Name: Un quadro metodologico unificato per la ricerca di Schwannoma Vestibolare (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-06-20T13:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 43 s
Description: Impara a processare campioni di schwannoma vestibolare umano per colture cellulari primarie e analisi delle secrezioni tumorali. Questo metodo minimamente invasivo preserva la vitalità cellulare e consente di testare candidati terapeutici direttamente sulle cellule coltivate.

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Questo lavoro è stato sostenuto dall&#39;Istituto Nazionale di Sordità e altri Disturbi della Comunicazione con sovvenzioni R01DC015824 (KMS) e T32DC00038 (sostenendo JES e SD), il Dipartimento della Difesa concede la W81XWH-14-1-0091 (KMS), la Fondazione Bertarelli (KMS) , La Fondazione di Nancy Sayles Day (KMS), il Centro di ricerca del tinnito di Lauer (KMS) e la Fondazione Barnes (KMS).

<ol><li>Babu, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Vestibular+schwannomas+in+the+modern+era%3A+epidemiology%2C+treatment+trends%2C+and+disparities+in+management%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosurg%22%5BJournal%5D)">Vestibular schwannomas in the modern era: epidemiology, treatment trends, and disparities in management.</a> J Neurosurg. 119 (1), 121-130 (2013).</li>
<li>Gal, T. J., Shinn, J., Huang, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Current+epidemiology+and+management+trends+in+acoustic+neuroma%5BTitle%5D)+AND+%22Otolaryngol+Head+Neck+Surg%22%5BJournal%5D)">Current epidemiology and management trends in acoustic neuroma.</a> Otolaryngol Head Neck Surg. 142 (5), 677-681 (2010).</li>
<li>Propp, J. M., McCarthy, B. J., Davis, F. G., Preston-Martin, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Descriptive+epidemiology+of+vestibular+schwannomas%5BTitle%5D)+AND+%22Neuro+Oncol%22%5BJournal%5D)">Descriptive epidemiology of vestibular schwannomas.</a> Neuro Oncol. 8 (1), 1-11 (2006).</li>
<li>Stangerup, S. E., Tos, M., Thomsen, J., Caye-Thomasen, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((True+incidence+of+vestibular+schwannoma%3F%5BTitle%5D)+AND+%22Neurosurgery%22%5BJournal%5D)">True incidence of vestibular schwannoma?</a> Neurosurgery. 67 (5), 1335-1340 (2010).</li>
<li>Tos, M., Stangerup, S. E., Caye-Thomasen, P., Tos, T., Thomsen, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((What+is+the+real+incidence+of+vestibular+schwannoma%3F%5BTitle%5D)+AND+%22Arch+Otolaryngol+Head+Neck+Surg%22%5BJournal%5D)">What is the real incidence of vestibular schwannoma?</a> Arch Otolaryngol Head Neck Surg. 130 (2), 216-220 (2004).</li>
<li>Stangerup, S. E., Caye-Thomasen, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Epidemiology+and+natural+history+of+vestibular+schwannomas%5BTitle%5D)+AND+%22Otolaryngol+Clin+North+Am%22%5BJournal%5D)">Epidemiology and natural history of vestibular schwannomas.</a> Otolaryngol Clin North Am. 45 (2), 257-268 (2012).</li>
<li>Mahaley, M. S., Mettlin, C., Natarajan, N., Laws, E. R., Peace, B. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Analysis+of+patterns+of+care+of+brain+tumor+patients+in+the+United+States%3A+a+study+of+the+Brain+Tumor+Section+of+the+AANS+and+the+CNS+and+the+Commission+on+Cancer+of+the+ACS%5BTitle%5D)+AND+%22Clin+Neurosurg%22%5BJournal%5D)">Analysis of patterns of care of brain tumor patients in the United States: a study of the Brain Tumor Section of the AANS and the CNS and the Commission on Cancer of the ACS.</a> Clin Neurosurg. 36, 347-352 (1990).</li>
<li>Carlson, M. L., Link, M. J., Wanna, G. B., Driscoll, C. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Management+of+sporadic+vestibular+schwannoma%5BTitle%5D)+AND+%22Otolaryngol+Clin+North+Am%22%5BJournal%5D)">Management of sporadic vestibular schwannoma.</a> Otolaryngol Clin North Am. 48 (3), 407-422 (2015).</li>
<li>Dilwali, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sporadic+vestibular+schwannomas+associated+with+good+hearing+secrete+higher+levels+of+fibroblast+growth+factor+2+than+those+associated+with+poor+hearing+irrespective+of+tumor+size%5BTitle%5D)+AND+%22Otol+Neurotol%22%5BJournal%5D)">Sporadic vestibular schwannomas associated with good hearing secrete higher levels of fibroblast growth factor 2 than those associated with poor hearing irrespective of tumor size.</a> Otol Neurotol. 34 (4), 748-754 (2013).</li>
<li>Caye-Thomasen, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((VEGF+and+VEGF+receptor-1+concentration+in+vestibular+schwannoma+homogenates+correlates+to+tumor+growth+rate%5BTitle%5D)+AND+%22Otol+Neurotol%22%5BJournal%5D)">VEGF and VEGF receptor-1 concentration in vestibular schwannoma homogenates correlates to tumor growth rate.</a> Otol Neurotol. 26 (1), 98-101 (2005).</li>
<li>Koutsimpelas, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+VEGF%2FVEGF-R+axis+in+sporadic+vestibular+schwannomas+correlates+with+irradiation+and+disease+recurrence%5BTitle%5D)+AND+%22ORL+J+Otorhinolaryngol+Relat+Spec%22%5BJournal%5D)">The VEGF/VEGF-R axis in sporadic vestibular schwannomas correlates with irradiation and disease recurrence.</a> ORL J Otorhinolaryngol Relat Spec. 74 (6), 330-338 (2012).</li>
<li>Dilwali, S., Roberts, D., Stankovic, K. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Interplay+between+VEGF-A+and+cMET+signaling+in+human+vestibular+schwannomas+and+schwann+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Biol+Ther%22%5BJournal%5D)">Interplay between VEGF-A and cMET signaling in human vestibular schwannomas and schwann cells.</a> Cancer Biol Ther. 16 (1), 170-175 (2015).</li>
<li>Dilwali, S., Kao, S. Y., Fujita, T., Landegger, L. D., Stankovic, K. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nonsteroidal+anti-inflammatory+medications+are+cytostatic+against+human+vestibular+schwannomas%5BTitle%5D)+AND+%22Transl+Res%22%5BJournal%5D)">Nonsteroidal anti-inflammatory medications are cytostatic against human vestibular schwannomas.</a> Transl Res. 166 (1), 1-11 (2015).</li>
<li>Dilwali, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Preclinical+validation+of+anti-nuclear+factor-kappa+B+therapy+to+inhibit+human+vestibular+schwannoma+growth%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Oncol%22%5BJournal%5D)">Preclinical validation of anti-nuclear factor-kappa B therapy to inhibit human vestibular schwannoma growth.</a> Mol Oncol. 9 (7), 1359-1370 (2015).</li>
<li>Dilwali, S., Landegger, L. D., Soares, V. Y., Deschler, D. G., Stankovic, K. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Secreted+Factors+from+Human+Vestibular+Schwannomas+Can+Cause+Cochlear+Damage%5BTitle%5D)+AND+%22Sci+Rep%22%5BJournal%5D)">Secreted Factors from Human Vestibular Schwannomas Can Cause Cochlear Damage.</a> Sci Rep. 5, 18599(2015).</li>
<li>Blakeley, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Development+of+drug+treatments+for+neurofibromatosis+type+2-associated+vestibular+schwannoma%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Opin+Otolaryngol+Head+Neck+Surg%22%5BJournal%5D)">Development of drug treatments for neurofibromatosis type 2-associated vestibular schwannoma.</a> Curr Opin Otolaryngol Head Neck Surg. 20 (5), 372-379 (2012).</li>
<li>Schroeder, R. D., Angelo, L. S., Kurzrock, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((NF2%2Fmerlin+in+hereditary+neurofibromatosis+2+versus+cancer%3A+biologic+mechanisms+and+clinical+associations%5BTitle%5D)+AND+%22Oncotarget%22%5BJournal%5D)">NF2/merlin in hereditary neurofibromatosis 2 versus cancer: biologic mechanisms and clinical associations.</a> Oncotarget. 5 (1), 67-77 (2014).</li>
<li>Schularick, N. M., Clark, J. J., Hansen, M. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Primary+culture+of+human+vestibular+schwannomas%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Primary culture of human vestibular schwannomas.</a> J Vis Exp. (89), (2014).</li>
<li>Dilwali, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Primary+culture+of+human+Schwann+and+schwannoma+cells%3A+improved+and+simplified+protocol%5BTitle%5D)+AND+%22Hear+Res%22%5BJournal%5D)">Primary culture of human Schwann and schwannoma cells: improved and simplified protocol.</a> Hear Res. , 25-33 (2014).</li>
<li>Brown, C. M., Ahmad, Z. K., Ryan, A. F., Doherty, J. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Estrogen+receptor+expression+in+sporadic+vestibular+schwannomas%5BTitle%5D)+AND+%22Otol+Neurotol%22%5BJournal%5D)">Estrogen receptor expression in sporadic vestibular schwannomas.</a> Otol Neurotol. 32 (1), 158-162 (2011).</li>
<li>Cioffi, J. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((MicroRNA-21+overexpression+contributes+to+vestibular+schwannoma+cell+proliferation+and+survival%5BTitle%5D)+AND+%22Otol+Neurotol%22%5BJournal%5D)">MicroRNA-21 overexpression contributes to vestibular schwannoma cell proliferation and survival.</a> Otol Neurotol. 31 (9), 1455-1462 (2010).</li>
<li>Doherty, J. K., Ongkeko, W., Crawley, B., Andalibi, A., Ryan, A. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((ErbB+and+Nrg%3A+potential+molecular+targets+for+vestibular+schwannoma+pharmacotherapy%5BTitle%5D)+AND+%22Otol+Neurotol%22%5BJournal%5D)">ErbB and Nrg: potential molecular targets for vestibular schwannoma pharmacotherapy.</a> Otol Neurotol. 29 (1), 50-57 (2008).</li>
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<li>Cattoretti, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Monoclonal+antibodies+against+recombinant+parts+of+the+Ki-67+antigen+%28MIB+1+and+MIB+3%29+detect+proliferating+cells+in+microwave-processed+formalin-fixed+paraffin+sections%5BTitle%5D)+AND+%22J+Pathol%22%5BJournal%5D)">Monoclonal antibodies against recombinant parts of the Ki-67 antigen (MIB 1 and MIB 3) detect proliferating cells in microwave-processed formalin-fixed paraffin sections.</a> J Pathol. 168 (4), 357-363 (1992).</li>
<li>Hung, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Immunohistochemistry+study+of+human+vestibular+nerve+schwannoma+differentiation%5BTitle%5D)+AND+%22Glia%22%5BJournal%5D)">Immunohistochemistry study of human vestibular nerve schwannoma differentiation.</a> Glia. 38 (4), 363-370 (2002).</li>
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<li>Zinn, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+Silico+Reconstruction+of+the+Viral+Evolutionary+Lineage+Yields+a+Potent+Gene+Therapy+Vector%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Rep%22%5BJournal%5D)">In Silico Reconstruction of the Viral Evolutionary Lineage Yields a Potent Gene Therapy Vector.</a> Cell Rep. 12 (6), 1056-1068 (2015).</li>
<li>Kim, B. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sulforaphane%2C+a+natural+component+of+broccoli%2C+inhibits+vestibular+schwannoma+growth+in+vitro+and+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22Sci+Rep%22%5BJournal%5D)">Sulforaphane, a natural component of broccoli, inhibits vestibular schwannoma growth in vitro and in vivo.</a> Sci Rep. 6, 36215(2016).</li>
<li>Soares, V. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Extracellular+vesicles+derived+from+human+vestibular+schwannomas+associated+with+poor+hearing+damage+cochlear+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Neuro+Oncol%22%5BJournal%5D)">Extracellular vesicles derived from human vestibular schwannomas associated with poor hearing damage cochlear cells.</a> Neuro Oncol. 18 (11), 1498-1507 (2016).</li>
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<li>Caye-Thomasen, P., Borup, R., Stangerup, S. E., Thomsen, J., Nielsen, F. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Deregulated+genes+in+sporadic+vestibular+schwannomas%5BTitle%5D)+AND+%22Otol+Neurotol%22%5BJournal%5D)">Deregulated genes in sporadic vestibular schwannomas.</a> Otol Neurotol. 31 (2), 256-266 (2010).</li>
<li>Schulz, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+importance+of+nerve+microenvironment+for+schwannoma+development%5BTitle%5D)+AND+%22Acta+Neuropathol%22%5BJournal%5D)">The importance of nerve microenvironment for schwannoma development.</a> Acta Neuropathol. 132 (2), 289-307 (2016).</li>
<li>Torres-Martin, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Global+profiling+in+vestibular+schwannomas+shows+critical+deregulation+of+microRNAs+and+upregulation+in+those+included+in+chromosomal+region+14q32%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Global profiling in vestibular schwannomas shows critical deregulation of microRNAs and upregulation in those included in chromosomal region 14q32.</a> PLoS One. 8 (6), e65868(2013).</li>
</ol>

Gli autori non hanno niente da rivelare.

Questo manoscritto descrive un quadro metodologico unificato per la ricerca VS, che descrive la lavorazione simultanea di esemplari di VS e GAN umani per applicazioni di ricerca a valle. Poiché la ricerca VS entra nell&#39;epoca della medicina di precisione, preparando lo stesso campione in forme in grado di rispondere a numerose domande di ricerca, consentirà la scoperta di visioni molecolari, cellulari, genetiche e proteomiche specifiche per singoli pazienti. La purezza della cellula umana...

Gli schwannomi vestibolari (VSs) sono le neoplasie più comuni dell&#39;angolo del cerebellopotina, diagnosticate in 1 ogni 100.000 individui. Anche se non metastatici, questi tumori influenzano gravemente la qualità della vita di un paziente 1 , 2 , 3 , 4 , 5 , 6 . Gli individui affetti abitualmente vivono con perdita dell&#39;udito, tinnito e una sensazione di pienezza ascoltale. I sintomi diventano sempre più debilitanti quando il tumore cresce, causando problemi di equilibrio, paralisi facciale e alterazioni delle altre funzioni del nervo cranico. Anche le complicazioni pericolose per la vita a causa della compressione del tronco cerebrale possono avere luogo 7 . Le opzioni di gestione per VS sono essenzialmente limitate all&#39;attesa vigile di tumori statici e terapia radioterapica stereotattica o resezione chirurgica per tumori in crescita <sUp class = &quot;xref&quot;&gt; 8. La rimozione chirurgica di questi tumori negli ospedali affiliati alla ricerca presenta l&#39;opportunità di acquisire e analizzare i tessuti freschi del tumore raccolti durante interventi di pazienti. Un approccio chirurgico specifico alla VS, la resezione translabellinale, può anche offrire l&#39;accesso a preziosi epitelio umano sensoriale dall&#39;orecchio e dalla periferia. Poiché VS provengono da un nervo sensoriale periferico ( vale a dire il nervo vestibolare), è importante confrontare le osservazioni associate a VS con quelle derivate da un appropriato nervo di controllo, come il grande nervo auricolare umano (GAN). GANs sani vengono sacrificati regolarmente durante le parotidectomie o le dissezioni del collo e possono essere utilizzate come modelli robusti per una fisiologia sana di Schwann 9 . Poiché non esistono farmaci approvati dalla FDA per il trattamento o la prevenzione di VS sporadiche, è indispensabile che i ricercatori illustrano la mecha molecolare sottostanteGli effetti della malattia per identificare i bersagli terapeutici. Le proteine ​​che hanno dimostrato di avere un ruolo nella patogenesi della VS includono il fattore di crescita endoteliale vascolare (VEGF), la cicloossigenasi 2 (COX-2), il fattore nucleare kappa B (NF-κB), il fattore di necrosi tumorale (TNF-alfa) , Il recettore del fattore di crescita epidermico (EGFR) e le relative molecole di segnalazione 10 , 11 , 12 , 13 , 14 , 15 , 16 , 17 . I progressi recenti hanno ampliato e migliorato i protocolli per la raccolta, l&#39;elaborazione, la cultura e l&#39;analisi a valle degli schwannomi vestibolari umani primari e dei tessuti nervosi sani 18 , 19 . Tuttavia, la maggior parte dei protocolli esistenti sono progettati per ospitare la preparazioneZione di tali tessuti per un&#39;unica applicazione di ricerca a valle ( vale a dire, solo la coltura cellulare). Questo articolo presenta un quadro metodologico unificato per l&#39;elaborazione simultanea di un singolo campione primario umano VS o GAN per più applicazioni a valle: cultura specifica di tipo cellulare, estrazione proteica, conservazione RNA, raccolta della secrezione tumorale e fissazione tissutale. Questo lavoro illustra anche la raccolta chirurgica e l&#39;elaborazione del fluido cerebrospinale umano (CSF) e della periliazione durante la resezione transcirculinata VS, in quanto questi tessuti strettamente correlati possono servire come fonti importanti di biomarcatori per VS. Infine, questo protocollo presenta passi per la trasduzione virale delle cellule VS umane primarie nella coltura come nuova applicazione di questo tessuto per l&#39;uso nella terapia genica.

<table><tbody><tr><td>BioCoat Poly-D-Lisina/Laminin 12 mm #1 Vetrino coprioggetti tedesco</td><td>Corning</td><td>354087</td><td>Oppure preparare i vetrini coprioggetti con Corning Laminin (CB-40232) e Cultrex Poly-L-Lysine (3438-100-01)</td></tr><tr><td>CELLSTAR 15 mL Provette per centrifuga, fondo conico, graduazione, sterile</td><td>Greiner Bio-One</td><td>188161</td><td></td></tr><tr><td>CELLSTAR 50 mL Provette per centrifuga, fondo conico, graduazione, sterile</td><td>Greiner Bio-One</td><td>227261</td><td></td></tr><tr><td>Piatto per colture cellulari CELLSTAR, 60 mm</td><td>Greiner Bio-One</td><td>628160</td><td></td></tr><tr><td>Collagenasi da Clostridium histolyticum, filtrato sterile</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C1639</td><td></td></tr><tr><td>Costar 24 Well Clear TC-Treated Multiple Well Well Pool Plates, sterile</td><td>Corning</td><td>3526</td><td></td></tr><tr><td>DAPI (4',6-Diamidino-2-Fenilindolo, Dicloridrato)</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>D1306</td><td></td></tr><tr><td>DMEM, glicemia alta, piruvato, senza glutammina, 500 mL</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>10313-039</td><td></td></tr><tr><td>DMEM/F-12, 500 mL</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>11320-033</td><td></td></tr><tr><td>Dumont #3 Pinze, Dumoxel</td><td>Fine Science Tools</td><td>11231-30</td><td>Autoclave prima dell'uso</td></tr><tr><td>Dumont #5 Pinze, punta standard, Inox</td><td>Fine Science Tools</td><td>11251-20</td><td>Autoclave prima dell'uso</td></tr><tr><td>Siero fetale bovino, qualificato, regioni approvate dall'USDA, 500 ml Thermo</td><td>Fisher Scientific</td><td>10437-028</td><td>Aliquotare in provette da 50 ml e conservare in -20 gradi C congelatore</td></tr><tr><td>Ialuronidasi da testicoli bovini, tipo I-S, polvere liofilizzata</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>H3506</td><td></td></tr><tr><td>Millex-GP siringa unità filtro, 0,22 e micro; m, polietersulfone, 33 mm, sterile</td><td>EMD Millipore</td><td>SLGP033RS</td><td></td></tr><tr><td>Paraformaldeide, grado di reagente, cristallino</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P6148</td><td>Prima dell'uso: Stabilire procedure operative standard basate sui protocolli disponibili online</td></tr><tr><td>PBS, pH 7,4, 500 mL</td> Autoclave <td>Thermo Fisher Scientific</td><td>10010-023</td><td>prima dell'uso</td></tr><tr><td>Penicillina-Streptomicina (10.000 U/mL), 100 mL</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>15140-122</td><td></td></tr><tr><td>Compresse di inibitori della fosfatasi PhosSTOP</td><td>Roche</td><td>04906845001</td><td></td></tr><tr><td>Pierce Compresse di inibitori della proteasi</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>88666</td><td></td></tr><tr><td>Pipette e puntali per pipette, 5/10/25 mL</td><td></td><td>Pestello</td> per omogeneizzazione in plastica variabile <td></td></tr> variabile <tr><td>da 1,5/2,0 mL E</td><td>& K Scientific</td><td>EK-10539</td><td></td></tr><tr><td>Aghi PrecisionGlide, 27 G x 1 1/2 in</td><td>BD</td><td>301629</td><td></td></tr><tr><td>tampone RIPA</td><td>Boston BioProducts</td><td>BP-115</td><td></td></tr><tr><td>RNAlater (soluzione di stabilizzazione dell'RNA)</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>AM7021</td><td></td></tr><tr><td>Provette per microcentrifuga Safe-Lock, polipropilene, 0,5 mL</td><td></td><td>Eppendorf</td><td>022363719 Autoclave prima dell'uso</td></tr><tr><td>Provette per microcentrifuga Safe-Lock, polipropilene, 1,5 mL</td><td>Autoclave Eppendorf</td><td>022363204</td><td>prima dell'uso</td></tr><tr><td>Soluzione salina - Iniezione di cloruro di sodio allo 0,9%, batteriostatica, 20 mL</td><td>Hospira</td><td>0409-1966-05</td><td></td></tr><tr><td>Lame per bisturi - #15</td><td>Fine Science Tools</td><td>10015-00</td><td></td></tr><tr><td>Tubo di aspirazione Schuknecht calibro 24</td><td>Bausch + Lomb</td><td>N1698 42</td><td>Utile per l'approccio chirurgico (in aggiunta ai comuni strumenti chirurgici otologici) e ad es un marcatore chirurgico blu</td></tr><tr><td>Contenitore per campioni, OR sterile, 4OZ</td><td>Medline</td><td>DYND30331H</td><td></td></tr><tr><td>Stereomicroscopio Stemi 2000-C</td><td>Zeiss</td><td>000000-1106-133</td><td></td></tr><tr><td>Combinazione siringa/ago, punta Luer-Lok, 5 mL, 22 G x 1 in.</td><td>BD</td><td>309630</td><td></td></tr><tr><td>Solo siringa per tubercolina, punta a scorrimento, 1 mL</td><td>309659</td><td></td><td></td></tr><tr><td>solo siringa per tubercolina, punta a scorrimento, 3 mL</td><td>BD</td><td>309656</td><td></td></tr><tr><td>Omogeneizzatore a ultrasuoni, serie 4710, sonda CV18</td><td>Cole-Parmer</td><td>CP25013</td><td></td></tr></tbody></table>

un quadro metodologico unificato per la ricerca di schwannoma vestibolare

A Unified Methodological Framework for Vestibular Schwannoma Research

Gli schwannomi vestibolari sono le neoplasie più comuni dell&#39;angolo cerebellopotintico, che costituiscono il 6-8% per cento di tutte le crescite intracraniche. Sebbene questi tumori causino perdita uditiva sensa-neurale fino al 95% degli individui affetti, i meccanismi molecolari che sottendono questa perdita dell&#39;udito rimangono inaspettati. Questo articolo delinea i passi stabiliti nel nostro laboratorio per facilitare la raccolta e l&#39;elaborazione di vari campioni di tessuto umano primario per applicazioni di ricerca a valle integrate nello studio degli schwannomi vestibolari. In particolare, questo lavoro descrive un quadro metodologico unificato per la raccolta, l&#39;elaborazione e la coltura di Schwann e schwannoma da campioni chirurgici. Questo è integrato con processi di elaborazione parallela ora considerati essenziali per la ricerca attuale: la raccolta di secrezioni tumorali e nervose, la conservazione dell&#39;RNA e l&#39;estrazione di proteine ​​dai tessuti raccolti, la fissazione del tessuto per la preparazione di sezioni,D l&#39;esposizione delle cellule umane primarie ai virus adeno-associati per l&#39;applicazione alla terapia genica. Inoltre, questo lavoro mette in evidenza l&#39;approccio chirurgico traslabellinoso per raccogliere questo tumore come un&#39;occasione unica per ottenere l&#39;epitelio umano sensoriale dall&#39;orecchio e dalla periferia. Sono forniti suggerimenti per migliorare la qualità sperimentale e mettere in evidenza metodi comuni.

Le cellule VS umane primarie nella cultura, come stabilito nella sezione 5, possono essere trattate come modelli informativi per i processi associati alle malattie in molte applicazioni di ricerca a valle ( Figura 1 ). Le cellule Schwann sane coltivate nella sezione 6 forniscono un punto di confronto diretto e istruttivo. Come descritto di seguito, i dati estesi dei VS e dei GAN elaborati in base a questo quadro metodologico unificato sono disponibili in più...

L&#39;obiettivo di questo protocollo è quello di delineare la raccolta e l&#39;elaborazione di campioni chirurgici umani per molteplici applicazioni a valle nello schwannoma vestibolare e nella ricerca delle cellule di Schwann.

Un quadro metodologico unificato per la ricerca di Schwannoma Vestibolare

Vestibular schwannomas are the most common neoplasms of the cerebellopontine angle, making up 6-8% percent of all intracranial growths. Though these ...

L'obiettivo generale di questa procedura è quello di processare un campione umano di schwannoma vestibolare ricevuto dalla sala operatoria per la coltura cellulare primaria e la raccolta delle secrezioni tumorali. Questo metodo può contribuire a rispondere a domande fondamentali nel campo della ricerca sullo schwannoma vestibolare, come ad esempio il modo migliore per ricevere, conservare ed elaborare un campione tumorale primario umano destinato all'uso in diversi saggi biomolecolari. Il principale vantaggio di questa tecnica consiste nell'utilizzo di un metodo di coltura minimamente manipolativo per la propagazione di cellule primarie umane di schwannoma vestibolare.Le implicazioni di questa tecnica si estendono alla terapia del schwannoma vestibolare poiché potenziali candidati terapeutici possono essere testati direttamente su cellule in coltura. Iniziare trasferendo il contenitore del campione contenente il schwannoma vestibolare appena reperito o il campione del nervo auricolare maggiore dal ghiaccio utilizzato per il trasporto dalla sala operatoria all'incubatore a flusso laminare in laboratorio. Utilizzare pinze sterili per trasferire con attenzione il campione nel primo di tre tubi da 1,5 millilitri riempiti con 1,4 millilitri di PBS esterno.Chiudere ogni provetta una volta che contiene il campione e agitare delicatamente per lavare. Collocare il campione in una piastra di Petri asciutta da 60 millimetri ed utilizzare pinze per rimuovere tutti i tessuti morti nelle aree con vasi sanguigni prominenti. Utilizzare pinze o una lama di bisturi per dividere il campione in pezzi separati per la conservazione dell'RNA, l'estrazione delle proteine, la raccolta delle secrezioni, la fissazione e la coltura cellulare.Trasferire il frammento del campione destinato alla coltura cellulare in una nuova piastra da 60 millimetri contenente da cinque a otto millilitri di mezzo DMEM F12 freddo e integrato. Posizionare il frammento di schwannoma vestibolare o di nervo auricolare maggiore destinato alla raccolta delle secrezioni in una provetta vuota da 1,5 millilitro. Iniziare pipettando 500 microlitri di DMEM non integrato con FBS in due provette da 1,5 millilitro.Il primo tubo verrà utilizzato per raccogliere le secrezioni tumorali e il secondo tubo fungerà da controllo abbinato. Posizionare uno dei tubi contenenti DMEM su una bilancia digitale tarata. Azzerare la bilancia, inserire il pezzo di campione designato per la raccolta delle secrezioni nel tubo e pesarlo.Si annoti il risultato, che rappresenterà il peso del tessuto esclusivamente. Sotto una cappa a flusso laminare, si regoli il volume di DMEM nel tubo a 100 microlitri per ogni 10 milligrammi del campione. Si ponga il tubo contenente il campione di tessuto e il relativo controllo nell'incubatore.Incubare per almeno 72 ore, al fine di raccogliere quantità biologicamente utili di secrezioni tumorali o nervose. Dopo un'incubazione di 72 ore, utilizzare una pipetta da un millilitro per rimuovere il mezzo contenente le secrezioni dal campione. Per evitare cicli ripetuti di congelamento e scongelamento, suddividere il mezzo in aliquote in nuove provette in base all'analisi successiva prevista.Conservare il frammento originale di tessuto, le secrezioni e il DMEM di controllo in un congelatore a meno 80 gradi Celsius fino all'inizio delle applicazioni successive. Iniziare la procedura di coltura utilizzando una pinzetta in ciascuna mano per dividere il tessuto del schwannoma vestibolare in frammenti di circa un millilitro cubo. Quindi aspirare il mezzo e i frammenti tumorali con una pipetta sierologica da 10 millimetri e trasferire tutti i contenuti in un tubo conico da 15 millilitri.Centrifugare per tre minuti a 1000G a 25 gradi Celsius. Durante la centrifugazione, preparare il mezzo di disintegrazione mescolando 4,7 millilitri di mezzo DMEM F12 integrato con 250 microlitri di collagenasi e 50 microlitri di ialuronidasi in una piastra di coltura da 60 millimetri. Al termine della centrifugazione, i frammenti tumorali formeranno un pellet sul fondo del tubo conico.Aspirare con attenzione e scartare il soprannatante. Quindi aggiungere due millilitri di mezzo di disintegrazione appena preparato contenente enzimi al frammento tumorale. Pipettare su e gi&ugrave diverse volte per mobilizzare il tessuto, quindi trasferirlo nella piastra per colture di 60 millimetri.Posizionare la piastra di coltura nell'incubatore per 18 ore; il giorno successivo, riscaldare il mezzo DMEM F12 integrato con FBS al 10% e penicillina-streptomicina all'1% in un bagno d'acqua a 37 gradi Celsius. Rimuovere la piastra contenente la coltura di schwannoma vestibolare dall'incubatore e trasferirla nell'hood a flusso laminare. Utilizzando un ago da 22 gauge collegato a una siringa da sei millilitri, aspirare il mezzo contenente la coltura e trasferirlo in un nuovo tubo conico da 15 millimetri.Centrifugare per cinque minuti a 1000G a 37 gradi Celsius. Nel frattempo, utilizzare pinze sterili per posizionare il numero richiesto di coprioggetti in vetro rivestiti con polidilisina e laminina in una piastra da coltura a 24 pozzetti. Da un cubo di tumore di un centimetro di lato si possono coltivare da 24 a 32 pozzetti, quindi per la maggior parte dei tumori più piccoli è appropriato prevedere da otto a sedici pozzetti di cellule in coltura.Dopo la centrifugazione, eliminare il soprannatante e risospendere il pellet cellulare residuo nel mezzo preriscaldato, in modo da ottenere un millilitro di sospensione cellulare per pozzetto previsto. Utilizzare una pipetta sierologica da cinque millilitri per aspirare due millilitri di sospensione cellulare e depositarne un millilitro in un pozzetto della piastra a 24 pozzetti. Continuare ad aspirare e depositare il mezzo contenente le cellule tumorali, aspirando porzioni di due millilitri dalle quali un millilitro viene depositato in ciascun pozzetto previsto, finché la sospensione di cellule tumorali non sia equamente suddivisa tra tutti i pozzetti preparati.Posizionare la piastra a 24 pozzetti nell'incubatrice a 37 gradi Celsius per tutta la notte. Controllare la piastra il giorno successivo; se si osserva un quantitativo significativo di detriti sul fondo dei pozzetti, sostituire con attenzione il mezzo in ciascun pozzetto con del nuovo mezzo di coltura DMEM F12 integrato, avendo cura di non staccare le cellule aderenti. Se non sono presenti detriti, rimettere la piastra nell'incubatrice e sostituire il mezzo per la prima volta al quinto giorno e ogni tre giorni successivamente.Questa immagine in campo chiaro illustra il tipico modello organizzativo delle cellule di schwannoma vestibolare in coltura. Queste immagini di immunofluorescenza di una coltura primaria umana di schwannoma vestibolare sono state ottenute dopo 48 ore di esposizione a ink 80 che esprime GFP, mostrato in verde. La fluorescenza rossa proviene dalla colorazione immunoistochimica con falloidina F-actina, che evidenzia il citoscheletro, mentre la fluorescenza blu è data dal DAPI, che colora il nucleo.L'insetto è un'immagine ad ingrandimento maggiore di una regione dell'immagine a basso ingrandimento. Durante l'esecuzione di questa procedura, è importante annotare i tempi in cui si inseriscono il campione di secreto e il campione di coltura nell'incubatore, per garantire che i passaggi successivi vengano effettuati dopo i corretti periodi di incubazione. Al termine di questa procedura, possono essere eseguiti altri metodi come la trasduzione virale, la fissazione, l'immunofluorescenza, il trattamento con farmaci ed estrazione dell'RNA per rispondere ad ulteriori domande, ad esempio su come diversi virus vengano espressi nelle cellule o su come l'espressione genica cambi dopo il trattamento con farmaci.Dopo il suo sviluppo, questa tecnica ha aperto la strada ai ricercatori nel campo dello studio del schwannoma vestibolare per esplorare il modo in cui le cellule umane primarie rispondono a diversi farmaci in pazienti vivi sottoposti a intervento chirurgico.

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Ricerca sul cancro

Un metodo è descritto per misurare tridimensionali riflessi oculari vestíbulo VOR (3D) nell'uomo utilizzando un sei gradi di libertà (6DF) simulatore di movimento. Il guadagno e disallineamento angolare del VOR 3D forniscono una misura diretta della qualità della funzione vestibolare. Dati rappresentativi su soggetti sani sono...

Tridimensionale vestibolare oculare test riflesso Utilizzando un sei gradi di libertà di movimento della piattaforma

Vestibolare Schwannomi (VSS) sono tumori non maligni della cella (SC) di origine Schwann, associati a mutazioni del NF2 gene soppressore del tumore. Riportiamo un protocollo efficace e riproducibile per uso umano primario VS coltura cellulare che permette di manipolazione sperimentale molecolare e cellulare e di analisi e ricapitola la natura eterogenea delle malattie umane.

Cultura primario di Human vestibolare Schwannomi

Per valutare i cambiamenti morfologici dei nervi cranici come perdita di neurale strutture o gonfiore dei nervi cranici nella malattia di Menière (MD) o in persone sane, in vivo, un protocollo di valutazione è stato sviluppato usando la formazione immagine a risonanza magnetica (MRI) . Ulteriore conferma basati su MRI di MD è stato effettuato.

In Vivo Analisi morfometrica dei nervi cranici umano usando la formazione immagine a risonanza magnetica in orecchie di malattia di Menière e orecchie udito normale

Viene presentato un nuovo metodo di riabilitazione per riequilibrare il sistema vestibolare nei pazienti con risposte asimmetriche, che consiste in rotazioni unidirezionali verso il lato più debole. Modificando direttamente il percorso vestibolare piuttosto che migliorare gli aspetti multisensoriali della compensazione, l'asimmetria può essere normalizzata entro 1-2 sessioni e mostrare effetti duraturi.

Utilizzo di rotazioni unidirezionali per migliorare l'asimmetria del sistema vestibolare nei pazienti con disfunzione vestibolare

La percezione della gravità è comunemente determinata dalla verticale visiva soggettiva nella posizione eretta della testa. La valutazione aggiuntiva alle inclinazioni della testa di 15 e 30 gradi nell'aereo rotolo garantisce un aumento del contenuto di informazioni per il rilevamento di una percezione gravicettiva compromessa.

Valutazione della percezione gravicettiva statica nel Roll-Plane utilizzando il paradigma verticale visivo soggettivo

In questo articolo, descriviamo la configurazione sperimentale, il materiale e le procedure per valutare i movimenti oculari riflessivi, la percezione del movimento di sé e le attività cognitive sotto stimolazione vestibolare magnetica, nonché l'orientamento anatomico degli organi vestibolari, in uno scanner per tomografia a risonanza magnetica da 7 Tesla (7T-MRT).

Misurare l'influenza della stimolazione vestibolare magnetica sul nistagmo, sulla percezione del movimento e sulle prestazioni cognitive in una MRT 7T

Qui, descriviamo una tecnica per il prelievo di organi terminali vestibolari umani in condizioni fisiologiche durante la labirintectomia e la loro analisi mediante immunocolorazione.

Prelievo di organi terminali vestibolari in condizioni fisiologiche durante la labirintectomia

La metodologia ha esplorato i contributi visivi e vestibolari alla stabilizzazione dello sguardo durante le rotazioni optocinetiche e di tutto il corpo. Le stimolazioni sono state effettuate attraverso prove visive, vestibolari e visuovestibolari. L'aumento del movimento oculare torsionale e le frequenze del nistagmo sono serviti come indicatori per il relè sottocorticale delle informazioni di movimento sensoriali specifiche verso la risposta riflessiva del tronco encefalico per ogni prova.

Utilizzo dell'eye-tracking per valutare l'importanza relativa dell'input visivo e vestibolare per l'elaborazione del movimento sottocorticale nel piano di rollio

La gestione del carcinoma polmonare ricorrente isolato in un campo precedentemente irradiato è impegnativa. Qui, descriviamo un'iniezione di cisplatino guidata da ecografia endobronchiale (EBUS) per la gestione di pazienti con recidiva di carcinoma polmonare localizzato in un campo precedentemente irradiato.

Endobronchiale ecoguidata iniezione intratumorale di cisplatino per il trattamento di isolato mediastinica ricorrenza del cancro del polmone

I topi portatori del carcinoma del Colon-26 (C26) rappresentano un modello classico di cachessia tumorale. L'atrofia muscolare progressiva si verifica in associazione con la crescita tumorale, la sovraespressione di ubiquitina ligasi muscolo-specifiche e la riduzione dell'area della sezione trasversale muscolare. Si osserva anche una perdita di grasso. La cachessia viene studiata in modo tempo-dipendente con l'aumentare della gravità del deperimento.

Il Colon-26 Carcinoma tumore-cuscinetto mouse come un modello per lo studio del cancro cachessia

Impara a processare campioni di schwannoma vestibolare umano per colture cellulari primarie e analisi delle secrezioni tumorali. Questo metodo minimamente invasivo preserva la vitalità cellulare e consente di testare candidati terapeutici direttamente sulle cellule coltivate.

Un quadro metodologico unificato per la ricerca di Schwannoma Vestibolare

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