Name: Vivere-cella misura di Odorant recettore attivazione mediante unanalisi di campo in tempo reale (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-10-02T14:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 11 s
Description: Impara a misurare l'attivazione dei recettori odoranti in tempo reale con un saggio cAMP su cellule Hana3A. Questo metodo ad alto rendimento consente lo screening efficiente di odoranti e ligandi per studi farmacologici.

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Il lavoro è stato supportato dal Chinese National Science Foundation (31070972), scienza e tecnologia della Commissione della municipalità di Shanghai (16ZR1418300), il programma per Innovative Research Team di Shanghai Municipal Education Commission, orientale di Shanghai Programma di studioso (J50201) e il programma di ricerca di base nazionale della Cina (2012CB910401).

1. Culturing e manutenzione di celle Hana3A <ol><li>mantenere le cellule in 10 mL di medium essenziale minimo (MEM) con 10% siero bovino fetale (FBS), 100 µ g/mL di penicillina-streptomicina e 1.25 µ g/mL amfotericina B in un 100-mm piastra di coltura di cellule in un'incubatrice di coltura cellulare di 37 ° C con 5% CO 2. Con ogni altro passaggio, aggiungere 1 con puromicina µ g/mL per mantenere la trasfezione stabile di plasmidi (Vedi Introduzione). 
	Nota: Eseguire tutti i passaggi che coinvolgono la coltura delle cellule in una cappa di sicurezza biologica di II classe per garantire ambiente sterile.</li>
	<li>Sottocultura ad un rapporto di 10-20% in 100 mm piatti ogni 2-3 giorni.</li>
</ol> 2. Placcatura di cellule per la transfezione <ol><li>osservare le cellule di Hana3A sotto un microscopio a contrasto di fase per garantire la vitalità cellulare e stimare confluenza.</li>
	<li>Aspirare tutte le medie da piastra di coltura cellulare.</li>
	<li>Lavare le cellule aggiungendo 10 mL di tampone fosfato salino (PBS) sul piatto, il piatto di turbine, e aspirando il PBS.</li>
	<li>Aggiungere 3 mL di 0.05% tripsina-acido etilendiamminotetraacetico (EDTA) sulla piastra. Mix per 1 min o fino a quando tutte le celle vengono a galla. 
	Nota: Osservare il progresso delle cellule lo scollegamento dalla parte inferiore della piastra sotto il microscopio come necessario.</li>
	<li>Inactivate tripsina aggiungendo 5 mL di MEM con 10% FBS e pipetta su e giù per rompere blocchi di cell mass. 
	Nota: Per la placcatura prima della trasfezione, il mezzo utilizzato non deve contenere antibiotici. Aggiunta di antibiotici può ridurre l'efficienza di trasfezione.</li>
	<li>Trasferire una quantità appropriata di cellule in una provetta 15-mLl a seconda del numero di piastre per essere transfected. Per ogni piastra a 96 pozzetti, piastra 2 x 10 6 celle o circa 1/5 di un piatto di confluenti 100 mm 100%, dando un conteggio delle cellule di 2 x 10 4 cellule per pozzetto o di una densità di circa 15-30% di confluenza per pozzetto. Centrifugare le provette a 200 x g per 5 min e aspirare il supernatante senza disturbare il pellet cellulare. 
	Nota: Calcolare la corretta quantità di cellule per essere piastrate su piastre a 96 pozzetti per evitare surclassando o undergrowing cellule prima stimolazione.</li>
	<li>Aggiungere una quantità appropriata di MEM con 10% FBS nel 15 mL tubo e pipettare su e giù per rompere blocchi della cella di massa. Per ogni piastra a 96 pozzetti, risospendere le cellule con 6 mL di MEM con 10% FBS. 
	Nota: Fare attenzione a non generare bolle d'aria nel tubo.</li>
	<li>Aggiungere le cellule sospese in un serbatoio. Usando una pipetta multicanale, pipettare 50 µ l di cellule su ciascun pozzetto di una piastra a 96 pozzetti. Incubare per una notte a 37 ° C con 5% CO 2.</li>
</ol> 3. Transfezione di plasmidi <ol><li>prima della trasfezione, osservare le cellule placcate per garantire una corretta confluenza di circa 30-50% per pozzetto sotto un microscopio a contrasto di fase e tornare nell'incubatore.</li>
	<li>Preparare in anticipo il Rho-etichetta OR costrutto 11 , 21 , 22 , 28, il fattore accessorio costruisce (RTP1S 22 , 36 e M3R 23), e la variante di biosensore costruire 29 , 30 di miniprep. Quantificare la concentrazione di DNA da uno spettrofotometro e regolare le concentrazioni di DNA del plasmide (ad es., a 100 ng / µ l) con acqua distillata come necessario.</li>
	<li>Preparazione delle miscele di transfezione <ol><li>preparare una miscela di transfezione del plasmide in 500 µ l di MEM per ogni piastra a 96 pozzetti secondo la tabella 1. 
		Nota: Quando diversi ORs vengono testati sulla stessa piastra 96 pozzetti, il volume della miscela di transfezione e la quantità di plasmide DNA aggiunto deve essere adattato in funzione del numero di pozzi trasfettate con un determinato OR.</li>
		<li>Preparare una miscela di transfezione in un tubo con 18 µ l di reagente di transfezione mediata del lipido in 500 µ l di MEM.</li>
	</ol></li> <li>Mescolare la miscela di plasmide con la miscela di transfezione pipettando su e giù. Incubare a temperatura ambiente per 15 min.</li>
	<li>Fermare la reazione aggiungendo 5 mL di MEM con 10% FBS.</li>
	<li>Stendere uno strato spesso di asciugamani di carta sterile nella cappa di cultura cellulare. Prendere una piastra a 96 pozzetti con cellule dall'incubatrice. Delicatamente e ripetutamente toccare la piastra capovolta sulla pila di carta assorbente in modo che il mezzo è completamente assorbito dal tovagliolo di carta. 
	Nota: Non con la forza o bruscamente toccare la piastra come uno potrebbe perdere cellule.</li>
	<li>Trasferire 50 µ l della miscela combinata transfezione in ciascun pozzetto della piastra 96 pozzetti e incubare per una notte per 18-24 h a 37 ° C con 5% CO 2. 
	Nota: Una pianificazione di transfezione e stimolazione tempo gestito deve precedere la misurazione quando più di una piastra a 96 pozzetti vengono testati in un esperimento al fine di avere tutte le piastre misurate dopo la transfezione contemporaneamente e il tempo di esposizione di stimolo.</li>
</ol> 4. Stimolazione e misurazione o attività usando l'analisi di Campo Real-Time <ol><li>osservare le cellule trasfettate con un microscopio a contrasto di fase per garantire una corretta confluenza di 50-80% per pozzetto e tornare nell'incubatore.</li>
	<li>Preparare il supporto di stimolazione aggiungendo 10mm idrossietil piperazineethanesulfonic acido (HEPES) e 5 mM glucosio a Hank &#39; s soluzione salina bilanciata (HBSS).</li>
	<li>Scongelare le aliquote di reagente substrato in tempo reale analisi accampamento sul ghiaccio. Conservare substrato reattivo a-80 ° C a 55 µ l per provetta in provette per PCR. Utilizzare 1 tubo per piastra.</li>
	<li>Preparare 2% soluzione di equilibrazione con 55 µ l del reagente substrato e soluzione di HBSS/HEPES/glucosio 2750 µ l.</li>
	<li>Stendere uno strato spesso di asciugamani di carta in panchina. Delicatamente e ripetutamente toccare la piastra capovolta su carta assorbente in modo che il mezzo di transfezione è completamente assorbito dal tovagliolo di carta.</li>
	<li>Lavare le cellule di pipettaggio 50 µ l di soluzione di HBSS/HEPES/glucosio in ciascun pozzetto.</li>
	<li>Delicatamente e ripetutamente toccare la soluzione di HBSS/HEPES/glucosio dalla piastra a 96 pozzetti.</li>
	<li>Pipetta 25 µ l della soluzione di equilibrazione 2% ad ogni pozzetto ed incubare a temperatura ambiente al buio per 2 h.</li>
	<li>Preparare in anticipo 1m odorant soluzioni di riserva in DMSO e conservare a-20 ° C fino a quando non usato.</li>
	<li>Prima della fine del tempo di incubazione, diluire le soluzioni stock odorant a concentrazioni di lavoro nel mezzo di stimolazione glucosio/HBSS/HEPES. 
	Nota: Le concentrazioni delle diluizioni odorant preparate in questo passaggio devono essere raddoppiate per ottenere le concentrazioni finali corrette in ogni pozzetto.</li>
	<li>Utilizzando una chemiluminescenza piastra lettore e prima dell'aggiunta di odorizzante, misurare il livello di luminescenza basale della piastra per 2 volte consecutive ad un tasso di 1000 ms per ben 34.</li>
	<li>Rapidamente rimuovere la piastra dal lettore della piastra e aggiungere 25 diluizioni di odorizzante µ l a ciascun pozzetto e immediatamente avviare la misurazione della luminescenza continuo di tutti i pozzetti per 20 cicli entro 30 min. 
	Nota: Pozzi di pipetta con attenzione per evitare di contaminare i vicini quando si utilizza diversi odoranti e/o concentrazioni differenti dell'odorizzazione stesso nello stesso piatto.</li>
</ol> 5. Analisi dei dati <ol><li>esportare i dati dal software di lettore di piastra chemiluminescenza.</li>
	<li>Calculate normalizzato risposta OR per ciascun punto di tempo utilizzando la formula 
	(luminescenza N &#8211; luminescenza basale) / (luminescenza più alto &#8211; luminescenza basale) dove N = valore di luminescenza di un certo bene; basale = valore medio luminescenza dei due basali valori di luminescenza; più alto = valore più alto di luminescenza di un piatto o un set di piastre. 
	Nota: A seconda dello scopo dell'esperimento, rappresentazioni grafiche alternativi possono essere adottati. Ad esempio, per lo screening di saggi (Vedi Figura 1) e per la generazione di curve di concentrazione-risposta, il valore di luminescenza di un certo pozzo presso un punto di tempo desiderato durante la misurazione cinetica, ad esempio il valore massimo o il valore finale, può essere utilizzato.</li>
</ol>

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</ol>

Gli autori non hanno nulla a rivelare.

Misurare accuratamente l'attivazione di un OR sopra l'esposizione ad una certa odorant è il primo passo nel decifrare la codificazione delle informazioni olfattive. Gli esperimenti dimostrato in questo studio rappresentano che un esempio di come uno può identificare, mediante uno in vitro sistema di espressione OR, ORs reattivo tra il repertorio umano OR per l'industria chimica odorosa di interesse e successivamente che caratterizzano il recettore farmacologia utilizzando varie concentrazioni della sostanza chim...

L'odorato svolge un ruolo importante nella sopravvivenza degli animali come si basano sulla loro capacità olfattive per procurarsi il cibo, evitare i predatori e pericolo, distinguere specie e selezionare mate1,2. La realizzazione di queste funzioni dipende i recettori odorant (ORs), che individualmente sono espressi sulla superficie ciliare dei neuroni sensoriali olfattivi (OSNs) situato nell'epitelio olfattivo (OE). RUP costituiscono la più grande famiglia della superfamiglia del recettore (GPCR) accoppiati a proteine G con circa 400 e 1200 diversi OR geni nell'uomo e topo, rispettivamente3,4,5. ORs attivato da odoranti condurre ai livelli aumentati di cAMP intracellulari attraverso l'attivazione sequenza di olfattiva G-proteina (Golf) e digitare adenilil ciclasi III (AC3). Il risultante aumento del livello di cAMP intracellulare potrebbe funzionare come un secondo messaggero, che apre il canale del nucleotide-gated sulla superficie delle cellule, innescando l'afflusso dei cationi inclusi Ca2 + e potenziali d'azione e in ultima analisi, avviare neuro-potenziale trasmissione e percezione olfattiva. Il processo di rilevamento e discriminare un gran numero di odorizzazione da ORs è considerato come il primo passo di percezione olfattiva6,7.
Poiché Buck e Axel8 prima con successo odorant recettori clonati e chiarito il meccanismo di percezione olfattiva iniziata da ORs, deorphanization della famiglia OR è diventato uno dei punti caldi in questo campo. Vari metodi in vivo, ex vivo ed in vitro per misurare l'attivazione OR sono stati segnalati9,10,11,12. Un metodo tradizionale che utilizzato Ca2 + imaging seguita da unicellulare RT-PCR su OSNs permesso l'identificazione di differenti ORs a alifatici odoranti13,14,15. Più recentemente, l'avvento delle analisi su larga scala del trascrittoma promosso lo sviluppo di metodi di più alto-rendimento in vivo . Il dosaggio di Kentucky identificato ORs eugenolo e muscone-reattivo del mouse con l'uso di S100a5-tauGFP reporter del mouse ceppo e microarray analisi9. Basato sulla diminuzione nei livelli di mRNA di OR dopo l'esposizione odorant, la tecnologia di sogno impiegato un approccio di trascrittomica per determinare i profili di attivazione OR in due specie di vertebrati e non-vertebrato16. Allo stesso modo, data la fosforilazione di S6 in attivazioni neuronali, il Matsunami gruppo sequenziata mRNA dal ribosoma fosforilato immunoprecipitati per identificare reattivo ORs12. Infine, il gruppo di Feinstein segnalato topi super sniffer che potrebbero fungere da piattaforma per lo studio di odore di codifica in vivo, conosciuto come il MouSensor tecnologia17.
Nel Regno in vitro , la sfida di coltura OSNs rende un sistema di espressione eterologa che imita OR espressione funzionale in vivo una soluzione ideale per condurre lo screening su larga scala di prodotti chimici odorosi per ORs. Tuttavia, dal momento che diverse linee cellulari coltivate di origine non-olfattiva OSNs nativo, o proteine vengono mantenute nel reticolo endoplasmatico e incapace di traffico alla membrana plasmatica, con conseguente OR degrado e la perdita di funzione del ricevitore18 , 19. per risolvere questo problema, vasti impianti sono stati fatti per replicare o funzionale espressione sulla membrana cellulare nelle linee cellulari eterologhi. Krautwurst et al collegato in primo luogo i primi 20 amminoacidi di rodopsina (Rho-tag) al N-terminale della proteina OR e questo ha promosso l'espressione di superficie delle cellule di alcuni ORs di cellule embrionali umane del rene (HEK)20. Effettuando un'analisi di serie di analisi del gene expression (SAGE) libreria dal singolo OSNs, Saito et al. in primo luogo clonato i membri della famiglia della proteina (RTP) del ricevitore-trasporto, RTP1 e RTP2 e la proteina di enhancer di espressione di recettore 1 (REEP1) che ha facilitato OR traffico alla membrana cellulare e migliorato risposte odorant-mediata di ORs in HEK293T cellule 21. basato su questi risultati, il gruppo Matsunami stabilito con successo la linea cellulare Hana3A, trasfettata stabilmente con RTP1, RTP2, REEP1 e Gαolf in HEK293T e transfected transitoriamente con ORs Rho-etichetta, per efficiente o funzionale espressione. Successivi studi hanno rivelato 1) una forma più breve di RTP1, RTP1S, che potrebbe più robustamente promuovono o funzione che la proteina RTP1 originale e 2) il recettore muscarinico tipo 3 (M3R) poteva migliorare attività OR via inibizione di β-arrestina-2 reclutamento, entrambi i quali sono state introdotte per il sistema di espressione eterologa per ottimizzare sperimentale uscita22,23.
Diversi metodi di rilevamento sono stati utilizzati per quantificare l'attivazione del recettore in sistemi eterologhi. Il dosaggio di fosfatasi alcalina placentare secrete (SEAP) funziona con un enzima di reporter trascrizionalmente regolato da elementi di risposta del campo (CREs), che lo rende un'opzione attraente per valutare l'attivazione OR. La fluorescenza è facilmente rilevata in un campione di terreno di coltura dopo incubazione con SEAP rilevamento reagente24. Utilizzando questo metodo, le funzioni di RUP, nonché una classe secondaria di chemosensory recettori espressi nella traccia di OE-i recettori ammina-associati (TAARs) sono stati caratterizzati25,26,27. Un altro metodo comune, l'analisi di luciferase, utilizza un gene reporter luciferasi di lucciola sotto il controllo dell'elemento di risposta del campo (CRE). Luminescenza generato dalla produzione di luciferasi di misurazione fornisce un mezzo efficiente e robusto di quantificare OR attivazione10,11,28.
Analisi di campo in tempo reale anche sono stati ampiamente usate nel monitoraggio in modo dinamico la funzione dei GPCR eterologo o endogena. Un esempio di tali dosaggi avanzate si avvale di una variante di biosensore codificato geneticamente, che possiede un dominio di legame al cAMP fuso ad una forma mutante della luciferasi. Quando si lega l'accampamento, il cambiamento conformazionale conduce all'attivazione della luciferasi, luminescenza da cui poi può essere misurata con un lettore di chemiluminescenza29,30. La tecnologia di campo in tempo reale è stata segnalata per la de-orfano di umano odorant recettori nelle cellule 108CC15 HEK293 e NxGculo = "xrif" > 31,32,33, come pure il Hana3A derivato di HEK293T cellule34,35. Il gruppo Krautwurst anche descritto in dettaglio la tecnologia di campo in tempo reale per essere adatti alla bi-direzionale su larga scala o screening approcci32,33.
Qui descriviamo un protocollo per la misurazione di attivazione OR usando un'analisi in tempo reale di cAMP nelle cellule Hana3A. In questo protocollo, la luminescenza di pre-equilibrato di cellule vive è cineticamente misurata per 30 min dopo il trattamento con specifici composti volatili, che rappresentano un'analisi più efficiente e accurata di attivazione OR che sono meno suscettibili artefatti che si verificano nell'ambiente cellulare con tempo prolungato e le tossicità indotta da odore delle cellule. Questa misura in tempo reale consente uno screening su larga scala di ORs e di ligandi, come pure la caratterizzazione di coppie di OR-ligando specifiche di interesse. Usando questo metodo, correttamente identificato OR5AN1 come il recettore per il muschio composto muscone eseguendo uno screening contro 379 ORs umano e successivamente conferma il risultato di screening positivo.

<table><tbody><tr><td>Amfotericina B</td><td>Sigma</td><td>A2942</td><td></td></tr><tr><td>DMSO</td><td>Sigma</td><td>D2650</td><td></td></tr><tr><td>FBS</td><td>Gibco</td><td>10099-141</td><td></td></tr><tr><td>Reagente GloSensor cAMP</td><td>Promega</td><td>E1290</td><td></td></tr><tr><td>pGloSensor-20F plasmide cAMP</td><td>Promega</td><td>E1171</td><td></td></tr><tr><td>Cellule</td><td></td><td></td> Hana3A <td>disponibili presso gli autori su richiesta</td></tr><tr><td>HBSS, senza calcio o magnesio</td><td>GIBCO</td><td>14175095</td><td></td></tr><tr><td>HEPES</td><td>Hyclone</td><td>SH30237</td><td></td></tr><tr><td>Lipofectamine2000</td><td>Invitrogen</td><td>11668-019</td><td></td></tr><tr><td>M3R plasmide</td><td></td><td></td><td>clonato in un vettore di espressione di mammifero come pCI</td></tr><tr><td>MEM, con EBSS e L-glutammina</td><td>Hyclone</td><td>SH30024</td><td></td></tr><tr><td>Muscone</td><td>Santa Cruz</td><td>sc-200528</td><td></td></tr><tr><td>Musk tibetene</td><td>Sigma-Aldrich S359165</td><td></td><td></td></tr><tr><td>plasmidi</td><td></td><td></td> OR <td>clonati con un Rho-tag in un vettore di espressione di mammifero come pCI</td></tr><tr><td>PBS, senza calcio o magnesio</td><td>Cellgro</td><td>21-040-CV</td><td></td></tr><tr><td>Penicillina-streptomicina</td><td>Hyclone</td><td>SV30010</td><td></td></tr><tr><td>Plasmide miniprep kit</td><td>Tiangen</td><td>DP103-03</td><td></td></tr><tr><td>Puromicina</td><td>Sigma</td><td>P8833</td><td></td></tr><tr><td>RTP1S plasmide</td><td></td><td></td><td>clonato in un vettore di espressione di mammifero come pCI</td></tr><tr><td>Trypsin-EDTA</td><td>Hyclone</td><td>SH30236</td><td></td></tr><tr><td>provetta PCR da 0,2 mL</td><td>Axygen</td><td>PCR-02-C</td><td></td></tr><tr><td>provetta Eppendorf da 1,5 mL</td><td>Eppendorf</td><td></td><td></td></tr><tr><td>15 mL provetta conica da 17 mm x 120 mm</td><td>Pipettatore</td> multicanale BD <td>Falcon 352096</td><td></td></tr><tr><td>8 pozzetti e/o 12 pozzetti</td><td>Eppendorf</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Piastra per coltura cellulare bianca a fondo piatto a 96 pozzetti</td><td>Greiner</td><td>655098</td><td></td></tr><tr><td>Piastra per coltura cellulare da 100 mm x 20 mm</td><td>Cabina di sicurezza biologica BD Falcon</td><td>353003</td><td></td></tr><tr><td>Classe II con flusso</td><td></td><td></td><td></td></tr> <tr><td>laminareIncubatore per colture cellulari, con CO2</td><td></td><td></td><td></td></tr>centrifuga al 5%, <tr><td>con rotore a secchiello oscillante per provette</td><td></td><td></td><td></td>coniche da 15 ml</tr><tr><td>Lettore di piastre Infinite F200</td><td>Microscopio a</td> contrasto di fase Tecan <td></td><td></td></tr><tr><td>con obiettivi</td><td></td><td></td><td></td>x10 e x20</tr><tr><td>Spettrofotometro</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Serbatoi di reagenti sterili per la distribuzione</td><td></td><td></td><td></td>multicanale</tr><tr><td>Asciugamano</td><td></td><td></td><td></td> di carta sterile</tr></tbody></table>

vivere-cella misura di odorant recettore attivazione mediante un'analisi di campo in tempo reale

Live-cell Measurement of Odorant Receptor Activation Using a Real-time cAMP Assay

Le enormi dimensioni delle famiglie dei mammiferi odorant receptor (OR) presentano difficoltà per trovare loro ligandi affine fra numerosi prodotti chimici volatili. Per efficientemente ed esattamente deorphanize ORs, uniamo l'uso di una linea cellulare eterologo di esprimere dei mammiferi ORs e un plasmide biosensore geneticamente per misurare la produzione di cAMP a valle dell'attivazione di OR in tempo reale. Questa analisi può essere usata per schermo odoranti contro ORs e viceversa. Interazioni positive odorant-recettore degli schermi possono essere successivamente confermate dalla prova contro varie concentrazioni di odore, generando curve concentrazione-risposta. Qui abbiamo usato questo metodo per eseguire uno screening di alto-rendimento di un composto odoroso contro una libreria OR umana espressa in cellule Hana3A e confermato che il recettore risponde positivamente il recettore affine per il composto di interesse. Abbiamo trovato questo metodo di rilevamento ad alta velocità per essere efficiente e affidabile nel valutare l'attivazione OR e i nostri dati forniscono un esempio del suo uso potenziale negli studi funzionali OR.

Muscone è il principale componente aromatico da muschio naturale. Recenti studi OR5AN1 identificato come un recettore umano per muscone e altri composti di muschio macrociclici basati su omologia con il mouse o, MOR215-1, clonato da glomeruli muscone-sensible a reagire a comportarsi topi37,38. Per il repertorio umano OR, il nostro gruppo e il gruppo Touhara di screening anche identificati OR5AN1 come un ricevitore importante per c...

Che caratterizzano la funzione dei recettori odorant serve una parte indispensabile nel processo di deorphanization. Descriviamo un metodo per misurare l'attivazione di recettori di odorizzante in tempo reale usando un'analisi di campo.

Vivere-cella misura di Odorant recettore attivazione mediante un'analisi di campo in tempo reale

The enormous sizes of the mammalian odorant receptor (OR) families present difficulties to find their cognate ligands among numerous volatile chemicals. ...

L'obiettivo generale di questo saggio in tempo reale ad alto rendimento dell'adenosina monofosfato ciclico è quello di esaminare gli odoranti rispetto ai recettori per gli odoranti e viceversa. I topi sono utili per lo studio del funzionamento dei recettori per gli odoranti poiché consentono schermature su scala più ampia sia dei recettori per gli odoranti che dei ligandi, nonché la caratterizzazione farmacologica di coppie recettore-ligando di interesse. Il principale vantaggio di questa tecnica è che permette di valutare in modo efficiente e affidabile l'attivazione del recettore da parte degli odoranti.Sistema eterologo di espressione odore-recettore mediante cellule vive. Osservare innanzitutto le cellule Hana3A al microscopio a contrasto di fase per verificare la vitalità cellulare e stimare il grado di confluenza. Quindi aspirare tutto il mezzo dal piatto di coltura cellulare.E lavare le cellule aggiungendo 10 millilitri di soluzione salina tamponata al fosfato nella piastra, agitando la piastra e aspirando il PBS. Successivamente, aggiungere i tre millilitri di tripsina-EDTA 0,5% sulla piastra. Lasciare agire la tripsina sulle cellule per un minuto o fino a quando tutte le cellule non saranno in sospensione.Inattivare la tripsina aggiungendo 5 millilitri di MEM con il 10% di FBS ed eseguendo pipettaggi su e giù per disperdere i grumi di massa cellulare. Dopo aver effettuato il conteggio cellulare, trasferire 2x10 alla sesta cellule per piastra a 96 pozzetti da trasfettare in un tubo da 15 millilitri. È importante calcolare correttamente il numero di cellule da preparare nella piastra a 96 pozzetti per evitare una crescita eccessiva o insufficiente delle cellule prima della stimolazione.Centrifugare i tubi a 200 volte G per cinque minuti. Quindi aspirare il soprannatante senza disturbare il pellet cellulare. Aggiungere sei millilitri di mezzo senza antibiotici per ogni piastra a 96 pozzetti e pipettare su e giù senza creare bolle d'aria, per rompere i grumi della massa cellulare.Trasferire le cellule sospese in un serbatoio. Utilizzando una pipetta multicanale, aggiungere 50 microlitri di cellule in ciascun pozzetto delle piastre a 96 pozzetti. Incubare per tutta la notte a 37 gradi Celsius con 5% di anidride carbonica.Prima della trasfezione, osservare le cellule seminate al microscopio a contrasto di fase per verificare una corretta confluenza di circa il 30-50% per pozzetto, quindi reinserire nel termoambiente. Seguire la riga contrassegnata con il costrutto odorante-recettore, i costrutti del fattore accessorio e il costrutto variante del biologo del ciclico AMP. Preparare quindi una miscela di trasfezione plasmidica in 500 microlitri di MEM per ogni piastra a 96 pozzetti.Successivamente, preparare una miscela di trasfezione contenente 18 microlitri di reagente di trasfezione mediato da lipidi in 500 microlitri di MEM. Mescolare la miscela di trasfezione con la miscela plasmidica eseguendo pipettaggi ripetuti su e giù. Incubare quindi a temperatura ambiente per 15 minuti.Dopo l'incubazione, arrestare la reazione aggiungendo 5 millilitri di MEM con il 10% di FBS alla miscela di trasfezione. Successivamente, stendere uno strato spesso di fazzoletti di carta sterili nella cappa a flusso laminare. Prendere una piastra a 96 pozzetti con le cellule dall'incubatore.Battere delicatamente e ripetutamente la piastra capovolta sulla pila di salviette di carta in modo che il mezzo venga completamente assorbito dalle salviette. Trasferire 50 microlitri della miscela di trasfezione combinata in ogni pozzetto della piastra a 96 pozzetti e incubare tutta la notte per 18-24 ore a 37 gradi Celsius con 5% di anidride carbonica. È possibile gestire la trasfezione e il programma di stimolazione in modo che rimangano costanti sull'apparecchiatura quando vengono testate più di una piastra a 96 pozzetti in un singolo esperimento, in modo che tutte le piastre seguano lo stesso intervallo di trasfezione e di esposizione ai distillati.Prima della stimolazione, osservare le cellule transfezionate al microscopio a contrasto di fase per assicurare una confluenza adeguata del 50-80% per pozzetto prima di reinserire nell'incubatore. Preparare quindi il mezzo di stimolazione aggiungendo 10 millimolari di heaps e 5 millimolari di glucosio alla soluzione salina equilibrata di Hanks. Scongelare 55 microlitri di aliquote del reagente substrato per saggio del ciclico AMP in tempo reale su ghiaccio.Preparare una soluzione di abbattimento equo allo 2% mescolando 55 microlitri del reagente substrato e 2.750 microlitri di mezzo di stimolazione. Dopo aver steso uno strato spesso di salviette di carta sul banco, battere delicatamente e ripetutamente la piastra capovolta sulle salviette in modo che il mezzo di transfezione venga assorbito dalle salviette. Lavare le cellule pipettando 50 microlitri di mezzo di stimolazione in ogni pozzetto.Battere leggermente e ripetutamente per rimuovere il mezzo di stimolazione dalla piastra a 96 pozzetti. Pipettare 25 microlitri di soluzione di equilibrazione al 2% in ogni pozzetto e incubare a temperatura ambiente al buio per due ore. Poco prima della fine del tempo di incubazione, diluire le soluzioni stock degli odoranti scongelate alla concentrazione di lavoro e nel mezzo di stimolazione.Prima dell'aggiunta dell'odorante, utilizzare un lettore chemiluminescente a piastre per misurare il livello basale di luminescenza della piastra. Rimuovere rapidamente la piastra dal lettore e aggiungere 25 microlitri delle diluizioni dell'odorante in ogni pozzetto. Successivamente, avviare immediatamente la misurazione continua della luminescenza di tutti i pozzetti per 20 cicli entro 30 minuti.Sono stati analizzati 379 recettori odoranti umani unici contro la muscona a 30 micromolare utilizzando il saggio del cAMP in tempo reale. I riquadri colorati lungo l'asse X indicano diverse famiglie di recettori odoranti umani. L'asse Y rappresenta la luminescenza normalizzata 30 minuti dopo l'aggiunta dell'odorante, quando la risposta ha raggiunto il massimo per il controllo positivo.Viene indicata la risposta di OR5AN1. Questa figura mostra misurazioni in tempo reale dell'attivazione di OR5AN1 da parte di diverse concentrazioni di muscone e il risultato di un controllo negativo senza odore. La freccia indica il punto temporale di aggiunta dell'odorante.Qui viene mostrata una curva di risposta alla concentrazione di OR5AN1 contro la muscona a 30 minuti dall'aggiunta dell'odorante. La tecnica descritta richiede complessivamente tre giorni, iniziando con una piastra stock di colture il primo giorno. Una volta acquisita padronanza, l'intero processo nell'ultimo giorno può essere completato in tre ore per ogni piastra a 96 pozzetti, se eseguito correttamente.Dopo aver guardato questo video, dovresti avere una buona comprensione di come gestire l'attivazione dei recettori degli odori utilizzando un saggio dell'AMP ciclico per sfruttare i risultati.

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Qui mostriamo un protocollo di effettuare colorazione delle cellule vive, che può essere utilizzato per rilevare recettori olfattivi sulla superficie delle cellule HEK293T conveniente. Inoltre, può anche essere usata per test per l'espressione superficiale di altri recettori chemosensoriali o GPCR.

Saggio espressione di superficie dei recettori chemosensoriali in cellule eterologhe

Questo video dimostra il protocollo per misurare l'attivazione del recettore degli odori nelle cellule trasfettate utilizzando un biosensore di adenosina monofosfato ciclico (cAMP) e il rilevamento della luminescenza. Il metodo viene applicato per studiare le interazioni recettore-ligando e le vie di segnalazione nei neuroni olfattivi.

Misurazione dell'attivazione del recettore degli odori utilizzando un saggio ciclico in tempo reale dell'adenosina monofosfato

Fonte: de March, C. A. et. al., Monitoraggio in vitro in tempo reale dell'attivazione del recettore odorizzante da parte di un odorizzante in fase vapore. J. Vis. Exp. (2019)Questo video dimostra il metodo per monitorare l'attivazione in tempo reale dei recettori degli odori nelle cellule di mammifero ricombinanti utilizzando la misurazione della luminescenza. Il legame con gli odori innesca l'attivazione delle proteine G e la produzione di cAMP, attivando le proteine glosensori che emettono...

Monitoraggio in tempo reale dell'attivazione del recettore degli odori nelle cellule ricombinanti

L'attivazione persistente del inibitori G recettori accoppiati alla proteina provoca sensibilizzazione della segnalazione ciclasi ciclasi. Per identificare le vie molecolari essenziali, sono necessari approcci nonbiased, tuttavia, questa strategia richiede lo sviluppo di una base cellulare scalabile saggio cAMP sensibilizzazione. Qui, descriviamo un test di sensibilizzazione per la piccola molecola e lo screening siRNA.

Farmaco-indotta Sensibilizzazione della ciclasi: L&#39;ottimizzazione del dosaggio e miniaturizzazione per piccole molecole di siRNA e applicazioni di screening

Olfattive pattern di attivazione del recettore codificano identità odore, ma la mancanza di dati pubblicati identificativi ligandi odoranti per i recettori olfattivi dei mammiferi ostacola lo sviluppo di un modello completo di codifica odore. Questo protocollo descrive un metodo per facilitare l'identificazione ad alta produttività di ligandi dei recettori olfattivi e quantificazione di attivazione del recettore.

High-throughput Analisi dei mammiferi olfattive Recettori: Misurazione del recettore Attivazione tramite Luciferase Activity

L'analisi delle proprietà fisiologiche dei neuroni sensoriali olfattivi incontra ancora limitazioni tecniche. Qui li registriamo attraverso un patch-clamp perforato in una preparazione intatta dell'epitelio olfattivo in topi geneticamente mirati. Questa tecnica consente la caratterizzazione delle proprietà di membrana e delle risposte a specifici ligandi di neuroni che esprimono recettori olfattivi definiti.

Perforato Patch-clamp registrazione di topo neuroni sensoriali olfattivi In neuroepithelium intatto: Analisi funzionale di neuroni Esprimendo un Identificato odorizzante Receptor

Questo protocollo analizza il comportamento di navigazione di Drosophila larva in risposta alla stimolazione simultanea optogenetica dei suoi neuroni olfattivi. Luce di lunghezza d'onda di 630 nm viene utilizzata per attivare i singoli neuroni olfattivi, esprimendo una rodopsina canale rosso-spostato. Larvale movimento viene registrato contemporaneamente, registrato in digitale e analizzati utilizzando il software personalizzato.

Il comportamento larvale della drosofila in risposta alla stimolazione optogenetica dei neuroni olfattivi di rilevamento

Fisiologicamente, odorant recettori sono attivati da molecole odorant inalati in fase gassosa. Tuttavia, più sistemi in vitro utilizzano stimolazione odorant fase liquida. Qui, presentiamo un metodo che consente il monitoraggio in tempo reale in vitro dell'attivazione del recettore odorant stimolazione odorant in fase vapore.

In tempo reale In Vitro monitoraggio dell'attivazione del recettore Odorant da un Odorant in fase gassosa

Il protocollo presentato in questo studio illustra l'efficacia del cAMP Difference Detector In Situ  nella misurazione del cAMP attraverso due metodi. Un metodo utilizza uno spettrofotometro per la lettura di piastre a 96 pozzetti con celle HEK-293. L'altro metodo dimostra le singole cellule HASM sotto un microscopio a fluorescenza.

Dinamica del cAMP in tempo reale in cellule vive utilizzando il rivelatore di differenza fluorescente cAMP in situ

Neuroni recettori olfattivi (ORNs) convertire i segnali olfattivi prima in un recettore corrente che a sua volta attiva i potenziali d'azione che vengono trasmessi ai neuroni di secondo ordine nel bulbo olfattivo. Qui si descrive la tecnica pipetta di aspirazione di registrare simultaneamente l'odorizzante indotta recettore correnti e potenziali d'azione da ORNs mouse.

Odorizzante indotte risposte registrate da neuroni recettori olfattivi con la tecnica della pipetta di aspirazione

Impara a misurare l'attivazione dei recettori odoranti in tempo reale con un saggio cAMP su cellule Hana3A. Questo metodo ad alto rendimento consente lo screening efficiente di odoranti e ligandi per studi farmacologici.

Vivere-cella misura di Odorant recettore attivazione mediante un'analisi di campo in tempo reale

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