Name: Saggi per caratterizzare nuovi endoteliale regolatori coinvolti nella risposta infiammatoria di screening (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-09-15T13:00:00.000+00:00
Duration: 12 min 50 s
Description: Impara a caratterizzare nuovi regolatori endoteliali coinvolti nella risposta infiammatoria. Questo metodo consente di studiare il traffico dei leucociti e sviluppare strategie terapeutiche per patologie infiammatorie.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Questo lavoro è stato supportato dal Ministerio de Economía y Competitividad (MINECO) e l'Instituto de Salud Carlos III (ISCIII) (concessione numero IERPY 1149/16 da A.L.; MPY 1410/09 a S. Hortelano); da MINECO attraverso il Fondo de Investigación en Salud (FIS) (assegna numeri PI11.0036 e PI14.0055 a S. Hortelano). S. Herranz è stata sostenuta da IERPY 1149/16 da ISCIII.

1. coltura di cellule endoteliali <ol><li>di coltura del tessuto trattato piastre <ol><li>piastre di coltura del tessuto cappotto 100 mm con gelatina di 2,5 mL soluzione (in autoclave, gelatina di 0,1% in acqua distillata) per 30 min a 37 ° C; questo possono essere estrapolati al formato richiesto ben. Aspirare la soluzione di gelatina e lasciare piatti asciugare all'aria nella cappa di coltura del tessuto.</li>
	</ol></li> <li>Condizioni di coltura del tessuto <ol><li>coltivare le cellule MLEC-04 all'interno di un incubatore biologico (37 ° C, umidità 95%, 5% CO 2). Crescere le cellule in multimediale completo di Dulbecco &#39; s Modified Eagle Medium: miscela nutriente F-12 (DMEM/F-12) completati con 10% siero bovino fetale (FBS) e 100 unità/mL di penicillina e 100 µ g/mL di streptomicina (P/S).</li>
		<li>Contare le celle con il metodo standard della camera Neubauer e aggiungere le cellule MLEC-04 le piastre di gelatina-trattati di 100 mm in media completa da 10 mL, a una bassa densità di 2-11 x 10 4 cellule/cm 2. Quando raggiungono la confluenza di dividere le celle 1:3. 
		Nota: Questo si verifica in genere dopo due o tre giorni nella cultura.</li>
		<li>Sottocultura le cellule lavando i piatti con 10 mL sterili Phosphate Buffered Saline (PBS) seguita con l'aggiunta di 2 mL di soluzione di tripsina-EDTA (0,25% tripsina, 5mm EDTA) e incubare per 3 min a 37 ° C.</li>
		<li>Fermare la reazione di tripsina-EDTA e recuperare le cellule sospese aggiungendo multimediale completo di 10 mL. Rotazione verso il basso le cellule (300 x g, 5 min), eliminare il supernatante, risospendere il pellet cellulare in media completi e sottocultura opportunamente.</li>
	</ol></li></ol> 2. Trattamento dei LPS e mediatori <ol><li>le cellule MLEC-04 nel multimediale completo Sub-confluenza nel seguente ben formato del piatto: 7 x 10 5 cellule/pozzetto in piastre da 6 pozzetti e 2.5 x 10 5 cellule/pozzetto in piastre da 96 pozzetti.</li>
	<li>Incubare la cultura per 6 h in un'incubatrice di cellulare (37 ° C, umidità 95%, 5% CO 2). Passare le cellule ai media incompleta (DMEM-F12, P/S) e lasciare durante la notte (il) per sincronizzare e per ridurre l'attività delle cellule.</li>
	<li>Rimuovere i supporti e testare nuovi composti farmacologici incubando le cellule endoteliali con (o senza) il farmaco in questione (ad es. DT 10) diluito nei mezzi di comunicazione incompleta (30 min, 37 ° C); aggiungere 1,4 mL/bene per piastra a 6 pozzetti o 0,14 mL/pozzetto per piastre da 96 pozzetti).</li>
	<li>Sfida le cellule aggiungendo LPS ai media incubazione (100 ng/mL, concentrazione finale) per il periodo di tempo specificato in ogni analisi. Utilizzare PBS come controllo.</li>
</ol> 3. Valutazione del profilo trascrizionale sull'endotelio attivato da RT-qPCR <ol><li>cellule di seme MLEC-04 Sub-confluenza nella cultura 6 pozzetti piastre (7 x 10 5 cellule/pozzetto). Incubare per 6 h (37 ° C, umidità 95%, 5% CO 2) e successivamente procedere alla deprivazione di siero (Incubare ON).</li>
	<li>Rimuovere i supporti e trattare (o non trattata) la cellula endoteliale culture con il farmaco di interesse diluito nei media incompleti (Incubare per 30 minuti, 37 ° C); aggiungere 1,4 mL/bene per piastra a 6 pozzetti (30 min, 37 ° C).</li>
	<li>Sfidare le cellule con l'aggiunta di 100 ng/mL LPS ai media incubati (come descritto al punto 2.3) e incubare per 6 h. fermare la reazione di lavaggio due volte con PBS freddo e mantenere piastre a-80 ° C fino al trattamento del campione.</li>
	<li>Estrazione di RNA <ol><li>scongelare le piastre e aggiungere 1 mL/pozzetto RNA tampone di estrazione (38% fenolo e 0,8 M guanidinio isotiocianato; Vedi tabella materiali). Lasciare per 30 min a temperatura ambiente (TA) sotto agitazione e raccogliere omogeneato in provette da 1,5 mL.</li>
		<li>Aggiungere cloroformio di 200 µ l e frizionare delicatamente per 15 s. Incubare per 3 min a RT e centrifugare (11.600 x g, 15 min, 4 ° C).</li>
		<li>Fase acquosa di trasferimento in un'altra provetta da 1,5 mL. Precipitare il RNA aggiungendo 500 µ l isopropanolo, seguita da un'incubazione di 10 min a RT e quindi centrifugazione (11.600 x g, 4 ° C).</li>
		<li>Scartare il surnatante e lavare il precipitato con etanolo al 75% da vortice agitazione e poi centrifugazione (7.500 x g, 4 ° C).</li>
		<li>Asciugare il pellet e solubilizzare RNA in 25 µ l puro H 2 O incubando per 10 minuti a 55 ° C. Keep RNA a-80 ° C fino al trattamento del campione.</li>
	</ol></li> <li>Quantità e la purezza del RNA <ol><li>quantificare la concentrazione di RNA misurando l'assorbanza del campione a 260 nm in uno spettrofotometro (Vedi Tabella materiali).</li>
		<li>Misura a 230 nm e 280 nm per determinare la purezza RNA. 
		Nota: Il rapporto a 260/280 indica contaminazione della proteina o fenolo. Un rapporto vicino 2 è accettabile. Il rapporto di 260/230 indica EDTA, carboidrati o contaminanti di fenolo. Valori tra 2.0-2.2 sono accettabili.</li>
	</ol></li> <li>RNA controllo integrità <ol><li>Run 2 µ g di RNA totale e un RNA scaletta su un 1,5% denaturante del gel dell'agarosi; visualizzare su un sistema di documentazione del gel (Vedi Tabella materiali). 
		Nota: Un rapporto di 2:1 di chiare e nitide bande di rRNA 28S e 18S indica un RNA intatto. Parzialmente degradata RNA si risolve come un aspetto spalmato.</li>
	</ol></li> <li>RT-qPCR <ol><li>sintetizzano il DNA complementare (cDNA) da un singolo RNA incagliato seguendo lo standard protocollo (Vedi Tabella materiali) 11.</li>
	</ol></li> <li>Valutare l'espressione genica di RT-qPCR <ol><li>preparare la miscela di reazione per ogni campione: Mix 2 µ l cDNA, composto fluorescente di 7 µ l, 300 nM forward primer e primer reverse 300 nM (tabella 1) in un volume finale di 13 µ l e aggiungere alla piastra 96 pozzetti di reazione (Vedi Tabella materiali).</li>
		<li>Sigillare la piastra con un coperchio adesivo ottico, centrifuga (300 x g, 1 min) ed eseguire la reazione su un sistema di PCR in tempo reale (avviamento a caldo 95 ° C per 20 s seguiti da 40 cicli: 95 ° C per 3 s e 60 ° C per 30 s) (Vedi Tabella materiali).</li>
		<li>Analizzare i risultati di quantificazione relativa utilizzando il metodo comparativo 2 -ΔΔCt con le pulizie geni gliceraldeide-3-fosfato deidrogenasi (GAPDH) o acida ribosomal fosfoproteina P0 (36B4) 12 .</li>
	</ol></li></ol> 4. Valutare l'attivazione endoteliale tramite flusso Cytometry <ol><li>trattare le cellule MLEC-04 seguendo le condizioni descritte nella sezione 2 e valutare i cambiamenti delle proteine di superficie endoteliale tramite flusso cytometry.</li>
	<li>Staccare le cellule dopo 6 h di stimolazione dei LPS con il metodo di tripsina-EDTA descritto in passaggio 1.2.3 e lavare con i mezzi di comunicazione incompleta a 4 ° C.</li>
	<li>Contare le celle utilizzando il metodo della camera Neubauer e inserire 10x10 4 cellule in piastre da 96 pozzetti fondo u. Centrifuga (300 x g, 5 min) e gettare il surnatante di un 180° a scatto del polso dall'alto verso il basso e il recupero rapido alla posizione originale.</li>
	<li>Aggiungere 50 µ l dell'anticorpo selezionato diluito nei mezzi di comunicazione incompleta (10 µ g/mL, concentrazione finale) per le cellule e incubare (30 min, 4 ° C).</li>
	<li>Lavare le cellule due volte with media incompleti seguendo la procedura descritta nel passaggio 4.3 e incubare con 50 µ l a 10 µ g/mL di anticorpo secondario corrispondente accoppiato al FITC o un simile coniugato (30 min, 4 ° C in uno spazio buio).</li>
	<li>Lavare le cellule una volta con i mezzi di comunicazione incompleta seguita da un lavaggio con PBS. Recuperare le cellule con 300 µ l PBS utilizzando puntali per pipette da 1 mL e posto in tubi di citometria.</li>
	<li>Valutare i campioni nel sistema di citometria a flusso (Vedi Tabella materiali). Regolare la popolazione delle cellule dall'avanti e parametri di scattering di lato. Cancello della popolazione di interesse. Regolare cancelli basate sul controllo negativo da cellule incubate con controllo di isotipo. Analizzare i risultati come la percentuale di cellule positive o dire fluorescenza intensità 8.</li>
</ol> 5. Valutare l'attivazione endoteliale mediante Western Blot <ol><li>seme l'endotelio Sub-confluenza in piastre di coltura 6 pozzetti (7 x 10 5 cellule/pozzetto) e trattare con LPS come descritto nella sezione 2. Analizzare l'espressione di proteina infiammatoria dal seguente protocollo occidentale della macchia.</li>
	<li>Interrompere la stimolazione dei LPS in diversi momenti per chiarire diversi aspetti della risposta endoteliale: <ol><li>accertare il profilo di proteine infiammatorie dopo 6 h di stimolazione dei LPS.</li>
		<li>Determinare la cella segnalazione ogni 15 minuti attraverso un periodo di 60 min.</li>
	</ol></li> <li>In entrambi i casi, è necessario arrestare la reazione di lavaggio due volte con PBS freddo e conservare i campioni a-80 ° C fino al trattamento del campione.</li>
	Buffer di <li>Lyse le cellule e l'estrazione della proteina <ol><li>lisi di aggiungere 200 µ l in ogni pozzetto (1% tensioattivi non ionici, 10 mM Tris-HCl, 1 mM EDTA, 150 mM di cloruro di sodio, pirofosfato di sodio 30 mM, 50 mM sodio fluoruro, 2,1 mM sodio ortovanadato presso pH 7,6, completati con l'inibitore della proteasi cocktail) (Vedi tabella dei materiali).</li>
		<li>Incubare per 15 min a 4 ° C sotto agitazione, raschiare pozzi con una pipetta e raccogliere l'omogenato in provette da 1,5 mL.</li>
		<li>Centrifugare le provette a 11.600 x g a 4 ° C.</li>
		<li>Conservare il supernatante in provette pulite 1,5 mL a-80 ° C fino a elaborazione.</li>
	</ol></li> <li>Misura la concentrazione di proteina dall'analisi di acido bicinconinico seguendo lo standard di protocollo (Vedi tabella materiali) 13.</li>
	<li>Risolvere il 30 µ g di proteina totale lysata per ogni campione, la tecnica standard di laurilsolfato di sodio 0,1%, 10% gel di poliacrilammide elettroforesi (SDS-PAGE) 14. Eseguire i campioni con 10mm β-mercaptoetanolo (condizioni riducenti) o senza (condizioni non riducenti) a seconda dell'anticorpo utilizzato per rilevare la proteina di interesse.</li>
	<li>Trasferire le proteine separate da gel di poliacrilammide ad una membrana di polivinilidene difluoruro (PVDF) trasferimento con 0,45 µm pori utilizzando la procedura standard.</li>
	<li>Dopo transfert, lavare la membrana due volte con PBS, 0,1% polisorbato-20 (PBS-T) e bloccare i siti di legame non specifico aggiungendo 20 mL 2% BSA diluito in PBS-T per fosfoproteine rilevati o latte in polvere senza grassi 5% in PBS-T per proteine totali, sotto agitazione (90 min, RT).</li>
	<li>Diluire l'anticorpo selezionato in 10 mL di buffer blocco appropriato presso la concentrazione consigliata e incubare la membrana sotto agitazione (ON, 4 ° C). In alternativa, posizionare la membrana in sacchetti di plastica sigillati e usato 5 mL di anticorpo diluito.</li>
	<li>Giorno successivo, lavare la membrana tre volte (in eccesso PBS-T, 15 min, RT).</li>
	<li>Incubare la membrana sotto agitazione (30 min, RT) con 10 mL di anticorpo secondario corrispondente associata alla perossidasi di rafano (HRP) diluito a 1: 10.000 nell'appropriato tampone bloccante.</li>
	<li>Lavare la membrana tre volte sotto agitazione (PBS-T in eccesso, 15 min, RT).</li>
	<li>Incubare la membrana per 1 min con 0,1 mL/cm 2 di chemiluminescenza di substrato migliorato la perossidasi (ECL). Posizionare la membrana drenata tra due fogli di plastica trasparente e inserire il sistema di rilevazione di chemiluminescenza che include una fotocamera Charged-Coupled Device (CCD).
	<ol><li>Utilizzare la telecamera CCD per rilevare il segnale e il relativo software per registrare le immagini con il programma accumulativo (immagini visualizzare il segnale accumulato presso ogni 30 s esposizione per un periodo di totale 15 min).</li>
	</ol></li> <li>Quantificare l'intensità di banda da densitometria utilizzando il software ImageJ seguendo il protocollo descritto nella Guida utente 15.
	<ol><li>Aprire l'esempio nel software ImageJ e selezionare la banda di interesse con lo strumento selezione rettangolare.</li>
		<li>Selezionare come prima corsia e premere trama corsie per ottenere le trame profilo.</li>
		<li>Delimitare l'area dei picchi con la linea retta selezione.</li>
		<li>Misurare la dimensione di ciascuna banda facendo clic all'interno di ogni picco.</li>
		<li>Rappresentano i risultati rispetto al caricamento di controllo proteine (β-actina, tubulina, ecc.).</li>
	</ol></li></ol> 6. Valutare endoteliale fattore rilasciato dall'attivazione del leucocita di analisi di adesione <ol><li>ottenere il media condizionati endoteliali.
	<ol><li>Trattare le cellule MLEC-04 come indicato nella sezione 2 e raccogliere il surnatante della cultura dopo stimolazione h 24 con LPS (100 ng/mL).</li>
		<li>Raccogliere il media condizionati dalle cellule trattate MLEC-04 e centrifugare (600 x g). Mantenere il supernatante in aliquote di 0,5 mL a-80 ° C fino all'utilizzo.</li>
	</ol></li> <li>Analisi di adesione del leucocita <ol><li>cappotto le piastre da 96 pozzetti con 50 µ l/pozzetto di proteine della matrice extracellulare selezionato diluito in PBS (ad eccezione di collagene, che è diluito in acido acetico 0,1 M): fibronectina (1-10 µ g/mL ), laminina (1-10 µ g/mL) e collagene di tipo I (10-40 µ g/mL). Lasciare ON a 4 ° C.</li>
		<li>Scartare il supporto rivestito e bloccare i siti di legame aspecifici su pozzi con 150 µ l di PBS, BSA 1% inattivati (1 min, 100 ° C) per 90 minuti a TA.</li>
		<li>Lavare i pozzetti due volte con PBS e aggiungere 100 µ l di raccolti in precedenza endoteliale condizionata media (sezione 6.1) ai pozzetti. 
		Nota: Le piastre sono pronte per eseguire il dosaggio di adesione.</li>
		<li>Cultura la linea di cellulare di monociti-macrofagi J774 topo in un incubatore biologico (37 ° C, umidità 95%, 5% CO 2) con Roswell Park Memorial Institute Medium (RPMI), 10% FBS, 1% P/S. 
		Nota: Le cellule J774 crescono in sospensione.</li>
		<li>Raccogliere le cellule J774 in una provetta da 15 mL e centrifugare (300 x g, 5 min). Eliminare il supernatante e risospendere il pellet cellulare con media privo di siero di 10 mL. Contare le celle in una camera di Neubauer. Centrifugare le cellule (300 x g, 5 min), scartare il surnatante e risospendere le cellule in media senza siero alle cellule di 15 x 10 4 J774 per media di 50 µ l.</li>
		<li>Aggiungi 15 x 10 4 J774 cellule a ciascuno in media di siero senza 50 µ l ed incubare per 15 min a 4 ° C, seguita da 1 h a 37 ° C nell'incubatore CO 2 cell.</li>
		<li>Lavare i pozzetti per due volte, delicatamente aggiungendo PBS caldo; centrifugare (5 min a 300 x g) e scartare il surnatante di un attimo di 180° del polso dall'alto verso il basso e il recupero rapido alla posizione originale. Difficoltà la cella collegatas aggiungendo 100 µ l/pozzetto di paraformaldeide al 4% (PFA) in PBS e incubare (10 min, RT).</li>
		<li>Scartare i media delicatamente e permeabilize le cellule con metanolo al 2% in PBS per 2 min a RT. scartare i media delicatamente e macchiare le cellule aggiungendo 50 µ l/pozzetto di cristalvioletto di 0,5% a 20% metanolo per 90 s a RT.</li>
		<li>Lavare la piastra con abbondante acqua corrente, eliminare il liquido in eccesso e lasciare asciugare all'aria. Segnalazione le cellule allegate da fotocamera digitale accoppiata ad un microscopio chiaro.</li>
		<li>Diluire aggiungendo 100 µ l/pozzetto di citrato di sodio 0,1 M, 50% di etanolo di colorazione cellulare. Misura l'assorbanza a 545 nm e rappresentano i risultati come unità arbitrarie di assorbanza o percentuale di adesione considerando 100% come adesione cellulare raggiungono pozzetti rivestito con maggiore concentrazione di ligando</li></ol></li></ol> 7. Testare l'attivazione endoteliale da analisi di co-adesione del leucocita-endotelio <ol><li>trattare le cellule MLEC-04 su piastre a 96 pozzetti, come descritto nella sezione 2 e incubare con LPS (6 h, 37 ° C).</li>
	<li>Fluorescente marcare le cellule J774 con Carboxyfluorescein Succinimidyl Ester (CSFE).
	<ol><li>Lavare il J774 cellule in PBS seguendo la procedura punto 6.2.5. Conteggio celle dalla Neubauer metodo da camera e risospendere a 1 x 10 6 cellule/mL in PBS, 0.1% BSA.</li>
		<li>Incubare le cellule con CFSE (5 µM, concentrazione finale) per 20 min a diluitore incompleta di 37 ° C. aggiungere 5 mL e incubare (5 min, 4 ° C).</li>
		<li>Lavare una volta con media incompleta, come spiegato nel 6.2.5., risospendere a 15 x 10 4 cellule/100 µ l e procedere con l'analisi di co-adesione.</li>
	</ol></li> <li>Dopo il trattamento di endotelio, lavare i pozzetti tre volte con media incompleta. Aggiungere le cellule J774 CFSE (15 x 10 4 cellule/100 µ l) a ogni endothelial-rivestite bene. Incubare la piastra per 10 min a 4 ° C, seguita da 60 min a 37 ° C.</li>
	<li>Lavare i pozzetti con delicatezza, come descritto in 6.2.7., usando riscaldato PBS e riferire l'adesione J774 lo strato endoteliale con i seguenti due metodi: <ol><li>lisare le cellule in 0.1 M Tris-HCl pH 8,8, 1% SDS (100 µ l/pozzetto) e misurare la Segnale di CFSE-J774 dalla fluorometria (eccitazione/emissione = 492 nm/517 nm). Rappresentare i risultati come unità arbitrarie di intensità di fluorescenza o la percentuale di adesione rispetto al controllo positivo (segnale da cellule totali aggiunta ad ogni pozzetto).</li>
		<li>Fissare le cellule nel 4% PFA e report l'allegato delle cellule J774 CFSE all'endotelio visualizzando sotto un microscopio a fluorescenza (eccitazione/emissione = 492 nm nm/517).</li>
	</ol>
	</li>
</ol>

<ol><li>Baumgart, D. C., Sandborn, W. J. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/22914295">Crohn's disease.</a> Lancet. 380 (9853), 1590-1605 (2012).</li>
<li>Skeoch, S., Bruce, I. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Atherosclerosis+in+rheumatoid+arthritis%3A+is+it+all+about+inflammation%3F%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Rheumatol%22%5BJournal%5D)">Atherosclerosis in rheumatoid arthritis: is it all about inflammation?</a> Nat Rev Rheumatol. 11 (7), 390-400 (2015).</li>
<li>Gerhardt, T., Ley, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Monocyte+trafficking+across+the+vessel+wall%5BTitle%5D)+AND+%22Cardiovasc+Res%22%5BJournal%5D)">Monocyte trafficking across the vessel wall.</a> Cardiovasc Res. 107 (3), 321-330 (2015).</li>
<li>Andonegui, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mice+that+exclusively+express+TLR4+on+endothelial+cells+can+efficiently+clear+a+lethal+systemic+Gram-negative+bacterial+infection%5BTitle%5D)+AND+%22J+Clin+Invest%22%5BJournal%5D)">Mice that exclusively express TLR4 on endothelial cells can efficiently clear a lethal systemic Gram-negative bacterial infection.</a> J Clin Invest. 119 (7), 1921-1930 (2009).</li>
<li>McDonald, B., Jenne, C. N., Zhuo, L., Kimata, K., Kubes, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Kupffer+cells+and+activation+of+endothelial+TLR4+coordinate+neutrophil+adhesion+within+liver+sinusoids+during+endotoxemia%5BTitle%5D)+AND+%22Am+J+Physiol+Gastrointest+Liver+Physiol%22%5BJournal%5D)">Kupffer cells and activation of endothelial TLR4 coordinate neutrophil adhesion within liver sinusoids during endotoxemia.</a> Am J Physiol Gastrointest Liver Physiol. 305 (11), G797-G806 (2013).</li>
<li>Pober, J. S., Sessa, W. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Evolving+functions+of+endothelial+cells+in+inflammation%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Immunol%22%5BJournal%5D)">Evolving functions of endothelial cells in inflammation.</a> Nat Rev Immunol. 7 (10), 803-815 (2007).</li>
<li>Chamorro, Á, Dirnagl, U., Urra, X., Planas, A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neuroprotection+in+acute+stroke%3A+targeting+excitotoxicity%2C+oxidative+and+nitrosative+stress%2C+and+inflammation%5BTitle%5D)+AND+%22Lancet+Neurol%22%5BJournal%5D)">Neuroprotection in acute stroke: targeting excitotoxicity, oxidative and nitrosative stress, and inflammation.</a> Lancet Neurol. 15 (8), 869-881 (2016).</li>
<li>Hortelano, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((ILK+mediates+LPS-induced+vascular+adhesion+receptor+expression+and+subsequent+leucocyte+trans-endothelial+migration%5BTitle%5D)+AND+%22Cardiovasc+Res%22%5BJournal%5D)">ILK mediates LPS-induced vascular adhesion receptor expression and subsequent leucocyte trans-endothelial migration.</a> Cardiovasc Res. 86 (2), 283-292 (2010).</li>
<li>Palazón, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Agonist+anti-CD137+mAb+act+on+tumor+endothelial+cells+to+enhance+recruitment+of+activated+T+lymphocytes%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Res%22%5BJournal%5D)">Agonist anti-CD137 mAb act on tumor endothelial cells to enhance recruitment of activated T lymphocytes.</a> Cancer Res. 71 (3), 801-811 (2011).</li>
<li>Jiménez-García, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((8%2C9-Dehydrohispanolone-15%2C16-lactol+diterpene+prevents+LPS-triggered+inflammatory+responses+by+inhibiting+endothelial+activation%5BTitle%5D)+AND+%22Biochem+J%22%5BJournal%5D)">8,9-Dehydrohispanolone-15,16-lactol diterpene prevents LPS-triggered inflammatory responses by inhibiting endothelial activation.</a> Biochem J. 473 (14), 2061-2071 (2016).</li>
<li>SuperScript® III First-Strand Synthesis System for RT-PCR. , Life Technologies. Available from:
 <a target="_blank" href="https://tools.thermofisher.com/content/sfs/manuals/superscriptIIIfirststrand_pps.pdf">https://tools.thermofisher.com/content/sfs/manuals/superscriptIIIfirststrand_pps.pdf</a> (2013).</li>
<li>Livak, K. J., Schmittge, T. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Analysis+of+relative+gene+expression+data+using+real-time+quantitative+PCR+and+the+2%28-Delta+Delta+C%28T%29%29+Method%5BTitle%5D)+AND+%22Methods%22%5BJournal%5D)">Analysis of relative gene expression data using real-time quantitative PCR and the 2(-Delta Delta C(T)) Method.</a> Methods. 25 (4), 402-408 (2001).</li>
<li>Pierce BCA Protein Assay Kit. , Thermo Scientific. Available from:
 <a target="_blank" href="https://tools.thermofisher.com/content/sfs/manuals/MAN0011430_Pierce_BCA_Protein_Asy_UG.pdf">https://tools.thermofisher.com/content/sfs/manuals/MAN0011430_Pierce_BCA_Protein_Asy_UG.pdf</a> (2017).</li>
<li>He, F. <a target="_blank" href="http://www.bio-protocol.org/e80">Laemmli-SDS-PAGE.</a> BIO-PROTOCOL. 1 (11), (2011).</li>
<li>ImageJ User Guide. , ImageJ. Available from:
 <a target="_blank" href="https://imagej.nih.gov/ij/docs/guide/user-guide-USbooklet.pdf">https://imagej.nih.gov/ij/docs/guide/user-guide-USbooklet.pdf</a> (2017).</li>
<li>Hohsfield, L. A., Humpel, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Intravenous+infusion+of+monocytes+isolated+from+2-week-old+mice+enhances+clearance+of+Beta-amyloid+plaques+in+an+Alzheimer+mouse+model%5BTitle%5D)+AND+%22PloS+One%22%5BJournal%5D)">Intravenous infusion of monocytes isolated from 2-week-old mice enhances clearance of Beta-amyloid plaques in an Alzheimer mouse model.</a> PloS One. 10 (4), e0121930(2015).</li>
<li>Hofland, R. W., Thijsen, S. F. T., Verhagen, M. A. M. T., Schenk, Y., Bossink, A. W. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tuberculosis+during+TNF-%CE%B1+inhibitor+therapy%2C+despite+screening%5BTitle%5D)+AND+%22Thorax%22%5BJournal%5D)">Tuberculosis during TNF-α inhibitor therapy, despite screening.</a> Thorax. 68 (11), 1079-1080 (2013).</li>
<li>Ley, K., Laudanna, C., Cybulsky, M. I., Nourshargh, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Getting+to+the+site+of+inflammation%3A+the+leukocyte+adhesion+cascade+updated%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Immunol%22%5BJournal%5D)">Getting to the site of inflammation: the leukocyte adhesion cascade updated.</a> Nat Rev Immunol. 7 (9), 678-689 (2007).</li>
<li>Tedgui, A., Mallat, Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Anti-inflammatory+mechanisms+in+the+vascular+wall%5BTitle%5D)+AND+%22Circ+Res%22%5BJournal%5D)">Anti-inflammatory mechanisms in the vascular wall.</a> Circ Res. 88 (9), 877-887 (2001).</li>
<li>Zheng, Y., Humphry, M., Maguire, J. J., Bennett, M. R., Clarke, M. C. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Intracellular+interleukin-1+receptor+2+binding+prevents+cleavage+and+activity+of+interleukin-1%CE%B1%2C+controlling+necrosis-induced+sterile+inflammation%5BTitle%5D)+AND+%22Immunity%22%5BJournal%5D)">Intracellular interleukin-1 receptor 2 binding prevents cleavage and activity of interleukin-1α, controlling necrosis-induced sterile inflammation.</a> Immunity. 38 (2), 285-295 (2013).</li>
<li>Pripp, A. H., Stanišić, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+correlation+between+pro-+and+anti-inflammatory+cytokines+in+chronic+subdural+hematoma+patients+assessed+with+factor+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22PloS+One%22%5BJournal%5D)">The correlation between pro- and anti-inflammatory cytokines in chronic subdural hematoma patients assessed with factor analysis.</a> PloS One. 9 (2), e90149(2014).</li>
<li>Guha, M., Mackman, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((LPS+induction+of+gene+expression+in+human+monocytes%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Signal%22%5BJournal%5D)">LPS induction of gene expression in human monocytes.</a> Cell Signal. 13 (2), 85-94 (2001).</li>
<li>Tabas, I., Glass, C. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Anti-inflammatory+therapy+in+chronic+disease%3A+challenges+and+opportunities%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Anti-inflammatory therapy in chronic disease: challenges and opportunities.</a> Science. 339 (6116), 166-172 (2013).</li>
</ol>

Gli autori non hanno nulla a rivelare.

Questo protocollo endothelial descrive una tecnologia graduale che costituisce le basi per esplorare nuovi meccanismi coinvolti nella regolazione della risposta infiammatoria. Questi approcci sono basati sullo studio dell'attività endoteliale stimolata da LPS e valutare i passaggi critici coinvolti nel reclutamento dei leucociti durante la risposta infiammatoria, in particolare: liberazione di citochine endoteliale, adesione endoteliale adesione di molecole del leucocita e l'espressione a livello vascolare. Una volta sta...

L'infiammazione è una risposta biologica benefica contro agenti infettivi, con lo scopo principale di eliminare il patogeno e riparare il tessuto danneggiato. In determinate condizioni, come le infezioni croniche o malattie autoimmuni, l'infiammazione non si risolve. Invece, c'è una reazione anomala con continua infiltrazione dei leucociti, conseguente a una risposta immunitaria prolungata che porta al danno tissutale, fibrosi, perdita della funzione e nel complesso, disabilità e in alcuni morte casi del paziente. Questi disordini umani, catalogati come malattie infiammatorie, tutti coinvolgono i vasi sanguigni per il controllo di stravaso del leucocita1,2.
Le cellule endoteliali gioca un ruolo fondamentale nella regolazione della risposta infiammatoria controllando il traffico del leucocita. Quando lo strato endoteliale è esposto a mediatori infiammatori quali LPS, l'endotelio che riposa attiva ed esprime le citochine pro-infiammatorie (Cxcl10, Cxcl5, Cxcl1, ecc.) e molecole di adesione (E-selectina, VCAM-1 e ICAM-1) quel favore reclutamento dei leucociti nel sito di infezione circolanti. I leucociti innescati dalle citochine rilasciate quindi mediano rotolamento e l'interazione con lo strato endoteliale attraverso le controparti adesive corrispondente: PSGL-1-selectina, integrina α4β1 VCAM-1 e αLβ2 integrina di ICAM-1. Infine, i leucociti migrano attraverso il sistema vascolare verso la messa a fuoco di infiammazione3.
Il ruolo essenziale dell'endotelio nella regolazione della risposta infiammatoria è stato dimostrato sui topi che sono stati geneticamente modificati per esprimere il LPS recettore, il recettore toll-like 4 (TLR4), solo sulle cellule endoteliali. Questi animali endoteliale TLR4 sono stati in grado di rispondere ad un'infiammazione LPS-mediata e per rilevare l'infezione generata dopo l'inoculo di batteri e di conseguenza ottenere un infezione risoluzione e sopravvivenza a livelli simili come i topi wild-type4 , 5.
Per raggiungere la risposta infiammatoria dell'endotelio-regolato, è stato postulato che l'inibizione in alcune fasi dell'interazione leucocita-endotelio comporterebbe la riduzione della migrazione trans-endoteliale e una migliore prognosi per malattie infiammatorie legate. In realtà, diverse strategie di targeting per l'interazione di attivazione e del leucocita-endotelio endoteliale sono state progettate per ostacolare lo stravaso delle cellule immuni come un trattamento per i disordini infiammatori6,7.
In questo rapporto, descriviamo un gruppo approfondito di tecniche in vitro per caratterizzare l'attività endoteliale in risposta a stimolo infiammatorio LPS e suo ruolo nella attivazione del leucocita e adesione allo strato vascolare. Il modello delle cellule endoteliali utilizzato in questo manoscritto era la linea di mouse del polmone delle cellule endoteliali (MLEC-04), come descritto da Hortelano et al. 8. linea cellulare il MLEC-04 è stato convalidato nella letteratura per essere un sistema adeguato per studiare l'attivazione endoteliale9,10. Basato su interessi di ricerca, questi approcci possono essere facilmente estrapolati per ogni endoteliale o sistemi del leucocita e profilo infiammatorio. Una volta definiti i parametri endoteliali in condizioni selezionate, il sistema può testare nuovi farmaci sulla sperimentazione proposta di valutare l'attivazione vascolare. In questo contesto infiammatorio, le cellule di endotelio testate con il composto di interesse possono essere paragonate per le condizioni di controllo delle cellule, ed eventuali differenze risultanti possono informare il risultato prognostico della droga per lo sviluppo e la progressione dell'infiammazione. Per concludere, vi proponiamo un sistema pertinente per caratterizzare nuovi bersagli farmacologici per le cellule endoteliali, che possono influenzare la progettazione di nuove terapie vascolari specifici contro le malattie infiammatorie legate.

<table><tbody><tr><td>Gelatina</td><td>Sigma</td><td>G9391</td><td></td></tr><tr><td>DMEM-F12</td><td>Lonza</td><td>BE12-719F</td><td></td></tr><tr><td>Fetale Siero Bovino Sigma</td><td></td><td>A4503</td><td></td></tr><tr><td>Penicillina streptomicina</td><td>Lonza</td><td>DE17-602E</td><td></td></tr><tr><td>Tripsina</td><td>Lonza</td><td>BE17-160E</td><td></td></tr><tr><td>EDTA</td><td>Sigma</td><td>ED2SS</td><td></td></tr><tr><td>LPS</td><td>Sigma</td><td>L2880</td><td></td></tr><tr><td>Trizol</td><td>Sigma</td><td>T9424</td><td>Tampone di estrazione dell'RNA</td></tr><tr><td>Isopropanolo</td><td>Sigma</td><td>33539</td><td></td></tr><tr><td>Etanolo absoluto</td><td>Panreac</td><td>1,310,861,612</td><td></td></tr><tr><td>Puro H2O</td><td>Qiagen</td><td>1017979</td><td>RNAsi libero</td></tr><tr><td>Agarosio</td><td>Pronadisa</td><td>8020</td><td></td></tr><tr><td>Colorazione per gel di agarosio</td><td>Invitrogen</td><td>s33102</td><td></td></tr><tr><td>SuperScript III First-Strand Synth</td><td>Invitrogen</td><td>18080051</td><td>Reagenti per RT-PCR</td></tr><tr><td>Fast SYBR Green Master Mix</td><td>Applied Biosystems</td><td>4385610</td><td>Colorazione fluorescente per qPCR</td></tr><tr><td>MicroAmp Fast Optical 96-Well</td><td>Applied Biosystems</td><td>Piastre 4346906</td><td>per qPCR</td></tr><tr><td>U-bottom 96 pozzetti</td><td>Falcon</td><td>353072</td><td></td></tr><tr><td>Provette per citometria</td><td>Falcon</td><td>352054</td><td></td></tr><tr><td>TX100</td><td>Panreac</td><td>212314</td><td>Tensioattivo non ionico</td></tr><tr><td>Tris-HCl</td><td>Panreac</td><td>1.319.401.211</td><td></td></tr><tr><td>Cloruro di sodio</td><td>Merck</td><td>1.064.041.000</td><td></td></tr><tr><td>Pirofosfato di sodio</td><td>Sigma</td><td>221368</td><td></td></tr><tr><td>Fluoruro di sodio</td><td>Sigma</td><td>S7920</td><td></td></tr><tr><td>Ortovanadato di sodio</td><td>sigma</td><td>13721-39-6</td><td></td></tr><tr><td>Cocktail di inibitori della proteasi</td><td>sigma</td><td>P8340</td><td></td></tr><tr><td>Kit di analisi delle proteine BCA</td><td>Pierce</td><td>23225</td><td>Reagenti per il dosaggio dell'acido bicinchoninico</td></tr><tr><td>&beta;-mercaptoetanolo</td><td>merck</td><td>805.740</td><td></td></tr><tr><td>Membrana di trasferimento PVDF, 0,45 &; m</td><td>Thermo Scientific</td><td>88518</td><td></td></tr><tr><td>Tween-20</td><td>Panreac</td><td>1,623,121,611</td><td>Polisorbato 20</td></tr><tr><td>PBS</td><td>Lonza</td><td>BE17-515Q</td><td></td></tr><tr><td></td><td>ECL Millipore</td><td>WBKLS0500</td><td></td></tr><tr><td>Fibronectina</td><td>Sigma</td><td>F1141</td><td></td></tr><tr><td>Laminin</td><td>Sigma</td><td>L2020</td><td></td></tr><tr><td>Collagene tipo I</td><td>Sigma</td><td>c8919</td><td></td></tr><tr><td>Acido acetico</td><td>Panreac</td><td>1,310,081,611</td><td></td></tr><tr><td>Blu di tripano</td><td>Sigma</td><td>T8154</td><td></td></tr><tr><td>Paraformaldeide</td><td>Sigma</td><td>P6148</td><td></td></tr><tr><td>Metanolo</td><td>Panreac</td><td>1,310,911,612</td><td></td></tr><tr><td>Cristallovioletto</td><td>Sigma</td><td>HT90132</td><td></td></tr><tr><td>Citrato di sodio</td><td>Sigma</td><td>C7254</td><td></td></tr><tr><td>Etanolo 96%</td><td>Panreac</td><td>1,410,851,212</td><td></td></tr><tr><td>CFSE</td><td>Sigma</td><td>21888</td><td></td></tr><tr><td>RPMI</td><td>Lonza</td><td>BE12-115F</td><td></td></tr><tr><td>SDS</td><td>Bio-Rad</td><td>161-0418</td><td></td></tr><tr><td>Infinite M200</td><td>Tecan</td><td>M200</td><td>Lettore di micropiastre multimodale</td></tr><tr><td>Gel Doc 2000</td><td>Bio-Rad</td><td>2000</td><td>Sistema di documentazione</td></tr><tr><td>Gel StepOnePlus</td><td>Applied Biosystems</td><td></td><td>StepOnePlus sistema qPCR</td></tr><tr><td>MACSQuant Analyzer 10</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>Analyzer 10</td><td>Apparecchiature per citometria</td></tr><tr><td>ChemiDoc MP</td><td>Bio-Rad</td><td>MP</td><td>Sistema di rilevamento della chemiluminescenza</td></tr><tr><td>Name</td><td>Company</td><td>Numero di catalogo</td><td>Comments</td></tr><tr><td>Antibodies</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>PECAM-1</td><td>BD Biosciences</td><td>553370</td><td>Utilizzare a 10 &; micro; g/mL</td></tr><tr><td>ICAM-2</td><td>Biolegend</td><td>1054602</td><td>Uso a 10 & micro; g/mL</td></tr><tr><td>E-selectin</td><td>BD Biosciences</td><td>553749</td><td>Utilizzare a 10 &; micro; g/mL</td></tr><tr><td>VCAM-1</td><td>BD Biosciences</td><td>553330</td><td>Uso a 10 &micro; g/mL</td></tr><tr><td>ICAM-1</td><td>Becton Dickinson</td><td>553250</td><td>Utilizzare a 10 &; micro; g/mL</td></tr><tr><td>anti-ratto IgG-FITC</td><td>Jackson Immuno Research</td><td>112-095-006</td><td>Uso a 10 &; micro; g/mL</td></tr><tr><td>criceto anti-FITC</td><td>Jackson Immuno Research</td><td>127-095-160</td><td>Uso a 10 &; micro; g/mL</td></tr><tr><td>Controllo dell'isotipia IgG di ratto</td><td>Invitrogen</td><td>10700</td><td>Utilizzare a 10 &micro; g/mL</td></tr><tr><td>Criceto armeno Controllo dell'isotipo IgG</td><td>Invitrogen</td><td>PA5-33220</td><td>Utilizzare a 10 &; micro; g/mL</td></tr><tr><td>P-I&kappa; &beta;-&alpha;</td><td>Segnalazione cellulare</td><td>2859</td><td>Utilizzo a 10 & micro; g/mL</td></tr><tr><td>&beta;-Actina</td><td>Sigma</td><td>A5441</td><td>Utilizzare a 10 &micro; g/mL</td></tr><tr><td>Segnalazione cellulare</td><td>P-ERK</td><td>9101</td><td>Utilizzo a 10 &; micro; g/mL</td></tr><tr><td>anti-topo HRP</td><td>GE Healthcare</td><td>LNXA931/AE</td><td>Uso a 1:10.000</td></tr><tr><td>anti-coniglio HRP</td><td>GE Healthcare</td><td>LNA934V/AG</td><td>Uso a 1:10.000</td></tr><tr><td>anti-ratto HRP</td><td>Santa Cruz</td><td>Sc-3823</td><td>Uso a 1:10.000</td></tr></tbody></table>

saggi per caratterizzare nuovi endoteliale regolatori coinvolti nella risposta infiammatoria di screening

Screening Assays to Characterize Novel Endothelial Regulators Involved in the Inflammatory Response

Lo strato endoteliale è essenziale per il mantenimento dell'omeostasi nel corpo controllando molte funzioni diverse. Regolamento della risposta infiammatoria dallo strato endoteliale è fondamentale per combattere efficientemente ingressi è nocivi e aiuto nel recupero di aree danneggiate. Quando le cellule endoteliali sono esposti a un ambiente infiammatorio, ad esempio il componente esterno della membrana di batteri gram-negativi, lipopolisaccaride (LPS), esprimono solubile citochine pro-infiammatorie, quali Ccl5, Cxcl1 e Cxcl10 e innescare il attivazione dei leucociti circolanti. Inoltre, l'espressione di molecole di adesione sulla superficie endoteliale E-selectina, VCAM-1 e ICAM-1 consente l'interazione e l'adesione dei leucociti attivati per lo strato endoteliale e alla fine lo stravaso verso il tessuto infiammato. In questo scenario, la funzione endoteliale debba essere strettamente regolata perché attivazione eccessiva o difettosa nel reclutamento dei leucociti potrebbe portare a patologie infiammatorie. Poiché molti di questi disordini non hanno un trattamento efficace, è necessario studiare nuove strategie con un focus sullo strato vascolare. Vi proponiamo le analisi complete che sono utili per la ricerca di nuovi regolatori endoteliale che modificano la funzione del leucocita. Analizziamo l'attivazione endoteliale tramite le destinazioni di espressione specifici coinvolti nel reclutamento leucocitario (ad esempio, citochine, chemochine e molecole di adesione) con diverse tecniche, tra cui: (reazione a catena della polimerasi quantitativa in tempo reale RT-qPCR), western-blot, saggi di adesione e citometria di flusso. Questi approcci determinano la funzione endoteliale in contesto infiammatorio e sono molto utili per eseguire analisi di selezione per caratterizzare nuovi regolatori infiammatori endoteliale che sono potenzialmente utili per la progettazione di nuove strategie terapeutiche.

Valutazione dell'attivazione delle cellule endoteliali indotta da LPS da RT-qPCR
Le cellule di MLEC-04 siero morto di fame sono state stimolate da 100 ng/mL di LPS per 6 h, e l'espressione genica endoteliale è stata valutata mediante RT-qPCR confrontando l'espressione di marcatori di attivazione alla condizione di riposo. Come mostrato in Figura 1A, le cellule incubate LPS MLEC-04 ha indotto l'espressi...

Endotelio vascolare controlla strettamente reclutamento leucocitario. Diapedesi inadeguata contribuiscono a malattie infiammatorie umane. Di conseguenza, alla ricerca di nuovi elementi regolatori dell'attivazione endoteliale è necessaria ideare terapie migliori per disordini infiammatori. Qui, descriviamo una metodologia globale per caratterizzare nuovi regolatori endoteliale che possono modificare del leucocita traffico durante l'infiammazione.

Saggi per caratterizzare nuovi endoteliale regolatori coinvolti nella risposta infiammatoria di screening

The endothelial layer is essential for maintaining homeostasis in the body by controlling many different functions. Regulation of the inflammatory ...

L'obiettivo generale di questo test di screening è quello di caratterizzare nuovi regolatori endoteliali coinvolti nella risposta infiammatoria di interesse per la progettazione di nuove strategie terapeutiche contro i disturbi infiammatori. Questo metodo può aiutare a rispondere a domande chiave nel campo della patologia, come la definizione di nuovi farmaci mirati all'endotelio in grado di attenuare le malattie correlate all'infiammazione. Il vantaggio principale di questo protocollo endoteliale è che descrive la tecnologia di dosaggio che stabilisce le basi per esplorare nuovi meccanismi coinvolti nella regolazione della risposta infiammatoria. A dimostrare questa metodologia saranno Maria Angeles Higueras, post-doc del nostro laboratorio e Sandra Herranz, un tecnico del nostro laboratorio. Per iniziare, coltivare le cellule MLEC-04 in terreno DMEM F12 completo integrato con il 10% di FBS e Pen-Strep.Incubare le cellule in un incubatore biologico a 37

screening-assays-to-characterize-novel-endothelial-regulators

Research

Ricerca

JoVE Journal

Immunology and Infection

Immunologia e Infezioni

Camere di flusso Microfluidic incisi da fotolitografia e fabbricati da PDMS sono applicate per sondare gli esiti funzionali associati alla disfunzione CE e l'infiammazione. In un esperimento rappresentativo, la capacità di sforzo di taglio differenziale di modulare l'adesione cellulare monocitica di citochina attivato CE monostrati è dimostrata.

On-Chip Fenotipizzazione Endothelial infiammatoria

Qui descriviamo un romanzo ad alto contenuto di test infiammazione indotta chimicamente finalizzate alla individuazione di immuno-modulatori bioattivi. Abbiamo unito con successo la microscopia automatizzata con software sviluppati script personalizzati che consentano la quantificazione automatizzata della risposta infiammatoria, nonché ulteriore elaborazione dati, analisi, estrazione e stoccaggio.

Facilitare Drug Discovery: un sistema automatico di alta Tenore infiammazione in Zebrafish

L'adesione dei neutrofili all'endotelio attivato nei siti di infezione è una componente integrale della risposta infiammatoria dell'ospite. Descritto in questo rapporto è un saggio di legame dei neutrofili che permette...

Quantitative<em&gt; In vitro</em&gt; Assay misurare Adesione neutrofili attivati ​​per primarie umane endoteliali microvascolari in condizioni statiche

Il saggio di formazione del tubo è un metodo veloce e quantificabili per misurare l'angiogenesi in vitro. Le cellule endoteliali sono combinati con i media condizionati e piastrate su estratto di membrana basale. Formazione del tubo avviene entro ore e tubuli appena formati facilmente quantificabile.

Endoteliali Tubo cellulare saggio Formazione per la<em&gt; In Vitro</em&gt; Studio di Angiogenesi

L'accessibilità di modelli affidabili per studiare le interazioni vascolari del sangue negli esseri umani è carente. Presentiamo un modello in vitro di cellule endoteliali umane primarie in coltura combinate con sangue intero umano per studiare le interazioni cellulari sia nel sangue (ELISA) che nel compartimento vascolare (microscopia).

A Novel In vitro Modello per lo studio delle interazioni tra l'uomo di sangue intero e l'endotelio

Descriviamo un semplice test su cellule-base per la rilevazione, la quantificazione e il monitoraggio dell'attività dei membri della famiglia endoteliale vascolare del fattore di crescita dei leganti. Il saggio utilizza recettori chimerici espressi in una linea cellulare fattore dipendente per fornire una valutazione semiquantitativa o quantitativa di legame recettoriale e reticolazione del legante.

Un saggio biologico semplice per la valutazione dei fattori di crescita dell&#39;endotelio vascolare

Questo manoscritto descrive un saggio di formazione di tubi per quantificare gli effetti di un dato composto o condizione sull'angiogenesi utilizzando la formazione di tubi di cellule endoteliali in un ambiente controllato.

Strategico cellule endoteliali tubo saggio Formazione: Confronto tra matrice extracellulare e fattore di crescita ridotto matrice extracellulare

Vi presentiamo un modello in vitro che permette lo studio e l'analisi di coagulazione in intero, anticoagulato. L'anticoagulazione nel sistema dipende l'effetto anticoagulante naturale delle cellule endoteliali sane e attivazione endoteliale delle cellule si tradurrà nella coagulazione.

Valutazione delle proprietà anticoagulanti e anti-infiammatori delle cellule endoteliali mediante coltura cellulare 3D e Non intero anticoagulato

Dinamica adesione delle cellule immuni alla parete del vaso è un prerequisito per homing gut. Qui, presentiamo un protocollo per un'analisi funzionale in vitro per l'analisi dell'impatto degli anticorpi anti-integrina, chemochine o altri fattori sull'adesione di dinamica delle cellule delle cellule umane utilizzando capillari α4β7 rivestite.

Analisi di adesione dinamico per l'analisi funzionale delle terapie di anti-adesione nelle malattie intestinali infiammatorie

Questo protocollo dettagliato fornisce una descrizione dettagliata della messa a punto sperimentale e analisi dei dati per la valutazione delle risposte infiammatorie in hiPSC-ECs e l'analisi di adesione del leucocita sotto flusso fisiologico.

Saggio di microfluidic per la valutazione di adesione del leucocita alle cellule endoteliali derivate da cellule staminali pluripotenti indotte umane (hiPSC-ECs)

Impara a caratterizzare nuovi regolatori endoteliali coinvolti nella risposta infiammatoria. Questo metodo consente di studiare il traffico dei leucociti e sviluppare strategie terapeutiche per patologie infiammatorie.

Saggi per caratterizzare nuovi endoteliale regolatori coinvolti nella risposta infiammatoria di screening

Esplora altri video