Name: In Vitro Polimerizzazione di F-actina su Early Endosomes (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-08-28T14:00:00.000+00:00
Duration: 12 min 15 s
Description: Scopri la polimerizzazione di F-actina su endosomi precoci con questo saggio in vitro basato su microscopia. Utilizzando cellule HeLa, il metodo consente di studiare la nucleazione dell'actina e la dinamica del traffico membranare.

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Supporto è stato ricevuto da Swiss National Science Foundation; il programma svizzero Sinergia; il polacco-Swiss ricerca programma (PSPB-094/2010); il PRN in biologia chimica; e LipidX dall'iniziativa Svizzera SystemsX.ch, valutati da Swiss National Science Foundation (di J. G.). O. M. è stato sostenuto da una borsa di studio a lungo termine dell'EMBO (ALTF-516-2012).

1. soluzioni e preparazioni Nota: tutti i buffer e soluzioni devono essere preparati in bidistillata (dd) H 2 O. Poiché lo stato di idratazione di saccarosio varia, la concentrazione finale di tutte le soluzioni di saccarosio deve essere determinata utilizzando un rifrattometro.
Soluzione tampone fosfato e <ol><li>preparare senza cationi bivalenti (PBS-): 137 mM NaCl, 2.7 mM KCl, 1,5 mM KH 2 PO 4 e 6,5 mM Na 2 HPO 4. Regolare il pH a 7.4. Sterilizzare in autoclave (1 ciclo a 121 ° C per 15 min) e conservare a temperatura ambiente.</li>
	<li>Preparare la soluzione di riserva di imidazolo 300mm: 0,204 g di imidazolo in 10 mL di ddH 2 O.Adjust il pH 7.4 a 4 ° C, utilizzando utilizzando un 0.22 μm a sterilizzare HCl. filtro filtro di dimensione del poro e conservare a 4 ° C.</li>
	Buffer di <li>Prepare omogeneizzazione (HB; preparare circa 100 mL): saccarosio 250 mM in imidazolo di 3 mM. Regolare il pH a 7,4 a 4 ° C, utilizzando un pH-metro. Filtro-sterilizzare utilizzando un filtro di dimensione dei pori di 0.22 μm e conservare a 4 ° C. complemento l'HB appena prima dell'uso con un cocktail di inibitori della proteasi alle concentrazioni finali corrispondenti a leupeptina 10 mM, 1 mM pepstatina A e 10 ng/mL aprotinina.</li>
	<li>Per le pendenze di galleggiamento di passaggio, preparare 62%, 39% e 35% di saccarosio soluzioni in imidazolo di 3 mM, pH 7.4, come descritto di seguito. Determinare con precisione la concentrazione finale di tutte le soluzioni di saccarosio usando un rifrattometro.
	<ol><li>Preparare 100 mL di soluzione di saccarosio di 62% in imidazolo di 3 mM, pH 7.4. Sciogliere agitando 80,4 g di saccarosio in ddH 2 O pre-riscaldato a 35 ° C. aggiungere 1 mL di soluzione madre di imidazolo di 300 mM e riempimento a 100 mL con ddH 2 O. Adjust il pH 7.4 a 4 ° C. filtro-sterilizzare usando un 0,22 μm filtrante di porosità e archivio a 4 ° C.</li>
		<li>Preparare 100 mL di soluzione di saccarosio del 35% in imidazolo di 3 mM, pH 7.4. Sciogliere mescolando 40,6 g di saccarosio in ddH 2 O. aggiungere 1 mL di soluzione di riserva di 300 mM imidazolo e riempire a 100 mL con ddH 2 O. regolare il pH a 7,4 a 4 ° C. filtro-sterilizzare usando un 0.22 μm filtro di dimensione del poro e conservare a 4 ° C.</li>
		<li>Preparare 50 mL di saccarosio al 39% in imidazolo di 3 mM, pH 7.4. Diluire la soluzione di saccarosio 62% con la soluzione di saccarosio del 35%. Conservare a 4 ° C.</li>
	</ol></li> <li>Sciogliere 3 g di paraformaldeide (PFA) in 100 mL di PBS-pre-warmed a 60 ° C, mentre l'aggiunta di 1 M NaOH goccia a goccia agitando; regolare il pH finale 7.4 usando NaOH. Filtro-sterilizzare utilizzando un filtro di dimensione dei pori di 0.22 μm e conservare a -20 ° C. 
	Attenzione: 3% PFA è un reagente tossico.</li>
	<li>Soluzione di riserva di preparare 1 M KCl. Sciogliere 3,73 g di KCl per agitazione in 50 mL di ddH 2 utilizzando un filtro di dimensione dei pori di 0.22 μm O. filtro-sterilizzare e conservare a temperatura ambiente.</li>
	<li>Soluzione di riserva di preparare 50 X concentrato contenente 0,625 M Hepes pH 7.0 e 75 mm MgOAc 2 di ddH 2 parte aliquota O. e negozio a -20 ° C.</li>
	<li>Preparare mezzo di montaggio. Mescolare agitando 2,4 g di poly(vinyl alcohol) M w ~ 31.000 (PVA) con 6 g di glicerolo. Aggiungere 6 mL di ddH 2 O e lasciare per almeno 2 ore a temperatura ambiente. Aggiungere 12 mL di 0.2 M Tris-Cl (pH 8.5) e calore a circa 53 ° C con agitazione occasionale fino a sciolta il PVA.</li>
	<li>Chiarire la soluzione mediante centrifugazione a 5.000 x g per 20 min a temperatura ambiente. Raccogliere il surnatante e aggiungere 2,5% (p/v) 1,4 - diazabiciclo-[2.2.2] ottano (DABCO) per evitare il photobleaching durante la rilevazione della fluorescenza. Vortice per circa 30 s a dissolversi. Aliquotare in tubi di plastica da 1,5 mL e conservare a -20 ° C.</li>
</ol> 2. Coltura di cellule <ol><li>cellule HeLa di cultura in Dulbecco &#39; s Modified Eagle Medium supplementato con 10% siero fetale del vitello, 10% non essenziali aminoacidi, 10% L-Glutammina e 1% di penicillina-streptomicina. Mantenerli a 37 ° C in un incubatore di 5% CO 2.</li>
	<li>Transfect le cellule 24 h prima dell'esperimento con GFP-RAB5 10, utilizzando il reagente di transfezione commerciale secondo il produttore &#39; istruzioni s.</li>
	<li>Quando necessario, preparare le frazioni endosomal e citosol dalle cellule impoverito di una proteina di interesse (cioè, tramite RNAi o CRISPR/Cas9) e/o che overexpressing forma wildtype o mutante della proteina di interesse.</li>
</ol> 3. Endosomal frazione preparazione Nota: il presente protocollo descrive la preparazione semplice di frazioni subcellulari contenente gli endosomi ed altre membrane di luce. Se necessario, le frazioni purificate endosoma possono anche essere usato 11. Preparare 2 piastre di Petri (diametro esterno di 10 cm; 57 cm 2) di cellule confluenti che esprimono GFP-RAB5 come materiale di partenza. Il numero totale di cellule HeLa confluenti in 2 capsule di Petri corrisponde approssimativamente a 2.5 x 10 7 cellule. Quando necessario, gli endosomi può anche essere preparati dalle cellule impoverite di una proteina di interesse (cioè, tramite RNAi o CRISPR/Cas9) e/o che overexpressing forma wildtype o mutante della proteina di interesse, sempre che esprimono GFP-RAB5.
 Attenzione: tutti i passaggi del protocollo frazionamento devono essere eseguiti su Ice.
<ol><li>Posizionare le piastre Petri su un di piastra metallico bagnato in un secchio di ghiaccio piatto e lavare immediatamente le cellule due volte con 5 mL di PBS ghiacciata-.</li>
	<li>Rimuovere tutti PBS - dall'ultimo lavaggio e aggiungere 3 mL di PBS ghiacciata-per ogni piatto. Le cellule non dovrebbero asciugarsi durante la manipolazione: se necessario, posizionare il secchio di ghiaccio su una piattaforma a dondolo per coprire adeguatamente le cellule con fluido.</li>
	<li>Rimuovere meccanicamente le cellule in PBS dai piatti Petri utilizzando un poliziotto di gomma flessibile (cioè, ruspa spianatrice di cella fatti in casa). Raschiare le cellule fuori i piatti in primo luogo in un rapido movimento circolare intorno alla parte esterna del piatto, seguito da un movimento verso il basso al centro del piatto. Raschiare delicatamente per ottenere &#34; fogli &#34; di cellule allegate. Trasferire delicatamente le celle utilizzando una pipetta di Pasteur plastica con un'ampia apertura per un tubo in polipropilene conico di 15 mL su Ice.</li>
	<li>Centrifugare per 5 min a 175 x g a 4 ° C.</li>
	<li>Delicatamente rimuovere il supernatante (SN) e aggiungere 1-3 mL di HB al pellet. Utilizzando una pipetta di Pasteur plastica con un'ampia apertura, delicatamente Pipettare su e giù una volta per risospendere le cellule.</li>
	<li>Centrifuga per 7-10 min a 1.355 x g e 4 ° C. delicatamente togliere il SN.</li>
	<li>Eseguire omogeneizzazione cell. 
	Nota: Le condizioni dovrebbero essere delicate affinché le membrane plasmatiche delle cellule sono rotte ma gli endosomi rimangono intatti.
	<ol><li>Aggiungi un volume noto di HB con inibitori della proteasi sul pellet ogni cella (circa 100 μL a pellet cellulare). Utilizzando una micropipetta di 1.000-µ l, delicatamente Pipettare su e giù fino a quando le cellule sono risospese. Non introdurre bolle d'aria.</li>
		<li>Preparare una siringa per tubercolina 1 mL con ago 22G pre-risciacquato con HB e privo di aria o bolle.</li>
		<li>Riempire la siringa con la sospensione cellulare relativamente lentamente (per evitare di creare bolle d'aria), posizionare la punta smussata dell'ago contro la parete del tubo ed espellere la sospensione cellulare rapidamente al taglio fuori le membrane plasmatiche delle cellule allegate.</li>
		<li>Prendere una piccola aliquota dell'omogenato (circa 3 µ l) e diluirlo in 50 µ l di HB su un vetrino. Mix e coprire con un vetrino coprioggetti. Ispezionare l'omogenato sotto un microscopio a contrasto di fase con un 20x o obiettivo 40x. 
		Nota: In condizioni ottimali, la maggior parte delle cellule sono rotta, ma i nuclei, che appaiono come grigio scuro e rotondo strutture, non sono ( Figura 1).</li>
		<li>Ripetere il punto 3.7.3 e 3.7.4 fino alla maggior parte delle cellule sono rotti; di solito, sono necessari 3-6 colpi alti e bassi attraverso l'ago. Mantenere una piccola aliquota (10-30 µ l) dell'omogenato per la determinazione della proteina.</li>
	</ol></li> <li>Centrifuga omogeneato per 7 min a 1.355 x g e 4 ° C. 
	Nota: dopo la centrifugazione, il pellet (definito come la pallina nucleare; NP) contiene i nuclei e il surnatante (definito come il surnatante postnuclear; PNS) contiene il citosol e gli organelli rilasciati all'omogeneizzazione e in libera sospensione.</li>
	<li>Raccogliere con cura il PNS. Tenere piccole aliquote (10-30 µ l) del PNS e NP per la determinazione della proteina e scartare il NP.</li>
	<li>Regolare il PNS al 40,6% saccarosio diluendo la soluzione di saccarosio 62% con PNS utilizzando un rapporto di 1:1.1 di PNS:62% di saccarosio. Mescolare delicatamente ma a fondo, senza creare bolle d'aria. Controllare la concentrazione di saccarosio utilizzando il rifrattometro.</li>
	<li>Posto il PNS a 40,6% saccarosio nella parte inferiore di un tubo di ultracentrifugazione. Overlay attentamente con 2,5 mL di soluzione di saccarosio al 35% e riempire la provetta da centrifuga con HB. 
	Nota: Le soluzioni di saccarosio devono essere stratificate affinché le interfacce sono chiaramente visibili.</li>
	<li>Ultracentrifuga i gradienti per 1 h a ̴165, 000 x g e 4 ° C.</li>
	<li>Rimuovere con attenzione lo strato bianco di lipidi sopra il gradiente. Successivamente, raccogliere l'interfaccia contenente gli endosomi, tra la HB e 35% di saccarosio, utilizzando una micropipetta 200 μL con un taglio punta. 
	Nota: Le frazioni di endosomal può essere utilizzate direttamente nell'analisi della polimerizzazione dell'actina in vitro o può essere aliquotati sul ghiaccio, flash-congelati in azoto liquido e conservati a -80 ° C.</li>
	<li>Determinare la concentrazione di proteina delle frazioni PNS ed endosomal. 
	Nota: Questa concentrazione deve essere almeno 100 µ g/mL. Circa 2,5 x 10 7 cellule sviluppate in 2 capsule di Petri sono necessari per ottenere un PNS con almeno 100 µ g/mL (vedere la nota riportata sopra).</li>
</ol> 4. Cytosol preparazione Nota: preparare 2 capsule di Petri (diametro di 10 cm; 57 cm 2) delle cellule HeLa confluenti come materiale di partenza. Quando necessario, il citosol possono essere preparati anche da cellule impoverite di una proteina di interesse (cioè, tramite RNAi o CRISPR/Cas9) e/o che overexpressing una wildtype o la forma mutata della proteina di interesse. Per quanto riguarda il protocollo di frazionamento endosoma, tutti i passaggi devono essere eseguiti su Ice.
<ol><li>Ripetere i passaggi da 3.1-3.8.</li>
	<li>Mettere il PNS in una provetta da centrifuga e ultracentrifuga per 45 min a ̴250, 000 x g e 4 ° C.</li>
	<li>Attentamente rimuovere lo strato bianco sulla parte superiore e raccogliere la SN (frazione di cytosol) senza disturbare il pellet del microsoma. Mantenere un'aliquota della frazione cytosol per la determinazione della proteina. 
	Nota: Il citosol può essere utilizzato direttamente nell'analisi della polimerizzazione dell'actina in vitro o può essere aliquotati sul ghiaccio, flash-congelati in azoto liquido e conservati a -80 ° C.</li>
	<li>Determinare la concentrazione di proteine del citosol. 
	Nota: Dovrebbe essere almeno 3 mg/mL.</li>
</ol> 5. Analisi di misurazione endosoma dipendente dalla polimerizzazione dell'actina In Vitro Nota: polimerizzazione dell'actina Endosome-dipendente può essere eseguita utilizzando due approcci alternativi. Nel primo approccio, i materiali sono mescolati in una provetta, fisso e trasferiti a un vetrino coprioggetto e analizzati. Nel secondo approccio, descritto qui, il dosaggio può essere effettuato direttamente nella camera di imaging e può essere risolto e analizzato senza perturbazione meccanica ( Figura 2). In questo secondo approccio, la miscela di analisi non viene trasferita da una provetta di un vetrino coprioggetto e così rimane imperturbata, diminuendo il pericolo delle reti di F-actina fisicamente essere perturbato durante il trasferimento. Inoltre, questo secondo approccio è compatibile con un'analisi time-lapse di polimerizzazione di F-actina. Va notato che nessuna differenza nell'analisi della polimerizzazione di F-actina è stata osservata con entrambi gli approcci. 
Nota: Uso tagliata punte in tutto il protocollo.
<ol><li>In una provetta <ol><li>delicatamente mix ghiacciata purificata GFP-RAB5 endosomi (passaggio 3) con citosol (passaggio 4) con un rapporto di 01:10 (concentrazione proteica) in una provetta conica ghiacciata 1,5 mL. 
		Nota: Un tipico esperimento effettuato con circa 40-50 µ l.</li>
		<li>Regolare la miscela di reazione ghiacciata a concentrazioni finali di 125 mM KCl (utilizzando la soluzione di riserva del KCl 1m), 12,5 mM Hepes e 1,5 mM MgOAc 2 (utilizzando il 50 x soluzione di riserva). Quindi, regolare la miscela con gli inibitori di proteasi a concentrazioni finali di 10 mM leupeptina e pepstatina 1 mM A 10 ng/mL aprotinina. Mescolare delicatamente tutti i componenti.</li>
		<li>Mettere la provetta contenente la miscela di reazione a 37 ° C, senza agitarli e incubare per il tempo desiderato. 
		Nota: In genere, ci vorranno circa 3 minuti per rilevare la polimerizzazione dell'actina su endosomes e 30 min per la formazione di una vasta rete.</li>
		<li>Al momento desiderato (cioè, 3 min o 30 min), fermare la reazione ponendo la provetta sul ghiaccio e aggiungere 1/10 (soluzioni) della soluzione PFA 3% preraffreddata.</li>
		<li>Aggiungere 0.3:10 (soluzioni) di 200 unità/mL (~6.6 μM) falloidina coniugata di colorante rosso-arancione per l'actina polimerizzata.</li>
		<li>Posto 12 µ l della miscela sul 12 μL di mezzo di montaggio PVA su un vetrino micro. Mettere un piano in coverslipon vetro 2 18x18 mm.</li>
		<li>Analizzare il campione con microscopia confocal.</li>
	</ol></li> <li>Nella camera di imaging <ol><li>per rendere microscopico imaging chambers, utilizzare plasma pulitore per 1 min per pulire un vetrino coprioggetto rotondo diametro 18 mm e un diametro tondo 35 mm dotato di un fondo di vetro di 20 mm di Petri (0.16-0.19 mm).</li>
		<li>Incubare le superfici pulite con 1% β-caseina per 20 min per ridurre al minimo il legame alle proteine al vetro. Lavare due volte con imidazolo di 3 mM.</li>
		<li>Aggiungi endosoma e citosol, nello stesso dosaggio miscela come nei passaggi 5.1.1 e 5.1.2, in una provetta da 1,5 mL preraffreddato e completano la miscela di analisi con 0,1 μg/μL rodamina-actina.</li>
		<li>Regolare l'indice di rifrazione finale della miscela di 1.375 (26,5% saccarosio) utilizzando la soluzione di saccarosio al 39%. 
		Nota: In genere, il volume stesso viene aggiunto; Tuttavia, questo deve essere empiricamente ri-regolato a seconda della concentrazione di saccarosio della frazione raccolta, determinata utilizzando un refractomer, poiché la concentrazione di saccarosio può variare leggermente da esperimento a esperimento.</li>
		<li>Mettere il composto sul piatto da 35 mm pretrattato (punto 5.2.1) e coprirlo con il coprioggetto 18 mm pretrattato (punto 5.2.1).</li>
		<li>Posizionare la camera a 37 ° C, senza agitarli.</li>
		<li>Analizzare il campione mediante microscopia confocale a fluorescenza.</li>
	</ol></li></ol> 6. Immagine Acl'acquisizione e analisi di actina rete <ol><li>acquisizione immagine <ol><li>acquisire le immagini su un microscopio confocale scansione invertito. 
		Nota: Le impostazioni di acquisizione di immagine sono state ottimizzate per un microscopio confocale scansione invertito con un obiettivo di olio NA 63 X 1,25. Regolare la potenza del laser (solitamente intorno 50%) per ottenere un buon rapporto segnale-rumore.</li>
	</ol></li> <li>Quantificazione della rete actina <ol><li>analizzare le micrografie fluorescente. Utilizzare il software opensource CellProfiler (v 2.1.1) 12 per misurare la quantità di actina per endosoma (software alternativo può essere utilizzato).
		<ol><li>In primo luogo, identificare gli endosomi come oggetto primario utilizzando il segnale di GFP-RAB5. Quindi, quantificare la F-actina associato con gli endosomi individuali utilizzando la propagazione del segnale dell'actina (rosso-arancio colorante coniugato falloidina) come un oggetto secondario.</li>
			<li>Medio e normalizzare il numero del materiale associato per ogni oggetto per la condizione di controllo.</li>
		</ol>
		</li>
	</ol>
	</li>
</ol>

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</ol>

Gli autori dichiarano di non avere nessun concorrenti interessi finanziari.

Actina svolge un ruolo cruciale nell'endosoma membrana dinamica4,14. Precedentemente abbiamo segnalato che la polimerizzazione e actina nucleazione verificarsi su early endosomes, formando piccole patch di F-actina o reti. Queste reti di F-actina sono assolutamente necessari per il trasporto di membrana oltre early endosomes lungo la via di degradazione. Interferire in ogni fase di questo processo di nucleazione e polimerizzazione previene endosoma maturazione e ...

Nelle cellule eucariotiche superiori, proteine e lipidi sono interiorizzati in early endosomes dove si verifica l'ordinamento. Alcune proteine e lipidi, che sono destinati ad essere riutilizzati, sono incorporati in tubolare regioni della early endosomes e poi trasportati alla membrana plasmatica o trans-Golgi network (TGN)1,2. Al contrario, altre proteine e lipidi in modo selettivo sono confezionati in regioni della early endosomes che presentano un aspetto multivesicular. Espandere queste regioni e, al momento di distacco dai primi endosomal membrane, finalmente maturo in vescicole di vettore libero endosomal o MVB (ECV/MVB), che sono responsabili di trasporto di merci verso gli endosomi ritardato1, 2.
Actina svolge un ruolo cruciale nel processo di rimodellamento della membrana associato endosomal ordinamento capacità e biogenesi endosoma. Proteina lungo le vie di riciclaggio alla membrana plasmatica o a livello di TGN dipende il retromer complessi e proteine associate. Questo macchinario ordinamento sembra essere accoppiato alla formazione di riciclaggio tubuli tramite interazioni della retromer complessa, con WASP e cicatrice omologo (WASH) complesse e ramificate actina3,4,5 . Al contrario, molecole destinati al degrado, particolarmente attiva segnalazione recettori, sono filtrate in vescicole intraluminal (ILVs) endosomal ordinamento complessi richiesti per trasporto (ESCRT)2,6, 7. Mentre non è noto il ruolo possibile di actina processo di cernita ESCRT-dipendente, F-actina svolge un ruolo importante nella biogenesi di ECV/MVB e nei trasporti oltre early endosomes. In particolare, abbiamo trovato che Annessina A2 Lega regioni colesterolo-arricchita della endosoma precoce e insieme spire1, costituisce la polimerizzazione di F-actina. La formazione della rete ramificata actina osservata su endosomi richiede l'attività di ramificazione della proteina actina-correlate (ARP) 2/3 complesso, così come l'ERM proteina moesina e i leganti l'actina proteina cortactin8,9.
Qui, descriviamo un saggio basato su microscopia in vitro che ricostituisce la nucleazione e la polimerizzazione di F-actina sulle prime membrane endosomal in provette. Questo test è stato utilizzato in precedenza per studiare il ruolo di Annessina A2 nella nucleazione di F-actina e moesin e cortactin nella formazione di endosomal actina reti8,9. Con questo protocollo in vitro , la complessa serie di reazioni che si verificano in endosomi durante la polimerizzazione dell'actina diventano suscettibile di analisi biochimica e molecolare dei passaggi sequenziali del processo, compresa la nucleazione di actina, lineare polimerizzazione, rami e reticolazione.

<table><tbody><tr><td>NaCl</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>71380</td><td></td></tr><tr><td>KCl</td><td>Acros Organics</td><td>196770010</td><td></td></tr><tr><td>KH2PO4</td><td>AppliChem</td><td>A1042</td><td></td></tr><tr><td>Na2HPO4</td><td>Acros Organics</td><td>424370025</td><td></td></tr><tr><td>Hepes</td><td>AppliChem</td><td>A3724</td><td></td></tr><tr><td>Magnesiun acetato tetraidrato</td><td>Fluka</td><td>63047</td><td></td></tr><tr><td>Ditiotreitolo (DTT)</td><td>AppliChem</td><td>A2948</td><td></td></tr><tr><td>Imidazole</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>10125</td><td></td></tr><tr><td>NaOH</td><td>Fluka</td><td>71690</td><td></td></tr><tr><td>Saccarosio</td><td>Merck Millipore</td><td>107687</td><td></td></tr><tr><td>Leupeptin</td><td>Roche</td><td>11017101001</td><td></td></tr><tr><td>Pepstatina</td><td>Roche</td><td>10253286001</td><td></td></tr><tr><td>Aprotinina</td><td>Roche</td><td>10236624001</td><td></td></tr><tr><td>Paraformaldehide</td><td>Polysciences. Inc</td><td>380</td><td></td></tr><tr><td>Alexa Fluor 555 falloidina</td><td>Sonde molecolari</td><td>A34055</td><td></td></tr><tr><td>Actina rodamina</td><td>Citoscheletro. Inc</td><td>APHR-A</td><td></td></tr><tr><td>Mowiol 4-88</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>81381</td><td>poli(alcool vinilico), Mw ~31 000</td></tr><tr><td>DABCO</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D-2522</td><td></td></tr><tr><td>Tris-HCl</td><td>AppliChem</td><td>A1086</td><td></td></tr><tr><td>&beta;-caseina</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C6905</td><td></td></tr><tr><td>Filtro 0.22 &mu; m</td><td>Millex</td><td>SL6V033RS</td><td></td></tr><tr><td>Piastre rotonde da 10 cm per colture cellulari</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>150350</td><td></td></tr><tr><td>Pipetta Pasteur in plastica</td><td>Assistent</td><td>569/3 40569003</td><td></td></tr><tr><td>Provetta in polipropilene da 15 ml</td><td>TPP</td><td>91015</td><td></td></tr><tr><td>Ago ipodermico 22G Nero 30mm</td><td>BD Microlance</td><td>300900</td><td></td></tr><tr><td>Siringhe Luer-slip sterili da 1 ml senza ago</td><td>BD Plastipak</td><td>300013</td><td></td></tr><tr><td>Micro vetrini</td><td>Assistent</td><td>2406</td><td></td></tr><tr><td>vetrino coprioggetti in vetro 18 x 18 mm Provvista</td> da centrifuga <td>Assistent</td><td>1000/1818</td><td></td></tr><tr><td>SW60</td><td>Coltro</td><td>Beckman 344062</td><td></td></tr><tr><td>Provetta da centrifuga TLS-55</td><td>Coltro Beckman</td><td>343778</td><td></td></tr><tr><td>200-&mu; L punta gialla</td><td>Starlab</td><td>S1111-0706</td><td></td></tr><tr><td>1.000-&mu; L Punta graduata blu</td><td>Starlab</td><td>S1111-6801</td><td></td></tr><tr><td>Provetta da 1,5 ml</td><td>Axygen</td><td>MCT-175-C 311-04-051</td><td></td></tr><tr><td>Vetrino coprioggetti rotondo da 18 mm di diametro</td><td>Assistent</td><td>1001/18</td><td></td></tr><tr><td>Piatto rotondo da 35 mm di diametro con fondo in vetro da 20 mm (0,16 - 0,19 mm)</td><td>Rifrattometro in vitro Scientific</td><td>D35-20-1,5-N</td><td></td></tr><tr><td></td><td>Carl Zeiss</td><td>79729</td><td></td></tr><tr><td>Pulitore al plasma</td><td>Harrick Plasma</td><td>PDC-32G</td><td></td></tr><tr><td>Sorvall WX80 Ultracentrifuga</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>46900</td><td></td></tr><tr><td>Ultracentrifuga da tavolo</td><td>Coltro Beckman</td><td>TL-100</td><td></td></tr><tr><td>SW60 rotore</td><td>Coltro Beckman</td><td>335649</td><td></td></tr><tr><td>rotore TLS-55</td><td>Coltro Beckman</td><td>346936</td><td></td></tr><tr><td>Microscopia confocale</td><td>Carl Zeiss</td><td>LSM-780</td><td></td></tr><tr><td>Fugene HD reagente di trasfezione</td><td>Promega</td><td>E2311</td><td></td></tr><tr><td>Reagente per il dosaggio delle proteine A</td><td>Bio-Rad</td><td>500-0113</td><td></td></tr><tr><td>Reagente per il dosaggio delle proteine B</td><td>Bio-Rad</td><td>500-0114</td><td></td></tr><tr><td>Reagente per il dosaggio delle proteine S</td><td>Bio-Rad</td><td>500-0115</td><td></td></tr><tr><td>Raschietto cellulare</td><td>fatto in casa</td><td></td><td>Pezzo di gomma siliconica di circa 2 cm, tagliato ad angolo molto acuto e fissato ad una barra metallica o tenuto con una pinza</td></tr><tr><td>Rifrattometro</td><td>Carl Zeiss</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Minimum Essential Medium Eagle (MEM)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M0643</td><td></td></tr><tr><td>FCS</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>10270-106</td><td></td></tr><tr><td>MEM Aminoacidi Non Essenziali (NEAA)</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>11140-035</td><td></td></tr><tr><td>L-Glutammina</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>25030-024</td><td></td></tr><tr><td>Penicillina-Streptomicina</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>15140-122</td><td></td></tr><tr><td>Misuratore di pH 691</td><td>Metrohm</td><td></td><td></td></tr><tr><td>ImageJ software</td><td></td><td></td><td>NIH, Bethesda MD</td></tr></tbody></table>

in vitro polimerizzazione di f-actina su early endosomes

In Vitro Polymerization of F-actin on Early Endosomes

Molte funzioni di endosoma precoce, particolarmente carico proteico ordinamento e membrana deformazione, dipendono dalla patch di brevi filamenti di F-actina nucleate sulla membrana endosomal. Abbiamo stabilito un dosaggio basato su microscopia in vitro che ricostituisce la nucleazione e la polimerizzazione di F-actina sulle prime membrane endosomal in provette, rendendo questa serie complessa di reazioni suscettibili di genetica e biochimica manipolazioni. Endosomal frazioni vengono preparate dal galleggiamento in pendenze del saccarosio dalle cellule che esprimono la precoce endosomal proteina GFP-RAB5. Citosoliche frazioni sono preparate da batch distinti delle cellule. Endosomal sia citosoliche frazioni possono essere congelate in azoto liquido, se necessario. Nell'analisi, la endosomal e frazioni citosoliche sono mescolate, e la miscela viene incubata a 37 ° C in condizioni appropriate (ad esempio, forza ionica, riducendo l'ambiente). Al momento desiderato, la miscela di reazione è stato risolto, e la F-actina si rivela con falloidina. Polimerizzazione e nucleazione di actina vengono poi analizzati da microscopia di fluorescenza. Qui, segnaliamo che questa analisi può essere usata per studiare il ruolo di fattori che sono coinvolti sia nella nucleazione di actina sulla membrana, o nel successivo allungamento, ramificazione o reticolazione dei filamenti di F-actina.

Per approfondire la formazione di patch di F-actina sulle membrane endosoma precoce, abbiamo seguito il protocollo descritto nella Figura 2. Brevemente, le cellule sono state trasfettate con GFP-RAB5 e quindi gli endosomi precoce sono stati preparati da frazionamento subcellulare. Questi purificato endosomi precoce sono stati incubati con citosol al fine di fornire l'actina stessa, nonché altri fattori probabilmente coinvolti nella reazione. Alla fine del per...

Funzioni di endosoma precoce dipendono dalla polimerizzazione di F-actina. Qui, descriviamo un saggio basato su microscopia in vitro che ricostituisce la nucleazione e la polimerizzazione di F-actina sulle prime membrane endosomal in provette, rendendo questa serie complessa di reazioni suscettibili di biochimica e genetica manipolazioni.

In Vitro Polimerizzazione di F-actina su Early Endosomes

Many early endosome functions, particularly cargo protein sorting and membrane deformation, depend on patches of short F-actin filaments nucleated onto ...

L'obiettivo generale di questo saggio in vitro basato sulla microscopia è studiare la polimerizzazione dell'actina a partire dagli endosomi in vitro. Questo metodo può contribuire a rispondere a domande fondamentali nei settori del traffico di membrana e dell'actina, come il ruolo dell'actina nella via acida. Il principale vantaggio di questa tecnica consiste nella ricostituzione dell'ossidazione polimerica dell'F-actina sulle membrane degli endosomi precoci nel provetta.Questo rende questa complessa serie di reazioni suscettibile alle mie manipolazioni chimiche. La procedura sarà dimostrata da Jorge Larios e Olivia Muriel del laboratorio. Iniziare posizionando le piastre di cellule HeLa su una piastra metallica fredda all'interno di un contenitore per ghiaccio.E lavare le cellule due volte con cinque millilitri di PBS freddo di ghiaccio. Dopo aver rimosso il PBS dall'ultimo lavaggio, aggiungere tre millilitri di PBS freddo di ghiaccio per ogni piastra. Quindi utilizzare un raschietto di gomma flessibile per staccare le cellule dalle piastre con un rapido movimento circolare lungo il bordo esterno della piastra.Proseguire con un movimento verso il basso al centro della piastra. Raschiare delicatamente per ottenere fogli di cellule aderenti. Successivamente, utilizzare una pipetta Pasteur in plastica con un'apertura larga per trasferire delicatamente le cellule in provette coniche in polipropilene da 15 millilitri poste sul ghiaccio.Centrifugare per cinque minuti a 175 ×g e a quattro gradi Celsius. Rimuovere delicatamente il soprannatante e aggiungere da uno a tre millilitri di buffer di omogeneizzazione ai pellet. Utilizzando una pipetta Pasteur di plastica con un'apertura larga, pipettare delicatamente su e giù una volta per risospendere le cellule.Quindi centrifugare per sette-10 minuti a 1.355 ×g e 4 gradi Celsius. Dopo aver rimosso il soprannatante, aggiungere un volume noto di buffer di omogeneizzazione con inibitori della proteasi a ogni pellet cellulare. E pipettare delicatamente su e giù senza introdurre bolle d'aria fino a quando le cellule non sono state risospese.Risciacquare una siringa tubercolinica da un millilitro con tampone di omogeneizzazione ed assicurarsi che sia priva di aria o bolle. Successivamente, riempire lentamente la siringa con la sospensione cellulare per evitare la formazione di bolle d'aria. Appoggiare la punta obliqua dell'ago contro la parete del tubo ed espellere rapidamente la sospensione cellulare per asportare le membrane plasmatiche delle cellule aderenti.Quindi prelevare un'aliquote piccola di ciascun omogenato, diluirla in 50 microlitri di buffer di omogeneizzazione su un vetrino e mescolare. Successivamente coprirlo con un coprioggetto di vetro, esaminare gli omogenati al microscopio a contrasto di fase dotato di un obiettivo 20 volte o 40 volte. In condizioni ottimali, la maggior parte delle cellule è rotta, ma i nuclei, che appaiono grigio scuro, sono rotondi e non danneggiati.Ripetere il passaggio di disomogeneizzazione fino a quando la maggior parte delle cellule non è rotta, di solito sono necessari da tre a sei passaggi su e giù attraverso l'ago. Conservare un'aliquote piccola di ogni omogenato per la determinazione delle proteine. Dopo la centrifugazione come in precedenza, raccogliere con attenzione il sopranatante post-nucleare.Conservare piccole aliquote di ciascun sopranatante post-nucleare e di ciascun pellet nucleare per la determinazione delle proteine, quindi scartare i pellet nucleari. Regolare i sopranatanti post-nucleari al 40,6 percento di saccarosio aggiungendo sopranatante post-nucleare a una soluzione di saccarosio al 62 percento in un rapporto di uno a uno virgola uno. Mescolare delicatamente ma accuratamente senza formare bolle d'aria.Trasferire i supernatanti post-nucleari nel saccarosio al 40,6% in provette per ultracentrifugazione. Sovrapporre con attenzione due virgola cinque millilitri di soluzione di saccarosio al 35%, e riempire la provetta della centrifuga con il buffer di omogeneizzazione. Ultracentrifugare i gradienti per un'ora a circa 165.000 × g e a quattro gradi Celsius.Dopo l'ultracentrifugazione, rimuovere con attenzione lo strato bianco di lipidi in cima ai gradienti. Successivamente, utilizzare una micropipetta da 200 microlitri con la punta tagliata per raccogliere l'interfaccia contenente gli endosomi, situata tra il buffer di omogeneizzazione e il saccarosio al 35 percento. Per raccogliere il citosol, trasferire con pipetta il soprannatante post-nucleare in un tubo per ultracentrifuga.E ultracentrifugare per 45 minuti a circa 250.000 ×g e 4 gradi Celsius. Successivamente, rimuovere con attenzione lo strato bianco superiore e raccogliere il soprannatante, che costituisce la frazione citosolica, senza disturbare il pellet di microsomi. Iniziare il saggio mescolando delicatamente, in una provetta conica da 1,5 mL fredda di ghiaccio, GFP purificata avvolta in cinque endosomi fredda di ghiaccio con il citosol in un rapporto di 1 a 10 di concentrazione proteica.Successivamente, utilizzare la soluzione madre di cloruro di potassio per aggiustare la miscela di reazione alle concentrazioni finali di 125 millimolare di cloruro di potassio, 12,5 millimolare di HEPES e 1,5 millimolare di acetato di magnesio. Quindi aggiustare la miscela con inibitori della proteasi alle concentrazioni finali di 10 millimolare di leupeptina, 1 millimolare di pepstatina A e 10 nanogrammi per millilitro di aprotinina.Posizionare il tubo a sonda contenente la miscela di reazione a 37 gradi Celsius senza agitazione e incubare per il tempo desiderato. Al termine del periodo di incubazione, arrestare la reazione posizionando il tubo a sonda sul ghiaccio e aggiungendo una soluzione di PFA al tre percento pre-raffreddata in un rapporto volumetrico di uno a 10. Aggiungere 200 microgrammi per millilitro di falloidina coniugata con colorante rosso arancione in un rapporto volumetrico di zero virgola tre a 10 per colorare l'actina polimerizzata.Deporre con pipetta 12 microlitri della miscela su 12 microlitri di mezzo di montaggio PVA su un vetrino microscopico. Posizionare in alto un coprioggetto di vetro di 18 per 18 millimetri. Quindi analizzare il campione mediante microscopia confocale a fluorescenza.Cominciare incubando la superficie pulita di camere per microscopia con il beta caseina all'uno per cento per 20 minuti sul ghiaccio, al fine di ridurre al minimo il legame proteico al vetro. Dopo l'incubazione, lavare due volte con imidazolo tre millimolare. Aggiungere l'actina marcata con rodamina in un tubo da prova da un punto cinque millilitri pre-raffreddato contenente la miscela di endosomi e citosol, come precedentemente dimostrato.Regolare l'indice di rifrazione finale della miscela a 1,375 aggiungendo soluzione di saccarosio al 39% fino a una concentrazione finale del 26,5%. Distribuire la miscela sulla piastra da 35 millimetri pretrattata e coprirla con il coprivetrino da 18 millimetri pretrattato. Posizionare la camera a 37 gradi Celsius per tre o trenta minuti, come in precedenza.Quindi analizzare mediante microscopia confocale a fluorescenza e quantificare la rete di actina seguendo le raccomandazioni riportate nel protocollo scritto. Le seguenti immagini mostrano endosomi precoci purificati da cellule esprimenti GFP-RAB5 che sono stati incubati con citosol come fonte di actina. Il campione dell'assay è stato fissato, prelevato e posizionato su un vetrino da microscopio e l'actina filamentosa è stata visualizzata con falloidina coniugata a un fluorocromo rosso.Il processo di nucleazione e polimerizzazione dell'actina è stato rapido, poiché l'actina F poteva già essere rilevata su alcuni endosomi dopo un minuto. Queste brevi strutture di actina sono cresciute rapidamente in lunghezza nell'arco di 30 minuti, diventando interconnesse e ramificate, formando infine una rete filamentosa. Presumibilmente, ciò riflette una dinamica dell'actina sbilanciata in vitro.Queste immagini sono state ottenute quando il saggio è stato eseguito con actina purificata marcata con rodamina, insieme a citosol cellulare, in piatti con fondo in vetro. In questo modo, le strutture potevano essere osservate direttamente in assenza di qualsiasi perturbazione. Come mostrato qui, sono stati osservati tassi simili di nucleazione e polimerizzazione.Nel saggio descritto qui, gli endosomi precoci nucleano selettivamente la polimerizzazione dell'actina de novo. Poiché nessuna polimerizzazione dell'actina viene rilevata quando viene omesso o l'endosoma o il citosol. Queste osservazioni dimostrano che gli endosomi precoci possiedono la capacità intrinseca e specifica di innescare la nucleazione e la polimerizzazione dell'actina.Quando si esegue questa procedura, è importante ricordare che sono preferibili condizioni di espressione relativamente bassa di RAP5 in vivo. Inoltre, le membrane cellulari sono relativamente fragili e sensibili a shock biochimici o chimici. Analogamente, la rete di actina ottenuta in vitro è anch'essa molto fragile e va manipolata con delicatezza per evitare collasso o rottura.Dopo aver visto questo video, dovresti avere una buona comprensione di come ricostituire la polimerizzazione di nucleazione dell'actina F sulle membrane degli endosomi precoci in provetta. Con questa tecnica sarai in grado di studiare l'insieme di fattori coinvolti nella nucleazione dell'actina sulla membrana, oppure nell'elongazione, ramificazione o nel cross-linking successivi dei filamenti di actina F.

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Rilevamento del pH-dipendente attività di<em&gt; Escherichia coli</em&gt; Chaperone HdeB<em&gt; In Vitro</em&gt; e<em&gt; In Vivo</em

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In Vitro Polimerizzazione di F-actina su Early Endosomes

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