Modulazione reversibile mediata dalla luce del percorso proteico di kinasi attivato da Mitogen durante la differenziazione cellulare e Xenopus Sviluppo embrionale

L'obiettivo generale di questo esperimento è quello di utilizzare la luce per controllare la via di segnalazione della proteina chinasi attivata dal mitogeno nelle cellule intatte e negli embrioni di Xenopus. Questo metodo può aiutare a rispondere a domande chiave nella biologia cellulare e dello sviluppo, come ad esempio il modo in cui le modulazioni temporali dell'attività chinasica regolano l'autodeterminazione durante la differenziazione cellulare e lo sviluppo embrionale. Il vantaggio principale di questa tecnica è che l'attività della proteina chinasi attivata dal mitogeno può essere controllata in modo reversibile nelle cellule intatte e negli organismi multicellulari, come gli embrioni in via di sviluppo.

Questo metodo può fornire informazioni sulla cinetica di segnalazione durante lo sviluppo embrionale di Xenopus. Può anche essere applicato ad altri sistemi di modelli come socotra, zebrafish o mouse. Oggi, uno studente laureato del mio laboratorio, Vishnu Krishnamurthy, dimostrerà la procedura.

E Aurora Turgeon, una post-star nel mio laboratorio, dimostrerà tutte le procedure coinvolte negli embrioni di Xenopus. Innanzitutto, assemblare il dispositivo per la coltura cellulare posizionando una camera PDMS sterile autoclavata su un vetrino coprinte sterile rivestito di PLL in una capsula di Petri da 60 mm. Successivamente, utilizzare 0,5 mL di tripsina allo 0,25% per staccare le cellule pHK21 da un pozzetto di una piastra di coltura tissutale a 6 pozzetti.

Dopo aver contato la densità cellulare con l'emocitometro, seminare la camera con 20.000 cellule in 200 microlitri di terreno di coltura cellulare. 24 ore dopo la placcatura cellulare, trasfettare le cellule con 50-100 nanogrammi di CRY2-mCherry-Raf1 2A2CIBMG di plasmide PCaA X secondo il protocollo del produttore. Tre ore dopo la trasfezione, cambiare il terreno con 200 microlitri di terreno di coltura fresco e lasciare che le cellule si riprendano durante la notte Incubando la coltura in un incubatore a 37 gradi Celsius e al cinque percento di anidride carbonica.

Il giorno successivo, iniziare l'induzione optogenetica e l'imaging sostituendo prima il terreno di coltura cellulare con 200 microlitri di terreno indipendente dall'anidride carbonica. Quindi impostare il protocollo di acquisizione dati. Selezionare il canale FITC di eccitazione con 488 nanometri per la stimolazione optogenetica e il canale CRITC con eccitazione a 561 nanometri per tracciare la localizzazione cellulare della proteina marcata con mCherry.

Misura la potenza della luce blu posizionando un misuratore di potenza vicino alla finestra dell'obiettivo. Una potenza totale di due microwatt è sufficiente per indurre l'associazione CIBN CRY2-PHR. Impostare l'acquisizione di un timestamp con l'intervallo di cinque secondi.

E il tempo totale di acquisizione di due minuti. Applicare il materiale appropriato per la corrispondenza dell'indice nella finestra dell'obiettivo. Posizionare la camera cellulare sul tavolino del microscopio e utilizzare la modalità campo chiaro per mettere a fuoco le cellule sulla superficie del vetrino coprioggetti utilizzando gli oculari.

Quindi, spostare il tavolino del microscopio per individuare una cellula trasfettata sotto la luce verde. Registra una serie di immagini con data e ora in entrambi i canali FITC e CITC. L'immagine di base del campione mostra CIBNGPCAAX localizzato sulla membrana plasmatica.

Questa è un'istantanea di CRY2 mCherry raf1 prima della simulazione della luce blu, mentre questa immagine mostra un'istantanea di CRY2 mCherry raf dopo dieci impulsi di stimolazione con luce blu. Crea l'array di LED inserendo LED blu tonali in due breadboard e collegandoli con resistori di limitazione di corrente. Metti le breadboard in una scatola di alluminio.

Inserire due fili metallici per collegare le schede all'alimentatore. Assicurarsi che la lunghezza del filo sia sufficiente quando la scatola luminosa è posizionata all'interno di un incubatore ad anidride carbonica. Quindi posizionare un diffusore di luce trasparente che funga da coperchio della scatola luminosa.

Infine, calibrare la potenza di uscita di ciascun LED a una gamma di ingressi di tensione. Utilizzare una potenza di zero virgola due milliwatt per centimetro quadrato per il saggio di differenziazione cellulare PC12 delle 24 ore. Posizionare l'array di LED in un incubatore a 37 gradi Celsius integrato con il cinque percento di anidride carbonica.

Collegalo all'alimentazione utilizzando i fili metallici e imposta la potenza del LED a zero virgola due milliwatt per centimetro quadrato. Posizionare la piastra a 12 pozzetti contenente le celle PC12 trasfettate sulla finestra dell'array di LED. Allineare la piastra in modo che ogni pozzetto sia completamente illuminato.

Applicare un'illuminazione a luce continua per 24 ore. Per visualizzare le celle differenziate, impostare l'acquisizione dei dati di una singola istantanea. Utilizzare 200 millisecondi per entrambi i canali GFP e TexasRed.

Acquisisci immagini delle cellule trasfettate in entrambi i canali GFP e TexasRed e salva i file per l'analisi dei dati. Inizia questa procedura fabbricando aghi per la microiniezione di RNA tirando i capillari di vetro con un estrattore capillare. Rimuovere il rivestimento gelatinoso dagli embrioni trattandoli con cisteina al tre percento diluita in 0,2 XMMR per 15 minuti.

Trasferire gli embrioni al tre percento di polisaccarosio e zero virgola cinque soluzione XMMR per microiniezione. Iniettare con precisione 500 picogrammi in un nanogrammo di RNA CRY2-mCherry-Raf1-2A-2CIBN-GFP-CaaX in ciascun embrione. Quindi coltivare gli embrioni microiniettati nella soluzione di microiniezione a temperatura ambiente.

Quando gli embrioni raggiungono lo stadio di gastrula medica, trasferirli in una soluzione MMR 0,2x e continuare a coltivare fino allo stadio di sviluppo desiderato. Quindi posizionare la piastra a 12 pozzetti sull'array di LED costruito in casa per il trattamento della luce blu. Posizionare uno specchio sopra la piastra a 12 pozzetti per garantire la piena illuminazione della luce blu degli embrioni.

Raccogli gli embrioni per l'analisi istologica, western blot o di espressione genica dopo l'esposizione alla luce blu per il tempo desiderato. Questa immagine mostra istantanee multicanale di cellule PC12 trasfettate con CRY2-2A-2CIBN dopo 24 ore di stimolazione con luce blu al punto zero di due milliwatt per centimetro quadrato. Si vedono sia i reporter di GFP che quelli di mCherry.

I cerchi segnano le celle differenziate e i quadrati segnano le celle indifferenziate. Qui le cellule sono state trattate allo stesso modo di quelle dell'immagine precedente, tranne per il fatto che non è stata utilizzata alcuna stimolazione con luce blu. Non si vede alcuna differenziazione.

Queste cellule mostrano risultati rappresentativi dopo la trasfezione con raf1 GFPCaaX, un raf1 costitutivamente attivo. I cerchi e i rettangoli segnano rispettivamente le celle differenziate e indifferenziate. Questo istogramma mostra i rapporti di differenziazione delle cellule PC12 trasfettate con CA-Raf1, co-trasfettate con CRY2 mCherry raf1 e CIBN GFP Caax e trasfettate singolarmente con CRY2A 2CIBN.

Solo le cellule esposte alla luce blu hanno mostrato una differenziazione significativa. Questa immagine mostra la morfologia di embrioni normali di Xenopus senza iniezione di MRNA e senza trattamenti leggeri. Questa immagine mostra embrioni iniettati con CRY2 2A2CIBN MRNA e sottoposti a stimolazione con luce blu.

L'attivazione di raf1 mediante il trattamento di embrioni iniettati con CRY2 2A2CIBN con luce blu induce strutture ectopiche simili a code nella regione della testa. Seguendo questa procedura, si può rispondere a ulteriori domande, come ad esempio come l'attivazione specifica dello stadio della via della proteina chinasi attivata dal mitogeno regola l'espressione genica. Questo metodo optogenetico può essere generalizzato per controllare altre vie di segnalazione con meccanismi di attivazione simili.