Agenti patogeni di origine alimentare Screening utilizzando Magneto-fluorescente nanosensore: Rilevazione rapida di e. Coli O157: H7

L'obiettivo principale di questo protocollo è quello di progettare e sintetizzare nanosensori dual-modali in grado di rilevare contaminanti batterici come E.coli O157:H7. I nanosensori magneto-fluorescenti sono sintetizzati funzionalizzando le nanoparticelle di ossido di ferro attraverso una procedura in due fasi. In primo luogo, gli anticorpi bersaglio vengono coniugati alla superficie della nanoparticella.

Quindi il colorante fluorescente viene caricato nella sua codifica. L'abbinamento di queste modalità consente una rilevazione rapida e sensibile di contaminanti batterici sia in soluzioni a bassa che ad alta concentrazione. In presenza di una piccola quantità di batteri, i nanosensori sciameranno intorno ai batteri a causa del targeting degli anticorpi coniugati.

Questo sciame altera le interazioni del nucleo magnetico dei nanosensori con i protoni d'acqua circostanti, consentendo il rilevamento sensibile dei cambiamenti nei valori di rilassamento magnetico. All'aumentare della concentrazione di contaminanti batterici nelle soluzioni, lo sciame diminuisce e la capacità della modalità magnetica di quantificare la contaminazione si riduce. Tuttavia, all'aumentare della concentrazione batterica, aumenta anche la trasmissione fluorescente dei bionanosensori.

È per questo motivo che l'abbinamento delle modalità magnetiche e fluorescenti è importante. La combinazione ha permesso di rilevare in pochi minuti anche solo un'unità formante colonia di E.coli O157:H7. Il primo passo nella sissi dei nanosensori magneto-fluorescenti è la preparazione di una soluzione di sale di ferro costituita sia da cloruro feroso che da cloruro ferrico.

Il ferro fornirà ai nanosensori un nucleo magnetico che ne consente l'adattabilità alle piattaforme magnetiche di rilassamento. Ulteriori soluzioni necessarie sono l'acido poliacrilico e l'idrossido di ammonio. L'acido cloridrico viene introdotto nella soluzione di sale di ferro, che viene poi aggiunto alla soluzione di idrossido di ammonio durante il vortex.

Infine viene aggiunta la soluzione di acido poliacrilico e la miscela risultante viene fatta vorticare per un'altra ora mentre la reazione continua. La soluzione risultante viene centrifugata per far precipitare le molecole più grandi e isolare nanoparticelle di dimensioni inferiori a 100 nanometri. La soluzione viene poi dializzata durante la notte per la purificazione.

Il passo successivo è la coniugazione degli anticorpi bersaglio per la codifica dell'acido poliacrilico delle nanoparticelle di acido ferroso di nuova sintesi. I materiali necessari includono tampone MES, EDC, NHS e gli anticorpi selezionati. L'EDC viene prima aggiunto alla soluzione di nanoparticelle, seguito da NHS e infine dall'anticorpo.

La miscela viene quindi posta su un mixer da tavolo per tre ore mentre la reazione continua. La soluzione viene purificata utilizzando una colonna magnetica. La colonna magnetizzata cattura le nanoparticelle, consentendo l'uscita solo degli anticorpi fluttuanti.

Successivamente la colonna viene lavata con tampone PBS e vengono raccolti i nanosensori coniugati. Le nanoparticelle sono quindi pronte per l'aggiunta di colorante fluorescente, fornendo la seconda modalità chiave utilizzata per il rilevamento. Una delle caratteristiche più importanti del nostro nanosensore è la combinazione delle modalità magnetica e fluorescente, che è importante per una serie di motivi.

In primo luogo, la combinazione delle modalità consente a ciascuna di effettuare una sorta di controllo incrociato dell'altra, il che riduce notevolmente il rischio di falsi positivi e falsi negativi, che è uno dei maggiori ostacoli affrontati dalle diverse piattaforme diagnostiche utilizzate oggi. In secondo luogo, la combinazione delle modalità amplia notevolmente l'intervallo entro il quale possiamo non solo rilevare, ma anche quantificare la contaminazione batterica. La fase finale nella preparazione dei nanosensori è l'incapsulamento del colorante fluorescente nella codifica della nanoparticella.

Ciò si ottiene semplicemente aggiungendo colorante alla soluzione durante il vortex e quindi lasciando ulteriore tempo al colorante per diffondersi nella codifica del nanosensore. I nanosensori completamente funzionalizzati vengono quindi dializzati un'ultima volta per la purificazione. Al fine di caratterizzare i nanosensori, le dimensioni e la presentazione fluorescente vengono registrate utilizzando uno zetasizzatore e un lettore di piastre a fluorescenza.

Un piccolo campione del nanosensore viene aggiunto a una soluzione acquosa in cuvetta e posto nello zetasizzatore per la registrazione delle dimensioni. Per l'analisi della fluorescenza, un campione del nanosensore viene posizionato su una piastra a 96 pozzetti e inserito nel lettore di piastre a fluorescenza. Idealmente i nanosensori avranno un diametro di circa 70 nanometri e una trasmissione fluorescente di 575 nanometri.

Oltre alla sintesi dei nanosensori, la coltura dei batteri è necessaria per fornire i bersagli batterici in laboratorio. Una scorta di batteri in glicerolo viene utilizzata per preparare una coltura in brodo nutriente. Questa soluzione viene quindi lasciata incubare.

Dopo il periodo iniziale di incubazione, vengono eseguite diluizioni seriali per ottenere un'ampia gamma di concentrazioni batteriche. Cento microlitri di ogni concentrazione vengono placcati su una piastra a coclea nutriente e poi incubati per 24 ore. Dopo questa incubazione, le colonie su ciascuna piastra vengono contate per determinare l'unità di formazione della colonia, o conteggio CFU per mil di ciascun ceppo diluito.

Ora che le soluzioni stock batteriche sono state preparate, possono essere utilizzate in combinazione con i nanosensori preparati. E un aspetto importante di questo particolare sierotipo dei batteri che lo distingue dagli altri sierotipi è che, supponendo che se si viene infettati con gli altri sierotipi, è necessario avere molte unità formanti colonie per contrarre un'infezione. Ma in questo particolare E.coli da 10 a 100 CFU o unità formanti colonie sono sufficienti per darti un'infezione.

La nostra tecnologia è stabilita in modo tale da non perdere nemmeno una singola contaminazione batterica della colonia. Per preparare le soluzioni per la lettura nel relaxometro magnetico, 300 microlitri di PBS vengono prima pipettati in una provetta Eppendorf. Quindi viene aggiunto un campione di stock batterico, seguito dall'aggiunta di nanosensori.

La soluzione viene quindi trasferita in un tubo di vetro e sopra viene posizionato un pezzo di parafilm per evitare l'evaporazione. Il tubo di vetro viene quindi posizionato all'interno di un tubo NMR più grande e inserito nel relaxometro magnetico. Per ottenere una lettura di T2 di base, come mostrato, viene utilizzata una soluzione di base che non contiene batteri e solo nanosensore e PBS.

Quindi le soluzioni contenenti varie concentrazioni di batteri vengono inserite nel rilassometro magnetico per l'analisi e le variazioni dei valori di T2 sono causate dal legame tra i nanosensori e i batteri. Come mostrato, la presenza di una sola CFU batterica può essere rilevata in pochi minuti utilizzando questa modalità. Tuttavia, all'aumentare della concentrazione batterica, le letture della RM sono meno quantificabili, motivo per cui l'uso di dati di sottomissione fluorescenti equivale anche a un'accurata quantificazione batterica.

Prima di poter raccogliere i dati sulla fluorescenza, il campione deve essere centrifugato. La soluzione viene trasferita dalla provetta di vetro a una provetta Eppendorf e quindi centrifugata. Questo separa i batteri e i nanosensori ad esso legati dai nanosensori fluttuanti in soluzione.

Il surnatante viene scartato e il pellet batterico viene risospeso in PBS. Infine il campione può essere analizzato tramite invio fluorescente. La forza dell'emissione sarà relativa alla quantità di nanosensori rimasti in soluzione, e quindi anche alla quantità di batterio presente.

Come si può vedere, la sottomissione fluorescente si rafforza all'aumentare della concentrazione batterica e diventa anche più sensibile. Questo è il motivo per cui l'abbinamento di entrambe le modalità magnetiche e fluorescenti consente di rilevare e quantificare la contaminazione batterica sia nelle fasi iniziali che in quelle tardive dello sviluppo. Oltre al rilevamento di batteri in soluzioni semplici come la PBS, questi nanosensori possiedono anche la capacità di funzionare in mezzi più complessi, come l'acqua di lago o il latte.

Inoltre, questi nanosensori sono stati testati per la specificità in presenza di batteri non bersaglio e batteri bersaglio inattivati dal calore. Come mostrato, i nanosensori magneto-fluorescenti hanno poca o nessuna reazione con batteri non bersaglio o non viventi a causa della specificità degli anticorpi coniugati. Ciò dimostra la loro efficacia per il rilevamento di batteri specifici in presenza di altre specie.

Infine, è anche importante notare che questi nanosensori possono essere facilmente personalizzati per il rilevamento di altri agenti patogeni. È possibile sintetizzare o formulare questi nanosensori che abbiamo fatto nel nostro laboratorio nel giro di un mese. Puoi farlo entro un mese e quel mese di prodotto può darti tipo 10 anni di applicazione.