Name: In Vitro Dosaggio di bioluminescenza per caratterizzare il ritmo circadiano in cellule epiteliali mammarie (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-09-28T12:30:00.000+00:00
Duration: 11 min 56 s
Description: Impara a caratterizzare il ritmo circadiano in cellule epiteliali mammarie con un dosaggio di bioluminescenza in vitro. Questo metodo permette di studiare i modulatori ambientali degli orologi circadiani in diversi organi.

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Questo lavoro è stato supportato da 2012 società di tossicologia (SOT)-Colgate Palmolive Grant per ricerca alterativa (M. Fang) e la ricerca di collaborazione internazionale fondo da animali e piante quarantena Agenzia, Repubblica di Corea (M. Fang), e concedere il NIEHS P30ES005022 (Zarbl H.). Vorremmo ringraziare il dottor Zheng Chen (McGovern Medical School presso l'Università di Texas Health Science Center a Houston) per la sua discussione utile, Mr. Shao-An Juan per la sua assistenza sperimentale e MS. Kimi Nakata per la prova di lettura.

1. costruzione del PER2 promotore guidato destabilizzato Luciferase Reporter vettore <ol><li>acquistare un oggetto personalizzato pLS [hPER2P / rLuc / Puro] vettore che contiene il cDNA codificante rLuc e umani Frammento di promotore PER2 (hPER2P, 941 bp) presso il sito tra Sac I e Hind III a clonazione più regione 17.</li>
	<li>Tagliare il frammento di promotore PER2 umano (hPER2P, 941 bp) fuori dal vettore.
	Buffer di enzima di restrizione <ol><li>aggiungere 2,5 µ l, 10 µ l (180 ng) pLS [hPER2P / rLuc / Puro] vettore e 1 µ l di enzimi di restrizione, Sac I (10 unità / µ l) e Hind III (10 unità / µ l), in un DNA/RNA/nucleotide-gratuito tubo del microcentrifuge. Aggiungere acqua ultrapura (10,5 µ l) fino a 25 µ l e mescolare dolcemente pipettando.</li>
		<li>Incubare a 37 ° C per 90 min in un blocco di riscaldamento.</li>
		<li>Eseguire l'intero volume (25 µ l) della reazione degli enzimi di limitazione su gel di agarosio di 0,7% contenente 0,0001% etidio bromuro (EtBr) per separare il hPER2P dal vettore. 
		Nota: EtBr, bromuro di 3,8-diamino-1-ethyl-6-phenylphenantridinium (numero di registrazione di CAS: 1239-45-8), è un liquido inodore rosso. È un agente intercalante che è comunemente usato come un fluorescente tag (colorante acido nucleico) nell'elettroforesi del gel di agarosio e visibile come un colore arancione sotto la luce UV. Possibili rischi di effetti mutageni irreversibili si sono verificati in animali da esperimento, anche se nessuno degli enti regolatori Classificato come un agente cancerogeno 18. Di conseguenza, abbiamo raccolto agarosio utilizzato gel ed elettroforesi tampone contenente EtBr come rifiuti rischio chimico e richiesto da Rutgers Environmental Health &#38; sicurezza (REHS) per raccogliere e smaltire in modo sicuro.</li>
		<li>Tagliare un pezzo di gel di agarosio contenente una banda di fluorescenza di EtBr a 941 bp e purificare i frammenti hPER2P dal gel con un kit di estrazione del DNA gel, seguito da quantificazione su uno spettrofotometro misurando la densità di assorbimento (OD) a 260 Nm.</li>
	</ol></li> <li>Linearizzare 1,0 µ l (1 µ g) del vettore di espressione destabilizzato firefly luciferase, pGL [Luc2P / Neo] con lo stesso metodo come descritto nella procedura 1.2.1-1.2.2. Estrarre il vettore con un kit di pulizia del DNA seguito da quantificazione come descritto in precedenza utilizzando uno spettrofotometro.</li>
	<li>Legare il hPER2P nel vettore linearizzato pGL [Luc2P / Neo]. 
	Nota: Per il produttore &#39; s instruction, l'ideale rapporto molare di inserto e vettore è 2:1. Per vettore di ng 50, la quantità ideale di inserimento viene calcolata come 23,6 ng con una formula, [(50 ng vector x 1.0 kb insert)/4.242 kb vettoriale] x (2/1) = 23,6 ng inserto]. Basato sulle concentrazioni di hPER2P (7,26 ng / µ l) e pGL [Luc2P / Neo] (50 ng / µ l), i volumi di 50 ng pGL [Luc2P / Neo] e 23,6 ng hPER2P sono calcolati come 1 µ l e 3,26 µ l, rispettivamente.
	Reazione di <ol><li>ligasi del DNA T4 di aggiungere 2 µ l tampone (10 X) (50 mM Tris-HCl 10 mM MgCl 2, 1mm ATP e 10 mM DTT), 3,26 µ l (23,6 ng) hPER2P, 1 µ l (50 ng) pGL [Luc2P / Neo], e 13,74 µ l acqua fino a 20 µ l , mescolare delicatamente.</li>
		<li>Aggiungere 1 µ l T4 DNA ligasi (400 unità / µ l), mescolare delicatamente e incubare a 16 ° C durante la notte in un termociclatore e poi raffreddare il vettore legato sul ghiaccio per il produttore &#39; Istruzione s.</li>
	</ol></li> <li>Trasformare il vettore dei pGL [hPer2P / Luc2P / Neo] a chimicamente competente Escherichia coli 19.
	<ol><li>Impostare il bagno di acqua a 42 ° C, scaldare il brodo ottimale Super con il mezzo di repressione (S.O.C) dei cataboliti (2% Tryptone, 0,5%, Estratto di lievito, 10 millimetri di NaCl, 2.5 mM KCl, 10mm MgCl 2, 10mm MgSO 4 e 20 millimetri di glucosio) a temperatura ambiente , riscaldare la piastra di agar Luria-Bertani (LB) (contenente 100 µ g/mL ampicillina, 80 µ g/mL X-gal e 0,5 µM IPTG), in incubatore a 37 ° C e scongelare su ghiaccio un flaconcino di competente Escherichia coli cellule per ogni trasformazione.</li>
		<li>Aggiungere 6 µ l (21 ng) legato 1 µ l o vettoriale (30 ng) vettore (controllo negativo) per un tubo di chimicamente competenti Escherichia coli (50 µ l) vuoto e poi capovolgere delicatamente il tubo per mescolare. Incubare in ghiaccio per 30 min.</li>
		<li>Heat shock in bagnomaria a 42 ° C per 30 s senza agitazione e poi tornare alla Ice.</li>
	</ol></li> <li>Selezionare una colonia di Escherichia coli trasformata con un vettore dei utilizzando lo screening blu/bianco.
	<ol><li>Medie aggiungere 250 µ l S.O.C il trasformato e. coli tube e incubare per 1h a 37 ° C con agitazione a 200 giri/min.</li>
		<li>Si è diffusa in modo uniforme 10-50 µ l di trasformato Escherichia coli sulla superficie della piastra di agar LB. Mettere la piastra capovolta in incubatore a 37 ° C durante la notte. 
		Nota: Una reazione efficiente clonazione dovrebbe produrre diverse colonie di centinaia. Due diversi volumi di placcatura è consigliata per garantire che almeno un piatto avrà colore chiaro grande, bianco o blu e le colonie ben distanziati. Quando le colonie sono troppo piccole e il colore non è distinguibile, utilizzando un microscopio (10 X o 50 X) è disponibile.</li>
		<li>Pick 3-6 colonie bianchi dalle piastre con dente sterilizzato bastoni e rilasciare ogni colonia nel tubo una cultura contenente 4 mL di terreno di coltura LB con ampicillina di 50 µ g/mL.</li>
		<li>Incubare le provette a 37 ° C con agitazione a 200 giri/min durante la notte. Estrarre il DNA con 2 mL di 4 mL coltivate con un plasmide DNA estrazione mini prep kit per il fabbricante l'e. coli &#39; Istruzione s.</li>
	</ol></li> <li>Verificare e analizzare l'inserto (hPER2P, 941 bp) <ol><li>digerire il DNA del plasmide con enzimi di restrizione ed eseguire l'elettroforesi come descritto nella procedura 1.2.1-1.2.3 per confermare se c'è un inserto. 
		Nota: Controllo positivo (hPER2P purificato al punto 1.2.4) e controllo negativo (e. coli trasformate con un vettore vuoto) sono stati inclusi.</li>
		<li>Sequenza DNA plasmidico selezionato utilizzando M13 in avanti ed iniettori d'inversione M13 per confermare l'orientamento e la sequenza di inserto a plasmide 19. 
		Nota: Solo una colonia che aveva un inserto con la dimensione corretta del hPER2P in elettroforesi e corretto orientamento e sequenza nel risultato sequenziamento è stato selezionato.</li>
		<li>Analizzare il frammento di promotore PER2 umano (hPER2P, 941 bp) di sequenza per gli elementi normativi circadiani, tra cui motivi di E-box (un sito di legame di Bmal1, CAT/CGTG), CCAATC, GC box e trascrizione start sito (CAGCGG) 20.</li>
	</ol></li> <li>Amplifica il selezionato Escherichia coli aggiungendo il rimanente da 2 mL coltivato Escherichia coli in mL 200 LB terreno di coltura contenente ampicillina di 50 µ g/mL e poi incubazione durante la notte, a 37 ° C con agitazione a 200 giri/min.</li>
	<li>Estrarre DNA con un maxi privo di endotossina plasmide prep kit per ogni il produttore &#39; Istruzione s e quindi di quantificarlo misurando OD a 260 Nm con uno spettrofotometro. Aliquotare e archivio il DNA del plasmide, pGL [hPer2P/Luc2P/Neo], in congelatore a-80 ° C per un uso futuro.</li>
</ol> 2. Trasfezione transiente <ol><li>acquisto e coltura di cellule di MCF10A <ol><li>acquisto un'immortalizzate, non trasformate normale umano linea cellulare epiteliale mammaria (MCF10A) da un commerciale di banca di cellule, dove le cellule sono citogeneticamente testato e autenticato con breve ripetizione in tandem analisi prima del congelamento. Scongelare e mantenere ogni flaconcino di cellule congelate in coltura per un massimo di 8 settimane. 
		Nota: A differenza di altre cellule, queste cellule hanno inibizione da contatto una volta che ottengono alla confluenza di ~ 70%. Richiede quella sottocultura avviene a circa il 70%.</li>
		<li>Della coltura le cellule con il mezzo di crescita delle cellule epiteliali mammarie (MEGM), che contiene la sostanza basale epiteliale mammaria (MEBM), supplementi di crescita e tossina del colera in un'incubatrice di coltura cellulare a 37 ° C, umidità 95% e 5% CO 2. 
		Nota: Acquisto di fattori di crescita di ready-to-use forniti in SingleQuot (SQ) e ottenere la tossina del colera separatamente. Le concentrazioni finali dei supplementi di crescita sono bovina estratto pituitario 0,4%, 0,1% insulina, idrocortisone 0.1%, 0,1% fattori di crescita epidermico umano, tossina del colera di 100 ng/mL e 0.05% gentamicina solfato e 0.05% amfotericina B.</li>
		<li>Dissociare le cellule nella piastra di coltura di 10 cm di incubazione con 10 mL di tripsina/EDTA per ~ 20 min e quindi neutralizzare la tripsina aggiungendo tripsina 10ml soluzione neutralizzante. Raccogliere tutte le celle con HEPES buffer soluzione salina (HBSS).</li>
		<li>Contare le celle con un emocitometro sotto un microscopio invertito e calcolare la concentrazione della sospensione unicellulare e seme poi un certo numero di cellule, come necessario. Agitare le piastre accuratamente per ottenere una distribuzione uniforme delle cellule in ogni piatto. Incubare le cellule nell'incubatore di cultura cellulare a 37 ° C, umidità 95% e 5% CO 2. 
		Nota: Acquistare una confezione di reagenti di sottocultura contenente tripsina/EDTA, soluzione neutralizzante tripsina e HBSS utilizzare.</li>
	</ol></li> <li>Transitori di transfezione delle cellule con il vettore circadiano costruito.
	<ol><li>Seme 2 x 10 5 MCF10A cellule uniformemente in 35mm coltura piatto con MEGM e crescere fino a 20-30% confluenza (giorno successivo).</li>
		Media del siero <li>warm up ridotto (ad es., Opti-MEM) a 37 ° C acqua vasca e transfezione reagente a temperatura ambiente per 30 min. Diluire il plasmide DNA costruito (pGL [hPer2P / Luc2P / Neo]) a 30 ng / µ l con endo-tossina libera Tampone Tris-EDTA (TE) e tenerlo a temperatura ambiente.</li>
		<li>Preparare la miscela di transfezione del plasmide in una microcentrifuga da 1,5 mL aggiungendo 63,6 µ l siero riduttore caldo media prima, quindi l'aggiunta di DNA del plasmide (0,1 µ g) µ l 33,4 e mescolare delicatamente il pipettaggio, e infine aggiungendo 3 µ l di transfezione reagente direttamente nel centro del tubo senza toccare la parete. Dopo la miscelazione dolcemente pipettando, conservare a temperatura ambiente per 30 min.</li>
		<li>Cadere l'impasto intero plasmide (100 µ l) direttamente sulla superficie del centro del mezzo nel piatto e poi mescolare delicatamente agitando il piatto. Coltura le cellule in un incubatore a CO 2 per altre 48-72 h. 
		Nota: Si prevede che la massima efficienza di trasfezione sarebbe alla confluenza di 40-70% di queste cellule a causa della loro inibizione da contatto a ~ 70%. Di conseguenza, la transfezione funziona migliori a partire da ~ 20% e fermata a ~ 70% confluenza.</li>
	</ol></li></ol> 3. Istituzione del dosaggio bioluminescenza In Vitro in cellule di MCF10A transitoriamente Transfected <ol><li>morire di fame le cellule coltivate alla confluenza di ~ 70% (dopo la trasfezione per 48-72 h) in MEBM senza fattori di crescita per 24 h.</li>
	<li>Trattare le cellule con l'agente di sincronizzazione (ad esempio, 50% di siero equino (HS)) in MEBM per 1,5 h in incubatore a CO 2. 
	Nota: Per la selezione di un agente di sincronizzazione ideale, 10 µM forskolin, 1 nM melatonina, desametasone 0,1 µM, 50% HS e 100% SQ sono stati confrontati in termini di ampiezza circadiana e periodo nelle cellule circadiano vettoriale trasfettate. Vettore vuoto transfettate le cellule sono trattate con 100% SQ come controllo negativo.</li>
	<li>Supporto di registrazione di pre-prepare 20 mL (per 10 dei piatti di cultura 30mm) aggiungendo 5 mL di MEGM, 15 mL di MEBM, 150 µ l bicarbonato di sodio, 200 µ l HEPES e luciferina 40 µ l di soluzione (50 mM) in una provetta da centrifuga 50 mL sterilizzato riserva. 
	Nota: Le concentrazioni finali dei singoli componenti: 20% SQ e tossina del colera 20 ng/mL, bicarbonato di sodio 0,06%, 1% di penicillina/streptomicina e 10 mM HEPES. Riscaldamento pre-preparati registrazione medio e sterilizzato 1X PBS per 30 min a 37 ° C bagno d'acqua. Aggiungere 100 luciferina µM immediatamente prima dell'uso.</li>
	<li>Lavare le cellule con caldo 1 x Dulbecco &#39; s Phosphate-Buffered Saline (D-PBS) per 3 volte dopo l'incubazione con l'agente di sincronizzazione e quindi aggiungere 2 mL di mezzo di registrazione.</li>
	<li>Guarnizione il piatto con una classe di copertura sterilizzato utilizzando grasso al silicone per evitare l'evaporazione e quindi apporre un'etichetta sul lato.</li>
	<li>Porre la capsula sigillata nella sede all'interno del luminometro e attivare l'opzione per salvare il percorso del file nella cartella (per il dettaglio, vedi sezione 6).</li>
</ol> 4. Selezione di cellule stabilmente trasfettate con <ol><li>ottimizzare una concentrazione ideale G418 (800 µ g/mL) con un'analisi della curva di uccidere secondo il produttore &#39; istruzione di s per la selezione delle cellule stabilmente trasfettate.</li>
	<li>Dopo trasfezione transiente per 48 o 72 ore, sottocultura e seme le cellule con MEGM in piatti più grandi alle 5.000 cellule/piatto (100 mm). Dopo 24 h cultura nell'incubatrice di coltura cellulare (37 ° C, umidità 95% e 5% CO 2), trattare le cellule con 800 µ g/mL di G418 sostituendo il vecchio mezzo con nuovo medium contenente 800 µ g/mL G418 ogni 3-4 giorni per 2 settimane.</li>
	<li>Sottocultura sopravvivente stabilmente trasfettate colonie per passaggi 1-3 con MEGM contenente 500 µ g/mL G418 per mantenere l'espressione stabile di hPer2P/Luc2P e congelato in azoto liquido per un utilizzo futuro.</li>
	<li>Trattamento di 500 µ g/mL G418 dopo la subcoltura generale per selezionare nuovamente la popolazione stabilmente trasfettata delle cellule, se l'intensità di bioluminescenza nel risultato dell'analisi di bioluminescenza in vitro diventa progressivamente più basso dopo l'uso in molti passaggi.</li>
</ol> 5. Trattamento con prodotti chimici <ol><li>alle 48 ore o 72 ore post-transfezione, morire di fame le cellule da fattori di crescita in MEBM per 24 h.</li>
	<li>Dopo la sincronizzazione con 50% HS per 2 h, trattare le cellule con 0,25 o 0,5 mM nitrosomethylurea (NMU), 20 nM EX527 o cambinol di 1 µM per 1 h a MEBM contenente 20% sq.</li>
	<li>Dopo il lavaggio con 1 x D-PBS, Aggiungi registrazione media contenente 12,5 µM MSC da soli o in combinazione con 20 nM EX527 o cambinol di 1 µM, alle cellule. Monitoraggio la bioluminescenza con il luminometro.</li>
	<li>Trattare il MCF10A stabilmente trasfettate / PER2-cellule dLuc con NMU a 0,5, 1 o 2 mM, EX527 a 40 nM, o Cambinol a 2,0 µM, per 1 h dopo la sincronizzazione con 50% HS e poi incubare le cellule in registrazione media contenente 12,5 µM di MSC o dosi differenti (5, 10 o 20 µM) di n-acetilcisteina (NAC). Inserire le piastre sul luminometro, record e salvare la bioluminescenza dal luminometro per 4-8 giorni come descritto nella sezione 3.6. 
	Nota: NMU è una nitrosourea metilato composto con proprietà mutagene, cancerogene e teratogene. NMU è un agente alchilante ad azione diretta e ha una breve emivita (T 1/2 = ~ 30 min). È stabile alle condizioni acide (pH 4-5), ma instabile stato alcalino (pH 9-10) e a temperature oltre i 20 ° C. Di conseguenza, candeggina al 10% utilizzabile come un efficace agente di disattivazione per pulizia di superfici panca e mercanzie di laboratorio potenzialmente contaminate da Solutia NMUsu. Soluzione di riserva avanzi è prelevati e smaltiti in modo sicuro da REHS. Base alla modalità di azione di prodotti chimici, cellule sincronizzate possono essere trattate per tempi più brevi prima coltura in supporto di registrazione. Le cellule possono anche essere trattate a mezzo di registrazione per un tempo più lungo (diversi giorni).</li>
</ol> 6. Raccolta dati, analisi e presentazione Nota: attuabilità delle cellule deve essere determinata utilizzando metodi standard (ad es., analisi di MTT) dopo il trattamento delle cellule alle stesse concentrazioni per gli stessi tempi indicati. Tutte le concentrazioni di trattamento usate per il test di bioluminescenza in vitro sono stati inferiori al 30% di concentrazione letale (LC30). Tutti gli esperimenti sono stati condotti in triplice copia e sono stati presentati i risultati rappresentativi.
<ol><li>Dopo aver sigillato il piatto (passo 3.5), caricare i piatti su sedi nel luminometro, che viene mantenuto all'interno di un incubatore a 37 ° C senza H 2 O e CO 2 e collegato a un computer.</li>
	<li>Clic &#34; salvare &#34; e immettere i nomi per la cartella e il file dove verrà salvato il segnale di luminescenza registrato dal piatto corrispondente. 
	Nota: Il sistema rileva il segnale di luminescenza in tempo reale dalle cellule nel piatto alle singole posizioni. I segnali vengono trasferiti al computer tramite 4-photon-counting "tubi fotomoltiplicatori" e salvati e visualizzati nel computer di software di raccolta dati.</li>
	<li>Analizzare i segnali dopo aver registrato per 4-7 giorni, che potrebbe essere seguita da cambiamento medio e registrazione continua per una seconda settimana se necessario. 
	Nota: Per ottenere i parametri circadiani, tra cui fase, durata del periodo, ampiezza di ritmo e smorzamento tasso, abbiamo usato il software di analisi di luminometro per analizzare i dati di bioluminescenza.</li>
	<li>Detrend dati raw con una media in esecuzione e analizzare il meglio-si adatta a un'onda sinusoidale per ottenere periodo, fase, ampiezza e smorzamento tasso 21 , 22.</li>
	<li>Dovuto la bioluminescenza transitoria alta al momento di trattamento e di cambiamento medio, escludere il primo ciclo di dati da analisi.</li>
	<li>Per la presentazione dei dati, tracciare i dati grezzi (bioluminescenza, conteggio/s) contro il tempo (ore o giorni). Quando necessario, possono essere tracciati i dati baseline-sottratto per confrontare l'ampiezza e la fase.</li>
</ol>

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Gli autori non hanno nulla a rivelare.

In cellule di mammifero, periodicità dell'orologio circadiano è regolato da anelli di retroazione trascrizionale traslazionale interconnessi. Eterodimeri di Bmal1 e orologio o Npas2 regolare la trascrizione circadiano legandosi agli elementi di E-box nei promotori di nucleo CGs, tra cui Per2 e piangeree numerosi CCGs4. Come si accumulano nella cella, heterodimers di a: Cry traduzionalmente modificati e trasportate al nucleo di reprimere l'attività trascrizionale dell'orologio: Bm...

L'orologio circadiano regola una vasta gamma di processi biologici da diurni espressione dei geni per dormire il comportamento in un ritmo prevedibile con una periodicità di circa 24 h. epidemiologico gli studi suggeriscono fortemente che rottura cronica del circadiano ritmo aumenta il rischio di cancro al seno e alla prostata nei turnisti, tra cui gli infermieri e gli equipaggi di volo1,2,3. Questi risultati sono confermati dagli studi del roditore, che dimostrano che l'esposizione a cicli di luce di notte, o luce di luce costante, che imitano il jet lag aumento l'incidenza del tumore e accelera la crescita del tumore4,5. Basato su dati provenienti da studi sia umani e del roditore, l'Agenzia internazionale per ricerca sul cancro classificati turni di lavoro come agente cancerogeno umano probabile (tipo 2A) in 20106.
Precedentemente, abbiamo dimostrato che una singola dose cancerogena dell'agente cancerogeno specifico tumore mammario, N- nitroso-N- methylurea (NMU), interrotto l'espressione circadiana dei principali geni circadiani (CGs) (ad es., periodo 2 , Per2) e parecchi geni circadiani controllato (GCC), tra cui chiave reattivo il danno del DNA e ripristino geni (DDRR) nella ghiandola mammaria di destinazione (ma non nel fegato). Inoltre, reimpostare l'espressione circadiana dei geni sia Per2 e DDRR verso il normale da un regime chemopreventive dell'alimentari L-metil-selenocisteina (MSC) ha ridotto l'incidenza del tumore del 63%. Questi risultati sono stati i primi a mostrare un collegamento meccanicistico tra ritmo circadiano, carcinogenesi chimica e chemoprevention7,8. Esposizioni verso altri tossici ambientali indicate per interrompere gene circadiano espressione in vivo inoltre sono associate con un rischio aumentato di malattie ambientali9,10. La comprensione dei meccanismi che collegano la rottura circadiana di tossici ambientali e patogenesi può portare a meccanicistico approcci alla prevenzione della malattia. Tuttavia, gli studi volti a definire le interazioni tra le esposizioni e ritmo circadiano sono di solito eseguite in vivo. Un tipico in vivo esperimento studiando che l'impatto sul ritmo circadiano richiede grandi quantità di animali, tessuti da almeno tre di controllo e tre animali esposti devono essere raccolti ogni 3-4 ore su un periodo di 24 o 48 h. Sviluppo di un sistema convalidato in vitro che ricapitola in vivo osservazioni e meccanismi sarebbe quindi non solo riducono il numero di animali necessari, ma anche drasticamente ridurre i costi sperimentali e il requisito che i ricercatori lavorano continuativamente per un periodo di 24-48 h. Inoltre, un sistema convalidato in vitro potrebbe essere usato per screening su vasta scala di composti e/o alterazioni genetiche che influenzano il ritmo circadiano, o la sua risposta a fattori di stress ambientale o sostanze tossiche. Pertanto, la combinazione strategica di modelli in vitro e in vivo e gli esperimenti sono necessari per ottenere diverse intuizioni con diversa attenzione.
Nei mammiferi, oscillatori circadiani esistano non solo nei neuroni specializzati del SCN, ma anche in diversi tipi di cellule più periferiche. Questi orologi molecolari sono simili a quelli nelle linee cellulari stabilite del fibroblasto e nei fibroblasti primari da embrioni o animali adulti; Tuttavia, c'è una necessità per tessuto modelli cellulari di tipo-specific11. Di conseguenza, gli studi tradizionali di attività locomotrice in vivo, SCN espianti ex vivoe saggi basati su cellule in vitro in cellule immortalizzate del fibroblasto sono ampiamente usati per studiare i difetti circadiani cella-autonoma. Tuttavia, non ci sono prove che indicano che un in vitro dei fibroblasti basati su cellule test può ricapitolare meccanismi circadiani e risposte presentano in cellule di altri organi periferici in vivo. Diversi tipi di cellule possono avere modelli distinti di espressione genica, metabolismo xenobiotico e DDRR, e i legami tra tossicità ed espressione genica circadiana possono essere cellula-tipo specifico e/o modulata da diversi parametri fisiologici. Inoltre, oscillatori circadiani nei sistemi basati su fibroblasti non sono stati completamente valutati per risposte a tossici ambientali, fattori di stress e agenti preventivi che collegano le esposizioni ai meccanismi di prevenzione e lo sviluppo della malattia. Così, c'è una necessità per facile, convalidato cellula-tipo specifico, le analisi in vitro bioluminescenza per studiare gli interferenti circadiano ambientali specifici di organo. Anche se una varietà di modelli di orologio cellulare (ad es., nel fegato, cheratinociti e le cellule di grasso, nonché una linea di cellule di osteosarcoma) sono state sviluppate in anni recenti12,13,14, 15, il dosaggio descritto qui è il primo modello di orologio cellulare in cellule epiteliali del seno e la prima dimostrazione in vivo risposte a fattori di stress ambientale, sostanze tossiche, farmaci e agenti chemopreventive di ricapitolare.
Renilla luciferasi (rLuc) e luciferasi firefly 30-61 kDa proteine monomeriche che non necessitano di posttranslational elaborazione dell'attività enzimatica e possono funzionare come un reporter genetico immediatamente dopo la traduzione. Una volta che il substrato si associa con l'enzima luciferasi, la reazione biochimica catalizzata genera un lampo di luce. Così, la luciferasi costrutti sono ampiamente usati come espressione gene reporter sistema in vitro e in vivo. Tuttavia, negli studi di ritmo circadiano, l'utilità del reporter di luciferase è limitato il tempo di dimezzamento relativamente lunga della proteina luciferasi (T1/2 = h 3,68) relativa al periodo (soprattutto per il breve periodo) per mutazioni nel gene circadiano espressione; Tuttavia, numerosi studi nel corso degli anni hanno utilizzato con successo il gene della luciferasi nel vettore pGL3, che indica che la luciferasi rapidamente degradabile potrebbero non essere necessario per aver segnalato i ritmi circadiani, soprattutto per i ritmi con un periodo più lungo, come 24 h. Pertanto, un reporter del utilizzando il vettore di luciferasi destabilizzato, pGL [Luc2P/Neo], che contiene hPEST (una sequenza di destabilizzazione della proteina) è stato sviluppato, che ci permette di usarlo come un vettore reporter circadiano per nostra attuale in vitro analisi di bioluminescenza. La proteina codificata da Luc2P ha una molto più breve emivita (T1/2 = 0,84 h) e quindi, risponde più velocemente e con un ordine di grandezza maggiore ai cambiamenti nell'attività trascrizionale che il selvaggio-tipo, hoSPI che può essere utilizzato per monitorare l'espressione ritmica della luciferasi regolato dal promotore PER2 con precisione in tempo reale16.

<table><tbody><tr><td>pLS[hPER2P/rLuc/Puro] vettore SwitchGear</td><td>Genomics</td><td>S700000</td><td>vettore</td></tr><tr><td>personalizzato pGL4.18[Luc2P/Neo] vettore</td><td>Promega</td><td>9PIE673</td><td>vettore di espressione della luciferasi destabilizzata</td></tr><tr><td>T4 DNA ligasi</td><td>Invitrogen</td><td>15224041</td><td>Per il subclonaggio Kit di clonazione</td></tr><tr><td>TOPO TA</td><td>Invitrogen</td><td>K4500-02</td><td>con One Shot TOP10 E. coli chimicamente competente</td></tr><tr><td>Sac I</td><td>New England BioLabs</td><td>R0156S</td><td>Enzima di restrizione</td></tr><tr><td>Hind III-HF</td><td>New England BioLabs</td><td>R3104S</td><td>Enzima di restrizione</td></tr><tr><td>CutSmart tampone</td><td>New England BioLabs</td><td>B7204S</td> Kit di estrazione del gel di <td>DNA del tampone enzima di restrizione</td></tr><tr><td></td><td>Qiagen</td><td>28704</td><td>Purifica i frammenti di DNA dal gel di agarosio</td></tr><tr><td>Kit di purificazione PCR</td><td>Qiagen</td><td>28104</td><td>Pulizia del DNA LB</td></tr><tr><td>Modifica di Miller</td><td>TEKNOVA</td><td>L8600</td><td>Per colture di E. Coli trasformate</td></tr><tr><td>LB Agar Piastra</td><td>TEKNOVA</td><td>L1902</td><td>Per la selezione bianco/blu</td></tr><tr><td>QIAprep spin miniprep Kit</td><td>Qiagen</td><td>27104</td><td>Per l'estrazione del DNA plasmidico</td></tr><tr><td>EndoFree maxi prep Kit</td><td>Qiagen</td><td>12362</td><td>Per l'estrazione del DNA plasmidico</td></tr><tr><td>FuGene HD</td><td>Promega</td><td>E2311</td><td>Reagente di trasfezione</td></tr><tr><td>Opti-MEM terreno sierico ridotto</td><td>Invitrogen</td><td>31985-062</td><td>Per trasfezione</td></tr><tr><td>Linea cellulare MCF10A</td><td>Collezione di colture di tipo americano</td><td>CRL-10317</td><td>Cellule epiteliali mammarie</td></tr><tr><td>MEGM BulletKit</td><td>Lonza</td><td>CC-3150</td><td>Terreno di crescita epiteliale mammaria</td></tr><tr><td>MEBM</td><td>Lonza</td><td>CC-3151</td><td>Epiteliale mammario basale medio</td></tr><tr><td>MEGM SingleQuot Kit</td><td>Lonza</td><td>CC-4136</td><td>Suppliments & Reagente per fattori di</td></tr><tr><td>crescitaPack</td><td>Lonza</td><td>CC-5034</td><td>Reagente per sottocoltura</td></tr><tr><td>D-PBS (10X)</td><td>Sigma</td><td>D1408</td><td>Lavaggio delle cellule in piastre di coltura</td></tr><tr><td>Acqua distillata ultrapura</td><td>Invitrogen</td><td>10977</td><td>Diluire 10X D-PBS</td></tr><tr><td>Piastra per colture tissutali (35 mm)</td><td>BD/Falcon</td><td>353001</td><td>Piastra per colture cellulari adatta a LumiCycle</td></tr><tr><td>Grasso siliconico</td><td>Fisher</td><td>NC9044707</td><td>Per sigillare la piastra con il mezzo di registrazione</td></tr><tr><td>Vetro di copertura rotondo</td><td>Harvard Bioscience</td><td>64-1500 (CS-40R)</td><td>Per sigillare la piastra con il mezzo di registrazione</td></tr><tr><td>Tossina del colera</td><td>Sigma</td><td>C8052</td><td>Integratore per il terreno di crescita</td></tr><tr><td>G418 solfato (geniticina)</td><td>Invitrogen</td><td>10131035</td><td>Antibiotico per la selezione di cellule trasfettate stabili</td></tr><tr><td>Ampicillina</td><td>Sigma</td><td>A9393</td><td>Per la selezione delle colonie</td></tr><tr><td>Forskolin</td><td>Sigma</td><td>F6886</td><td>Agente di sincronizzazione</td></tr><tr><td>Melatonina</td><td>Sigma</td><td>M5250</td><td>Agente di sincronizzazione</td></tr><tr><td>Desametasone</td><td>Sigma</td><td>D4902</td><td>Agente di sincronizzazione</td></tr><tr><td>Siero di cavallo</td><td>Sigma</td><td>H1138</td><td>Agente di sincronizzazione</td></tr><tr><td>d-Luciferina, sale sodico</td><td>Invitrogen</td><td>L2912</td><td>Substrato della luciferasi</td></tr><tr><td>IC261</td><td>Sigma</td><td>10658</td><td>Controllo positivo per l'interferente circadiano</td></tr><tr><td>Metilnitrosourea (NMU)</td><td>Sigma</td><td>N1517</td><td>Cancerogeno specifico per la mammella</td></tr><tr><td>Metilselenocisteina (MSC)</td><td>Sigma</td><td>M6680</td><td>Selenio organico (agente chemiopreventivo)</td></tr><tr><td>EX527</td><td>Inibitore specifico Sigma</td><td>E7034</td><td>SIRT1</td></tr><tr><td>Cambinol</td><td>Sigma</td><td>C0494</td><td>SIRT1 & Inibitore SIRT2</td></tr><tr><td>Spettrofotometro NanoDrop</td><td>Thermo Scientific</td><td>NanoDrop 8000</td><td>Quantificare il nucleotide</td></tr><tr><td>GeneAmp PCR System 9700</td><td>Applied Biosystems</td><td>N805-0200</td><td>Per esperimenti di biologia molecolare</td></tr><tr><td>Incubatore CO2</td><td>NAPCO</td><td>Serie 8000 DH</td><td>Per colture cellulari al 5% di CO2 a 37 gradi ... C</td></tr><tr><td>Centrifuga da tavolo con refrezzatore</td><td>Eppendorf</td><td>5430R</td><td>Per esperimenti di biologia molecolare</td></tr><tr><td>Centrifuga con secchio oscillante</td><td>Eppendorf</td><td>5810 R</td><td>Per colture cellulari</td></tr><tr><td>Microscopio invertito</td><td>Nikon</td><td>80124</td><td>Contrasto di fase opzionale</td></tr><tr><td>Cappa per coltura tissutale</td><td>Labconco</td><td>Classe II A2</td><td>Certificato BSL-2</td></tr><tr><td>LumiCycle 32</td><td>Actimetria</td><td>Non Disponibile</td><td>Rivelatore di luminoscenza</td></tr></tbody></table>

in vitro dosaggio di bioluminescenza per caratterizzare il ritmo circadiano in cellule epiteliali mammarie

In Vitro Bioluminescence Assay to Characterize Circadian Rhythm in Mammary Epithelial Cells

Il ritmo circadiano è un processo fisiologico fondamentale presente in tutti gli organismi che regola i processi biologici che vanno dall'espressione genica di dormire comportamento. Nei vertebrati, ritmo circadiano è controllato da un oscillatore molecolare che funziona sia nel nucleo soprachiasmatico (SCN; centrale dello stimolatore cardiaco) e singole celle che comprende tessuti più periferici. Più importante, la rottura del ritmo circadiano di esposizione alla luce di notte, fattori di stress ambientale e/o sostanze tossiche è associata a un aumentato rischio di malattie croniche e l'invecchiamento. La capacità di identificare gli agenti che possono interferire con orologi biologici centrali e/o periferici e gli agenti che possono impedire o attenuare gli effetti della perturbazione circadiana, ha implicazioni significative per la prevenzione delle malattie croniche. Anche se i modelli del roditore possono essere utilizzati per identificare le esposizioni e gli agenti che inducono o prevenire/ridurre la rottura circadiana, questi esperimenti richiedono un numero elevato di animali. In vivo gli studi inoltre richiedono infrastrutture e risorse significative e i ricercatori a lavorare tutta la notte. Così, c'è un urgente bisogno di un sistema appropriato in vitro di cellula-tipo di schermo per ambientali interferenti circadiani e rinforzatori in tipi cellulari da diversi organi e Stati di malattia. Abbiamo costruito un vettore che guida la trascrizione della luciferasi destabilizzato in cellule eucariotiche, sotto il controllo del promotore del gene umano di periodo 2 . Questa costruzione del reporter circadiano era trasfettata stabilmente in cellule epiteliali mammarie umane e cellule circadiano reattivo reporter sono state selezionate per sviluppare il saggio in vitro bioluminescenza. Qui, presentiamo un protocollo dettagliato per stabilire e convalidare il dosaggio. Forniamo ulteriori dettagli per prova degli esperimenti di concetto che dimostra la capacità della nostra analisi in vitro di ricapitolare gli effetti in vivo di vari prodotti chimici sul cellulare orologio biologico. I risultati indicano che il dosaggio può essere adattato ad una varietà di tipi cellulari per lo screening sia ambientali interferenti e chemopreventive esaltatori di orologi circadiani.

Vettore reporter circadiano bioluminescenza: espressione umana di promotore-guidato da PER2 della variante destabilizzato luciferasi
La sequenza di DNA che comprende un frammento di bp 941 derivato dal promotore PER2 umano utilizzato per costruire il vettore reporter circadiano, pGL [hPer2P/Luc2P/Neo, in primo luogo è stato analizzato per la presenza di elementi regolatori conosciuta per regolare...

Un'analisi di bioluminescenza in vitro per determinare il ritmo circadiano cellulare in cellule epiteliali mammarie è presentata. Questo metodo utilizza plasmidi di reporter di cellule di mammifero che esprimono destabilizzato luciferasi sotto il controllo del promotore del gene di periodo 2 . Può essere adattato ad altri tipi di cella per valutare gli effetti di organo-specific il ritmo circadiano.

In Vitro Dosaggio di bioluminescenza per caratterizzare il ritmo circadiano in cellule epiteliali mammarie

The circadian rhythm is a fundamental physiological process present in all organisms that regulates biological processes ranging from gene expression to ...

L'obiettivo generale di questo saggio bioluminescenza in vitro è determinare gli effetti di diversi fattori ambientali che alterano o potenziano il ritmo circadiano cellulare nei neuroni epiteliali mammari derivati da ghiandole mammarie in condizioni normali o patologiche. Questo metodo può contribuire a rispondere a domande fondamentali nel campo della salute ambientale, come ad esempio se fattori ambientali, inclusi composti chimici, influenzino il ritmo circadiano cellulare. Pertanto, il principale vantaggio di questo saggio è che può essere facilmente adattato a diversi tipi cellulari, consentendo lo screening di modulatori ambientali degli orologi circadiani in organi diversi.Insieme a me per dimostrare la procedura c'è Brian Estrella, uno studente laureato del nostro laboratorio. Il frammento del promotore umano PER2 viene ottenuto da un vettore personalizzato che contiene il PER2P umano nel sito compreso tra SecI e HindIII nella regione di clonaggio multipla. Per tagliare il frammento del PER2P umano dal vettore, mescolare quanto segue in una provetta microcentrifuga priva di DNA/RNA e nucleotidi: 2,5 microlitri di tampone per enzimi di restrizione, 10 microlitri di vettore, un microlitro di enzima di restrizione SacI, un microlitro di enzima di restrizione HindIII e acqua ultrapura fino a un volume totale di 25 microlitri.Incubare in un blocco riscaldante a 37 gradi Celsius per 90 minuti. Al termine della digestione con enzimi di restrizione, caricare l'intero volume della reazione su un gel di agarosio allo 0,7% contenente bromuro di etidio allo 0,001% per separare il PER2P umano dal vettore. Tagliare un frammento di gel di agarosio contenente una banda fluorescente a 941 paia di basi, purificare i frammenti di PER2P umano dal gel e quantificare il DNA come descritto nel protocollo testuale.Il passaggio successivo consiste nel clonare il gene umano PER2P in un vettore contenente la luciferasi destabilizzata di firefly. Linearizzare un microgrammo del vettore mediante digestione di restrizione con SacI e HindIII come mostrato in precedenza. Eseguire l'intero volume della reazione su un gel contenente bromuro di etidio, quindi purificare e quantificare il DNA del vettore come in precedenza.Per legare il PER2P umano nel vettore linearizzato, mescolare delicatamente in una provetta da microcentrifuga: due microlitri di tampone di reazione della T4 DNA ligasi, 3,26 microlitri di PER2P umano, un microlitro di vettore linearizzato e acqua fino a un volume finale di 20 microlitri. Aggiungere quindi un microlitro di T4 DNA ligasi, mescolare delicatamente e incubare a 16 gradi Celsius in un termociclatore per tutta la notte. Il giorno successivo, raffreddare il vettore ligato sul ghiaccio.Prima della trasformazione, impostare un bagnomaria a 42 gradi Celsius, portare il mezzo SOC a temperatura ambiente e riscaldare le piastre di agar LB nell'incubatrice a 37 gradi Celsius. Scongelare due provette di cellule di E.coli competenti sul ghiaccio. Per iniziare la trasformazione, aggiungere sei microlitri del vettore ligato a un tubo di cellule di E.coli chimicamente competenti e capovolgere delicatamente il tubo per mescolare.Come controllo negativo, aggiungere un microlitro di vettore vuoto a un altro tubo di E.coli chimicamente competenti e incubare i tubi sul ghiaccio per 30 minuti. Dopo 30 minuti, eseguire uno shock termico nel bagno d'acqua a 42 gradi Celsius per 30 secondi senza agitare, quindi riporre nuovamente i tubi sul ghiaccio. Aggiungere 250 microlitri di mezzo SOC a ciascun tubo e incubare a 37 gradi Celsius con agitazione a 200 rpm per un'ora.Successivamente, distribuire uniformemente da 10 a 50 microlitri di ciascuna reazione di E.coli trasformato sulla superficie di una piastra di agar LB. Posizionare le piastre capovolte in un incubatore a 37 gradi Celsius per tutta la notte. Il giorno seguente, utilizzare un’ansa di inoculo sterilizzata per prelevare da tre a sei colonie bianche da ciascuna piastra e rilasciare ogni colonia in un tubo da coltura contenente quattro millilitri di terreno di coltura LB con 50 microgrammi per millilitro di ampicillina.Incubare le provette a 37 gradi Celsius con agitazione a 200 rpm per tutta la notte. Utilizzare due millilitri di ciascun volume di quattro millilitri di E.coli coltivati per l'estrazione del DNA. Dopo aver verificato l'inserzione come descritto nel protocollo testuale, amplificare l'E.coli selezionato aggiungendo i due millilitri rimanenti di E.coli coltivati in 200 millilitri di mezzo di coltura LB contenente 50 microgrammi per millilitro di ampicillina e incubare a 37 gradi Celsius con agitazione a 200 rpm per tutta la notte.Il DNA plasmidico viene quindi estratto utilizzando un kit endotossina-free per plasmidi Maxiprep seguendo le istruzioni del produttore. Dopo aver quantificato il DNA plasmidico, aliquotarlo e conservarlo a meno 80 gradi Celsius per utilizzi futuri. Le cellule epiteliali mammarie da trasfettare con il vettore circolario costruito vengono coltivate in un mezzo di crescita per cellule epiteliali mammarie contenente mezzo basale per epitelio mammario, integratori per la crescita e tossina colerica.Per dissociare le cellule, incubare con 10 millilitri di tripsina-EDTA per circa 20 minuti, quindi neutralizzare la tripsina aggiungendo 10 millilitri di soluzione neutralizzante per la tripsina. Trasferire le cellule in un tubo da centrifuga da 50 millilitri. Sciacquare la piastra con 10 millilitri di soluzione salina tamponata e aggiungere il risciacquo al tubo da 50 millilitri.Centrifugare le cellule a 1.500 giri al minuto per 10 minuti. Rimuovere il soprannatante e aggiungere tre millilitri di MEGM per risospendere le cellule. Contare le cellule utilizzando un emocitometro sotto un microscopio invertito.Dopo aver calcolato la concentrazione della sospensione cellulare singola, seminare due volte 10 alla quinta cellule in modo uniforme per ogni piastra da coltura di 35 millimetri con MEGM. Agitare delicatamente le piastre in modo completo per ottenere una distribuzione uniforme delle cellule in ciascuna piastra. Colture le cellule nell'incubatrice per cellule fino a raggiungere una confluenza del 20-30%.Il giorno successivo, riscaldare il mezzo con siero ridotto in un bagnomaria a 37 gradi Celsius e il reagente di trasfezione a temperatura ambiente per 30 minuti. Portare il DNA plasmidico a temperatura ambiente. Diluire il DNA plasmidico a 30 nanogrammi per microlitro con buffer Tris-EDTA privo di endotossine e mantenere a temperatura ambiente.Preparare ogni miscela di trasfezione plasmidica in un tubo microcentrifugo da 1,5 millilitri. Aggiungere prima 63,6 µL di mezzo con siero ridotto tiepido. Successivamente, aggiungere 33,4 µL di DNA plasmidico e mescolare delicatamente mediante pipettatura.Infine, aggiungere tre microlitri di reagente di trasfezione direttamente al centro del tubo senza toccare la parete. Mescolare delicatamente mediante pipettaggio e mantenere a temperatura ambiente per 30 minuti. Aggiungere l'intera miscela di trasfezione plasmidica direttamente sulla superficie centrale del mezzo nel piatto e mescolare delicatamente agitando la piastra.Coltivare le cellule in un incubatore a biossido di carbonio per ulteriori 48-72 ore. Da 48 a 72 ore dopo la trasfezione, quando le cellule coltivate raggiungono una confluenza di circa il 70%, sostituire il mezzo con MEBM privo di fattori di crescita e coltivare le cellule per ulteriori 24 ore. Dopo 24 ore di privazione, aggiungere un agente di sincronizzazione in MEBM alle cellule.Il 50% di siero equino viene utilizzato come agente di sincronizzazione in questo esperimento. Incubare per 1 ora e 1/2 in un incubatore a biossido di carbonio. Preparare il mezzo di registrazione.Al termine del trattamento con l'agente di sincronizzazione, lavare le cellule tre volte con D-PBS caldo. Quindi aggiungere due millilitri di mezzo di registrazione appena preparato contenente luciferina. Sigillare la piastra con un vetrino sterilizzato utilizzando della vaselina siliconica per prevenire l'evaporazione.Etichettare la piastra sul lato. Posizionare la piastra sigillata nel supporto all'interno del luminometro ed eseguire la raccolta e l'analisi dei dati come descritto nel protocollo testuale. In questo modello in vitro, le cellule transfezionate transitoriamente non trattate hanno mostrato almeno due cicli completi di segnalazione luminiscente dopo la sincronizzazione.Le cellule esposte al mutageno NMU hanno mostrato un ritmo circadiano alterato alla concentrazione di 0,5 millimolare, come indicato dalla perdita del segnale di luminescenza dopo la sincronizzazione. L'inibizione dell'attività di Cert1 con X257 o Cambinol ha in modo simile alterato il ritmo circadiano attenuando il ciclo circadiano successivo. In modo importante, l'aggiunta di MSC chemopreventivo al mezzo di coltura ha ripristinato il ritmo alterato da NMU 0,5 millimolare e ha prevenuto gli effetti disturbanti degli inibitori di Cert1.In cellule strettamente trasfettate, sia gli inibitori di NMU che quelli di Cert1 hanno interrotto il ritmo circadiano. L'MSC ha ripristinato i ritmi circadiani in cellule pretrattate con NMU, X275 o Cambinol. L'intensità della bioluminescenza era maggiore, ma il ritmo è durato per un periodo più breve nelle cellule transitoriamente trasfettate rispetto a quelle strettamente trasfettate, tuttavia i risultati complessivi sono coerenti.Il ritmo circadiano cellulare può essere quantificato in parametri circadiani come il periodo e la fase utilizzando il software di analisi LumiCycle. Una volta padroneggiata, questa tecnica è semplice, rapida e sicura. Durante l'esecuzione di questa procedura, è importante verificare se le cellule si stanno proliferando, poiché l'efficienza di trasfezione è molto bassa in cellule non dividenti, come le cellule neuronali, nel qual caso si potrebbe prendere in considerazione un metodo di trasfezione mediato da virus.Dopo la trasfezione, possono essere eseguiti altri metodi come il trattamento con diversi composti chimici o la modifica genetica per rispondere ad ulteriori domande, ad esempio in che modo il ritmo circadiano cellulare è influenzato da fattori ambientali e genetici. Questo saggio può essere utilizzato per indagare l'impatto di un ritmo circadiano alterato sulla funzione cellulare. Studiando i meccanismi sottostanti, possiamo sviluppare strategie di intervento più efficaci per le persone a maggior rischio di cancro al seno a causa di orari di lavoro anomali.Dopo aver visto questo video, dovresti avere una buona comprensione di come stabilire e validare il saggio di bioluminescenza in vitro per determinare il ritmo circadiano nelle cellule di interesse. Non dimenticare che lavorare con un illuminatore a UV può essere estremamente pericoloso e che precauzioni, come l'uso di una protezione facciale anti-UV, devono essere sempre adottate durante l'esecuzione di questa procedura. Grazie per aver guardato e buona fortuna con i tuoi esperimenti.

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