Agenti patogeni di origine alimentare Screening utilizzando Magneto-fluorescente nanosensore: Rilevazione rapida di e. Coli O157: H7

L'obiettivo principale di questo protocollo è progettare e sintetizzare nanosensori bimodali in grado di rilevare contaminanti batterici come E.coli O157:H7. I nanosensori magneto-fluorescenti vengono sintetizzati funzionalizzando nanoparticelle di ossido di ferro mediante una procedura in due fasi. In primo luogo, gli anticorpi mirati vengono coniugati alla superficie della nanoparticella.

Successivamente, un colorante fluorescente viene caricato nel suo codice. L'accoppiamento di queste modalità consente un rilevamento rapido e sensibile di contaminanti batterici sia in soluzioni poco concentrate che altamente concentrate. In presenza di una piccola quantità di batteri, i nanosensori si raggrupperanno attorno ai batteri grazie al targeting effettuato dagli anticorpi coniugati.

Questo movimento collettivo altera le interazioni tra il nucleo magnetico dei nanosensori e i protoni dell'acqua circostante, consentendo una rilevazione sensibile delle variazioni nei valori di rilassamento magnetico. All'aumentare della concentrazione di contaminanti batterici nelle soluzioni, il movimento collettivo diminuisce e la capacità della modalità magnetica di quantificare la contaminazione si riduce. Tuttavia, all'aumentare della concentrazione batterica aumenta anche l'emissione fluorescente dei bionanosensori.

È per questo motivo che l'accoppiamento di modalità magnetiche e fluorescenti risulta importante. Questa combinazione ha permesso di rilevare anche una sola unità formante colonie di E.coli O157:H7 in pochi minuti. Il primo passo nella sintesi dei nanosensori magneto-fluorescenti è la preparazione di una soluzione di sali di ferro contenente cloruro ferroso e cloruro ferrico.

Il ferro fornirà ai nanosensori un nucleo magnetico che ne permette l'adattabilità alle piattaforme di rilassamento magnetico. Le soluzioni aggiuntive necessarie sono l'acido poliacrilico e l'idrossido di ammonio. L'acido cloridrico viene aggiunto alla soluzione di sale di ferro, che successivamente viene versata nella soluzione di idrossido di ammonio sotto vortex.

Infine viene aggiunta la soluzione di acido poliacrilico e la miscela risultante viene vorticata per un'ulteriore ora mentre la reazione prosegue. La soluzione ottenuta viene centrifugata per far precipitare le molecole più grandi e isolare le nanoparticelle di dimensioni inferiori a 100 nanometri. Successivamente, la soluzione viene dializzata tutta la notte per la purificazione.

Il passaggio successivo è la coniugazione di anticorpi mirati al rivestimento in acido poliacrilico delle nanoparticelle di ossido di ferro appena sintetizzate. I materiali necessari includono tampone MES, EDC, NHS e gli anticorpi selezionati. L'EDC viene aggiunto per primo alla soluzione di nanoparticelle, seguito da NHS e infine dall'anticorpo.

La miscela viene quindi posta su un agitatore da banco per tre ore mentre la reazione prosegue. La soluzione viene purificata utilizzando una colonna magnetica. La colonna magnetizzata cattura le nanoparticelle, permettendo l'uscita solo agli anticorpi in libera dispersione.

Successivamente, la colonna viene lavata con tampone PBS e vengono raccolti i nanosensori coniugati. Le nanoparticelle sono quindi pronte per l'aggiunta del colorante fluorescente, che fornisce la seconda modalità fondamentale utilizzata per il rilevamento. Una delle caratteristiche più importanti del nostro nanosensore è la combinazione delle modalità magnetiche e fluorescenti, elemento cruciale per diversi motivi.

Innanzitutto, la combinazione delle modalità consente a ciascuna di verificare reciprocamente l'altra, riducendo notevolmente il rischio di falsi positivi e falsi negativi, uno dei maggiori ostacoli affrontati dalle diverse piattaforme diagnostiche oggi utilizzate. In secondo luogo, la combinazione delle modalità amplia notevolmente l'intervallo entro il quale possiamo non solo rilevare ma anche quantificare la contaminazione batterica. L'ultimo passaggio nella preparazione dei nanosensori è l'incapsulamento del colorante fluorescente nella codifica della nanoparticella.

Questo si ottiene semplicemente aggiungendo il colorante alla soluzione durante la vortexazione e successivamente lasciando ulteriore tempo affinché il colorante diffonda nel codice del nanosensore. I nanosensori completamente funzionalizzati vengono quindi dializzati un'ultima volta per la purificazione. Al fine di caratterizzare i nanosensori, dimensione ed emissione fluorescente vengono registrate utilizzando un zetasizer e un lettore di piastre a fluorescenza.

Un piccolo campione del nanosensore viene aggiunto a una soluzione acquosa in una cuvetta e inserito nello zetasizer per la registrazione della dimensione. Per l'analisi della fluorescenza, un campione del nanosensore viene posizionato in una piastra a 96 pozzetti e inserito nel lettore di piastre a fluorescenza. Idealmente, i nanosensori avranno un diametro di circa 70 nanometri e mostreranno un'emissione fluorescente di 575 nanometri.

Oltre alla sintesi dei nanosensori, è necessaria la coltivazione di batteri per fornire i bersagli batterici in laboratorio. Viene utilizzato un ceppo batterico in glicerolo per preparare una coltura in brodo nutriente. Questa soluzione viene quindi lasciata incubare.

Al termine del periodo iniziale di incubazione, vengono effettuate diluizioni seriali al fine di ottenere un'ampia gamma di concentrazioni batteriche. Cento microlitri di ciascuna concentrazione vengono seminati su una piastra con agar nutriente e quindi incubati per 24 ore. Al termine di questa incubazione, le colonie presenti su ciascuna piastra vengono contate per determinare l'unità formante colonie, o numero di UFC per millilitro di ciascun ceppo diluito.

Ora che le soluzioni stock batteriche sono state preparate, possono essere utilizzate in combinazione con i nanosensori preparati. Un aspetto importante di questo particolare sierotipo batterico che lo distingue dagli altri sierotipi è che, supponiamo, se si viene infettati da altri sierotipi, è necessario un numero elevato di unità formanti colonie per contrarre un'infezione. Tuttavia, in questo particolare caso di E.coli, da 10 a 100 UFC, ovvero unità formanti colonie, sono sufficienti per provocare un'infezione.

La nostra tecnologia è progettata in modo tale da non farvi perdere anche una sola colonia, qualora fosse presente una contaminazione batterica. Per preparare le soluzioni da leggere nel relaxometro magnetico, si pipettano prima 300 microlitri di PBS in una provetta Eppendorf. Successivamente si aggiunge un campione della coltura batterica, seguito dall'aggiunta dei nanosensori.

La soluzione viene quindi trasferita in un tubo di vetro, e un pezzo di parafilm viene posizionato sopra per prevenire l'evaporazione. Il tubo di vetro viene poi inserito in un tubo NMR più grande e introdotto nel relaxometro magnetico. Viene utilizzata una soluzione di riferimento contenente solo nanosensore e PBS, senza batteri, per ottenere una lettura T2 di base, come mostrato.

Successivamente, soluzioni contenenti diverse concentrazioni di batteri vengono inserite nel rilassometro magnetico per l'analisi, e le variazioni dei valori di T2 sono causate dal legame tra i nanosensori e i batteri. Come mostrato, la presenza di appena una singola UFC batterica può essere rilevata in pochi minuti utilizzando questa metodica. Tuttavia, all'aumentare della concentrazione batterica, le letture di risonanza magnetica diventano meno quantificabili, motivo per cui l'uso di dati di emissione fluorescente è altrettanto fondamentale per una quantificazione accurata dei batteri.

Prima di raccogliere i dati di fluorescenza, il campione deve essere prima centrifugato. La soluzione viene trasferita dal tubo di vetro a un tubo Eppendorf e quindi centrifugata. Questo separa i batteri e i nanosensori legati ad essi dai nanosensori liberi in soluzione.

Il sopranatante viene scartato e il pellet batterico viene risospeso in PBS. Infine, il campione può essere analizzato mediante emissione fluorescente. L'intensità dell'emissione sarà proporzionale alla quantità di nanosensori rimasti in soluzione e, di conseguenza, anche alla quantità di batteri presenti.

Come si può osservare, l'emissione fluorescente aumenta all'aumentare della concentrazione batterica e diventa anche più sensibile. Per questo motivo, l'accoppiamento delle due modalità, magnetica e fluorescente, consente la rilevazione e la quantificazione della contaminazione batterica sia in fasi precoci che tardive di sviluppo. Oltre alla rilevazione di batteri in soluzioni semplici come il PBS, questi nanosensori possiedono anche la capacità di funzionare in mezzi più complessi, come l'acqua di lago o il latte.

Inoltre, questi nanosensori sono stati testati per verificarne la specificità in presenza di batteri non bersaglio e di batteri bersaglio inattivati termicamente. Come mostrato, i nanosensori magneto-fluorescenti presentano una reazione minima o nulla nei confronti di batteri non target o non vitali, grazie alla specificità degli anticorpi coniugati. Ciò dimostra la loro efficacia nella rilevazione di batteri specifici anche in presenza di altre specie.

Infine, è inoltre importante notare che questi nanosensori possono essere facilmente personalizzati anche per la rilevazione di altri patogeni. È possibile sintetizzare o formulare questi nanosensori, come abbiamo fatto nel nostro laboratorio, entro un mese. È fattibile completare il tutto entro un mese, e un solo mese di produzione può garantire all'incirca dieci anni di applicazioni.