente per circa 10 minuti fino a quando tutti gli idrogel non saranno adeguatamente polimerizzati. Dopo la polimerizzazione, rimuovere con cautela e lentamente l'involucro di plastica dal fondo della piastra.

Estrarre gli idrogel dalla piastra a 96 pozzetti con una piccola pugnalata e trasferirli in provette da 1,5 millilitri con PBS sterile pH 7,4. Conservare gli idrogel in soluzione salina tamponata con fosfato a quattro gradi Celsius per un massimo di diversi mesi. Per liofilizzare gli idrogel, riempire prima le provette da 1,5 millilitri con 500 microlitri di acqua deionizzata sterile e rimuovere i tappi.

Trasferire gli idrogel nelle provette di reazione da 1,5 millilitri utilizzando una pinza. Avvolgere strettamente le provette da 1,5 millilitri con pellicola di paraffina utilizzando almeno tre strati per ogni flaconcino. Utilizzare un ago per praticare piccoli fori nella pellicola per consentire il rilascio del gas dai tubi.

Per garantire che l'acqua e l'idrogel si congelino completamente, trasferire la fiala in una soluzione di azoto liquido per cinque minuti. Subito dopo la rimozione dall'azoto liquido, trasferire le fiale nel liofilizzatore per evitare lo scongelamento del materiale. In alternativa, conservare le fiale a meno 20 gradi Celsius durante la notte per congelare lentamente gli idrogel.

Subito dopo la rimozione da meno 20 gradi Celsius, trasferire le fiale nel liofilizzatore per evitare che il materiale si scongeli. Dopo 24 ore e la completa evaporazione dell'acqua all'interno e intorno all'idrogel, scongelare il materiale rimuovendolo dal liofilizzatore. Per la lisciviazione delle particelle, mescolare i componenti dell'idrogel come prima.

Dopo la miscelazione, aggiungere immediatamente cloruro di sodio fino a saturazione. Aggiungere il sale fino a quando i cristalli di sale possono essere visti nella soluzione come un precipitato bianco. Le dimensioni dei pori possono essere modificate macinando i cristalli di sale prima dell'uso.

Trasferire la piastra a 96 pozzetti in uno shaker e agitare fino a quando non avviene la polimerizzazione. Dopo circa 10 minuti, rimuovere gli idrogel dalla piastra come prima. Incubare gli idrogel per almeno 24 ore a temperatura ambiente in acqua sterile su un rotatore per eluire tutto il sale dal modello di idrogel.

Conservare gli idrogel a quattro gradi Celsius in PBS per un massimo di diversi mesi. Per una formazione delicata, preparare gli idrogel come descritto. Quindi rimuovere un idrogel dalla soluzione usando una pinza.

Eliminate l'acqua in eccesso con carta altamente assorbente e posizionatela sopra un blocco di ghiaccio secco. Congelare l'idrogel per 30 secondi e rimuoverlo con cura dal blocco. Non danneggiare l'idrogel.

Usa con cura una spatola per raschiarlo dal blocco. Trasferire l'idrogel in un tubo da 1,5 millilitri e asciugarlo per una notte a 37 gradi Celsius. Preparare una soluzione madre di rodamina B e diluizioni seriali come descritto nel protocollo di testo.

Rimuovere l'idrogel dalla soluzione conservata e trasferirlo in una provetta da 1,5 millilitri con un millilitro di soluzione di rodamina B da 0,01 milligrammi per millilitro. Colorare l'idrogel per una notte in una soluzione di rodamina B a temperatura ambiente. Il giorno successivo, trasferire l'idrogel da visualizzare a 10 millilitri di PBS e lavare per almeno tre ore.

Tagliare delle piccole fette dall'idrogel usando una lama. Quindi trasferire l'idrogel su un vetrino microscopico a otto pozzetti e coprirlo con PBS. Utilizzando un microscopio a scansione laser confocale, visualizzare l'idrogel a una lunghezza d'onda di 514 nanometri.

Filtro sterile di tutte le soluzioni stock con un filtro da 0,45 micron. Iniziare la preparazione dell'idrogel e includere il peptide adesivo cellulare prima della polimerizzazione dell'idrogel. Dopo aver miscelato i componenti, pipettare immediatamente la miscela in un vetrino microscopico a otto pozzetti fino a coprire completamente il fondo.

Trasferire le cellule in un terreno di coltura cellulare DMEM sterile preriscaldato integrato con siero fetale bovino, penicillina, streptomicina e soluzione di aminoacidi non essenziali. Dopo aver contato le cellule con una camera di conteggio Neubauer, pipettare con cura 200 microlitri del numero di cellule desiderato sulla superficie dell'idrogel. Coprire il vetrino microscopico a otto pozzetti con un coperchio e trasferirlo in un'incubatrice.

Dopo almeno quattro ore di attacco cellulare, lavare le cellule due volte con 200 microlitri di PBS sterile per colture cellulari. Successivamente, fissare le celle con 200 microlitri di formaldeide al 3,7% per 10 minuti a temperatura ambiente e lavare due volte con PBS. Permeabilizzare le cellule con 200 microlitri di Triton X allo 0,1% per cinque minuti prima di lavare altre due volte con PBS.

Colorare le cellule con Toluidina Rodamina mescolando cinque microlitri di stock metanolico con 195 microlitri di PBS e aggiungendolo alle cellule a temperatura ambiente. Macchiare le celle per 20 minuti al buio prima di lavare due volte con PBS. Studiare le proprietà di adesione cellulare utilizzando un microscopio confocale a 514 nanometri.

Analizza le proprietà dell'idrogel come descritto nel protocollo di testo. Come mostrato qui, gli idrogel polimerizzati e colorati non hanno architetture distintive. Dopo la liofilizzazione degli idrogel a diverse temperature, la dimensione media dei pori all'interno dell'idrogel può essere estesa fino a 60 micron.

La lisciviazione salina si traduce in reti uniformi con dimensioni dei pori di circa 10 micron. La dimensione può essere ulteriormente regolata macinando i cristalli di sale prima dell'uso. L'uso di un approccio di congelamento in gradiente su un blocco di ghiaccio secco porta alla formazione di canali con un diametro di circa 20 micron e una lunghezza di diverse centinaia di micron.

Prima della funzionalizzazione con la porzione adesiva cellulare, le cellule non possono aderire alla superficie dell'idrogel e mostrano una morfologia rotonda. Solo dopo aver fornito al materiale il peptide adesivo cellulare, le cellule trovano punti di adesione focali che consentono una corretta adesione della cellula su un materiale. Questo è fondamentale per l'uso di nuovi materiali nelle applicazioni di coltura cellulare 3D.

Dopo aver visto questo video, dovresti avere una buona comprensione di come manipolare l'architettura di un idrogel con metodi semplici. Questo metodo può essere applicato alla maggior parte dei nuovi sistemi di idrogel per conoscere l'uso in coltura cellulare e per ottimizzare l'architettura dell'idrogel a seconda dell'uso previsto.