Un quadro metodologico unificato per la ricerca di Schwannoma Vestibolare

L'obiettivo generale di questa procedura è quello di processare un campione umano di schwannoma vestibolare ricevuto dalla sala operatoria per la coltura cellulare primaria e la raccolta delle secrezioni tumorali. Questo metodo può contribuire a rispondere a domande fondamentali nel campo della ricerca sullo schwannoma vestibolare, come ad esempio il modo migliore per ricevere, conservare ed elaborare un campione tumorale primario umano destinato all'uso in diversi saggi biomolecolari. Il principale vantaggio di questa tecnica consiste nell'utilizzo di un metodo di coltura minimamente manipolativo per la propagazione di cellule primarie umane di schwannoma vestibolare.

Le implicazioni di questa tecnica si estendono alla terapia del schwannoma vestibolare poiché potenziali candidati terapeutici possono essere testati direttamente su cellule in coltura. Iniziare trasferendo il contenitore del campione contenente il schwannoma vestibolare appena reperito o il campione del nervo auricolare maggiore dal ghiaccio utilizzato per il trasporto dalla sala operatoria all'incubatore a flusso laminare in laboratorio. Utilizzare pinze sterili per trasferire con attenzione il campione nel primo di tre tubi da 1,5 millilitri riempiti con 1,4 millilitri di PBS esterno.

Chiudere ogni provetta una volta che contiene il campione e agitare delicatamente per lavare. Collocare il campione in una piastra di Petri asciutta da 60 millimetri ed utilizzare pinze per rimuovere tutti i tessuti morti nelle aree con vasi sanguigni prominenti. Utilizzare pinze o una lama di bisturi per dividere il campione in pezzi separati per la conservazione dell'RNA, l'estrazione delle proteine, la raccolta delle secrezioni, la fissazione e la coltura cellulare.

Trasferire il frammento del campione destinato alla coltura cellulare in una nuova piastra da 60 millimetri contenente da cinque a otto millilitri di mezzo DMEM F12 freddo e integrato. Posizionare il frammento di schwannoma vestibolare o di nervo auricolare maggiore destinato alla raccolta delle secrezioni in una provetta vuota da 1,5 millilitro. Iniziare pipettando 500 microlitri di DMEM non integrato con FBS in due provette da 1,5 millilitro.

Il primo tubo verrà utilizzato per raccogliere le secrezioni tumorali e il secondo tubo fungerà da controllo abbinato. Posizionare uno dei tubi contenenti DMEM su una bilancia digitale tarata. Azzerare la bilancia, inserire il pezzo di campione designato per la raccolta delle secrezioni nel tubo e pesarlo.

Si annoti il risultato, che rappresenterà il peso del tessuto esclusivamente. Sotto una cappa a flusso laminare, si regoli il volume di DMEM nel tubo a 100 microlitri per ogni 10 milligrammi del campione. Si ponga il tubo contenente il campione di tessuto e il relativo controllo nell'incubatore.

Incubare per almeno 72 ore, al fine di raccogliere quantità biologicamente utili di secrezioni tumorali o nervose. Dopo un'incubazione di 72 ore, utilizzare una pipetta da un millilitro per rimuovere il mezzo contenente le secrezioni dal campione. Per evitare cicli ripetuti di congelamento e scongelamento, suddividere il mezzo in aliquote in nuove provette in base all'analisi successiva prevista.

Conservare il frammento originale di tessuto, le secrezioni e il DMEM di controllo in un congelatore a meno 80 gradi Celsius fino all'inizio delle applicazioni successive. Iniziare la procedura di coltura utilizzando una pinzetta in ciascuna mano per dividere il tessuto del schwannoma vestibolare in frammenti di circa un millilitro cubo. Quindi aspirare il mezzo e i frammenti tumorali con una pipetta sierologica da 10 millimetri e trasferire tutti i contenuti in un tubo conico da 15 millilitri.

Centrifugare per tre minuti a 1000G a 25 gradi Celsius. Durante la centrifugazione, preparare il mezzo di disintegrazione mescolando 4,7 millilitri di mezzo DMEM F12 integrato con 250 microlitri di collagenasi e 50 microlitri di ialuronidasi in una piastra di coltura da 60 millimetri. Al termine della centrifugazione, i frammenti tumorali formeranno un pellet sul fondo del tubo conico.

Aspirare con attenzione e scartare il soprannatante. Quindi aggiungere due millilitri di mezzo di disintegrazione appena preparato contenente enzimi al frammento tumorale. Pipettare su e giù diverse volte per mobilizzare il tessuto, quindi trasferirlo nella piastra per colture di 60 millimetri.

Posizionare la piastra di coltura nell'incubatore per 18 ore; il giorno successivo, riscaldare il mezzo DMEM F12 integrato con FBS al 10% e penicillina-streptomicina all'1% in un bagno d'acqua a 37 gradi Celsius. Rimuovere la piastra contenente la coltura di schwannoma vestibolare dall'incubatore e trasferirla nell'hood a flusso laminare. Utilizzando un ago da 22 gauge collegato a una siringa da sei millilitri, aspirare il mezzo contenente la coltura e trasferirlo in un nuovo tubo conico da 15 millimetri.

Centrifugare per cinque minuti a 1000G a 37 gradi Celsius. Nel frattempo, utilizzare pinze sterili per posizionare il numero richiesto di coprioggetti in vetro rivestiti con polidilisina e laminina in una piastra da coltura a 24 pozzetti. Da un cubo di tumore di un centimetro di lato si possono coltivare da 24 a 32 pozzetti, quindi per la maggior parte dei tumori più piccoli è appropriato prevedere da otto a sedici pozzetti di cellule in coltura.

Dopo la centrifugazione, eliminare il soprannatante e risospendere il pellet cellulare residuo nel mezzo preriscaldato, in modo da ottenere un millilitro di sospensione cellulare per pozzetto previsto. Utilizzare una pipetta sierologica da cinque millilitri per aspirare due millilitri di sospensione cellulare e depositarne un millilitro in un pozzetto della piastra a 24 pozzetti. Continuare ad aspirare e depositare il mezzo contenente le cellule tumorali, aspirando porzioni di due millilitri dalle quali un millilitro viene depositato in ciascun pozzetto previsto, finché la sospensione di cellule tumorali non sia equamente suddivisa tra tutti i pozzetti preparati.

Posizionare la piastra a 24 pozzetti nell'incubatrice a 37 gradi Celsius per tutta la notte. Controllare la piastra il giorno successivo; se si osserva un quantitativo significativo di detriti sul fondo dei pozzetti, sostituire con attenzione il mezzo in ciascun pozzetto con del nuovo mezzo di coltura DMEM F12 integrato, avendo cura di non staccare le cellule aderenti. Se non sono presenti detriti, rimettere la piastra nell'incubatrice e sostituire il mezzo per la prima volta al quinto giorno e ogni tre giorni successivamente.

Questa immagine in campo chiaro illustra il tipico modello organizzativo delle cellule di schwannoma vestibolare in coltura. Queste immagini di immunofluorescenza di una coltura primaria umana di schwannoma vestibolare sono state ottenute dopo 48 ore di esposizione a ink 80 che esprime GFP, mostrato in verde. La fluorescenza rossa proviene dalla colorazione immunoistochimica con falloidina F-actina, che evidenzia il citoscheletro, mentre la fluorescenza blu è data dal DAPI, che colora il nucleo.

L'insetto è un'immagine ad ingrandimento maggiore di una regione dell'immagine a basso ingrandimento. Durante l'esecuzione di questa procedura, è importante annotare i tempi in cui si inseriscono il campione di secreto e il campione di coltura nell'incubatore, per garantire che i passaggi successivi vengano effettuati dopo i corretti periodi di incubazione. Al termine di questa procedura, possono essere eseguiti altri metodi come la trasduzione virale, la fissazione, l'immunofluorescenza, il trattamento con farmaci ed estrazione dell'RNA per rispondere ad ulteriori domande, ad esempio su come diversi virus vengano espressi nelle cellule o su come l'espressione genica cambi dopo il trattamento con farmaci.

Dopo il suo sviluppo, questa tecnica ha aperto la strada ai ricercatori nel campo dello studio del schwannoma vestibolare per esplorare il modo in cui le cellule umane primarie rispondono a diversi farmaci in pazienti vivi sottoposti a intervento chirurgico.