Un'analisi di inibizione (HI) ottimizzato emagglutinazione per quantificare i titoli dell'anticorpo specifico dell'Influenza
1 dicembre 2017
I protocolli presentati viene descritto come eseguire un'analisi di inibizione di emagglutinazione per quantificare i titoli dell'anticorpo specifico dell'influenza da campioni di siero dei destinatari del vaccino di riossidazione. Il primo test determina concentrazioni di antigene virale ottimale di emagglutinazione. Il secondo test quantifica i titoli dell'anticorpo specifico dell'influenza di inibizione di emagglutinazione.
L'obiettivo generale di questo saggio di inibizione dell'emagglutinazione è misurare i titoli anticorpali contro virus specifici di interesse. Questo metodo può contribuire a rispondere a domande fondamentali nel campo della vaccinologia riguardo l'immunità e la protezione indotte dal vaccino in diverse popolazioni e in vari gruppi di età e pazienti. I principali vantaggi di questa tecnica sono la sua accuratezza e la possibilità di determinare rapidamente il titolo della presenza di anticorpi neutralizzanti.
Sebbene questo metodo possa fornire informazioni sui titoli anticorpali umani, può essere applicato anche ad altri sistemi, come i titoli anticorpali per sieri di topo o anche supernatanti di coltura. Iniziare etichettando le piastre microtitolatrici a 96 pozzetti con le informazioni sperimentali appropriate. Quindi ruotare la piastra in orientamento verticale e utilizzare una pipetta multicanale per aggiungere 25 microlitri di PBS in ogni pozzetto, tranne che nel primo pozzetto della fila inferiore della titolazione di retro.
Aggiungere 50 microlitri della soluzione di antigene appena preparata di interesse al primo pozzetto della riga della titolazione inversa, seguito dall'aggiunta di 25 microlitri di campioni di siero trattati con RDE ai primi pozzetti delle prime dieci righe. Aggiungere 25 microlitri dell'antisiero appropriato al primo pozzetto dell'11ª riga come controllo positivo. Successivamente trasferire 25 microlitri dal primo pozzetto di ciascuna riga ai rispettivi pozzetti successivi per eseguire diluizioni seriali a due tempi.
Pipettare su e giù da 10 a 15 volte per ogni passaggio di diluizione, scartando gli ultimi 25 microlitri dalle ultime pozzette. Successivamente, aggiungere 25 microlitri di soluzione antigene in ciascuna pozzetta delle righe da uno a undici e soltanto 25 microlitri di PBS in ciascuna pozzetta della riga per la titolazione inversa. Agitare delicatamente la piastra 10 volte su tutti e quattro i lati per mischiare.
Quindi coprire la piastra per 30 minuti a temperatura ambiente. Al termine dell'incubazione, aggiungere 50 microlitri di soluzione di globuli rossi in ogni pozzetto e mescolare la piastra con ulteriori colpetti. Quindi coprire nuovamente la piastra e incubare i globuli rossi in base alla specie utilizzata, come indicato nella tabella.
Dopo aver aggiunto i globuli rossi alla piastra, rispettare il tempo di incubazione appropriato per il tipo di sangue utilizzato nel saggio. Un'incubazione troppo breve o troppo lunga porterà a un'interpretazione errata dei risultati. Al termine dell'incubazione, valutare l'emagglutinazione inclinando la piastra di 90 gradi per 25 secondi e segnare i risultati per ogni pozzetto, mentre la piastra è ancora inclinata, su uno schema stampato della piastra a 96 pozzetti.
In questo esperimento, la risposta anticorpale indotta dal vaccino è stata valutata in 26 volontari sani che avevano ricevuto un vaccino antinfluenzale trivalente inattivato contenente i ceppi influenzali A/H1N1/California/2009, A/H3N2/Texas/2012 e B/Massachusetts/O2/2012 prima della stagione influenzale 2015. È stata osservata una risposta immunitaria cross-reattiva nei confronti dei ceppi virali A/H3N2/Switzerland/2013 e A/H3N2/Texas/2012, con titoli medi geometrici di inibizione dell'emagglutinazione significativamente più bassi e una sieroprotezione indotta minore contro l'influenza A/H3N2/Switzerland/2013 rispetto all'influenza A/H3N2/Texas/2012. Dopo la vaccinazione, i titoli anticorpali nei confronti di entrambi i ceppi sono aumentati, nonostante il ceppo A/H3N2/Switzerland/2013 non fosse presente nel vaccino.
L'emagglutinina virale dimostra un potenziale di emagglutinazione dei globuli rossi dipendente dalla specie. È interessante notare che il sangue di criceto dorato non emagglutina correttamente con l'influenza di tipo B, mentre il sangue di tacchino presenta un potenziale di emagglutinazione con titoli elevati e una bassa reattività crociata. Una volta acquisita padronanza, questa tecnica può essere completata in tre ore se eseguita correttamente.
Nel tentativo di eseguire questa procedura, è importante ricordare di trattare il siero con RDE per inattivare eventuali inibitori non specifici e il legame non specifico durante l'emagglutinazione del virus. Dopo questa procedura, possono essere eseguiti altri metodi, come l'ELISA, per rispondere ad ulteriori domande sul ruolo delle immunoglobuline specifiche per il patogeno. Dopo il suo sviluppo, questa tecnica ha aperto la strada ai ricercatori nel campo dell'immunologia virale, permettendo di approfondire la comprensione dell'immunità correlata ai vaccini in pazienti sani e immunosoppressi appartenenti a diverse fasce d'età.
Dopo aver visto questo video, dovresti avere una buona comprensione di come eseguire un saggio di inibizione dell'emagglutinazione per quantificare su larga scala i titoli anticorpali specifici per ceppi di influenza. Non dimenticare che lavorare con antigeni virali, sangue animale e campioni di siero umano può essere estremamente pericoloso e che precauzioni, come lavorare in un laboratorio BSL2, devono essere sempre adottate durante l'esecuzione di questa procedura.
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Panoramica
Questo articolo presenta protocolli per l'esecuzione di un saggio di inibizione dell'emagglutinazione per quantificare i titoli di anticorpi specifici per l'influenza da campioni di siero. Il metodo è fondamentale per comprendere l'immunità mediata dal vaccino in diverse popolazioni.
Componenti Chiave dello Studio
Ambito Scientifico
- Vaccinologia
- Immunologia
- Sierologia
Sfondo
- Il saggio di inibizione dell'emagglutinazione misura le risposte anticorpali contro l'influenza.
- Fornisce informazioni sull'efficacia del vaccino e sull'immunità della popolazione.
- Questo metodo può essere applicato a diversi tipi di campioni, inclusi sieri umani e di topo.
- Comprendere i titoli anticorpali è essenziale per valutare l'efficacia del vaccino.
Scopo dello studio
- Quantificare i titoli di anticorpi specifici per l'influenza nei soggetti vaccinati.
- Valutare la risposta immunitaria in diverse popolazioni demografiche.
- Fornire un metodo rapido e accurato per la determinazione dei titoli.
Metodi Utilizzati
- Etichettatura di piastre microtitolazione a 96 pozzetti con informazioni sperimentali.
- Utilizzo di una pipetta multicanale per aggiungere PBS nei pozzetti.
- Esecuzione dell'emagglutinazione per determinare le concentrazioni ottimali di antigene virale.
- Effettuazione dell'inibizione dell'emagglutinazione per quantificare i titoli anticorpali.
Risultati principali
- Il saggio quantifica con precisione i titoli anticorpali contro l'influenza.
- Dimostra la presenza di anticorpi neutralizzanti nei campioni di siero.
- I risultati possono orientare lo sviluppo di vaccini e le strategie di sanità pubblica.
- Il metodo è adattabile a diversi tipi di campioni e popolazioni.
Conclusioni
- Il saggio di inibizione dell'emagglutinazione è uno strumento affidabile per misurare le risposte immunitarie.
- Questa tecnica migliora la comprensione dell'immunità indotta dai vaccini.
- Applicazioni future potrebbero estendersi ad altre infezioni virali e popolazioni.
Domande Frequenti
Rilevanza Industriale del Contenuto
La quantificazione accurata dei titoli di anticorpi specifici per l'influenza è essenziale per valutare l'immunità indotta dal vaccino e guidare le valutazioni sull'immunogenicità nello sviluppo preclinico e clinico. Il saggio di inibizione dell'emagglutinazione (HI) fornisce un metodo standardizzato e rapido per misurare le risposte di anticorpi neutralizzanti in popolazioni diverse, supportando decisioni basate sui dati riguardo al proseguimento o meno dello sviluppo del vaccino. Permettendo l'analisi della reattività incrociata tra ceppi e l'ottimizzazione degli eritrociti specifici per specie, questo saggio aumenta la fiducia predittiva negli studi di immunologia traslazionale.
Applicazioni Strategiche nella Ricerca e Sviluppo in Biopharma
Scoperta Precoce e Validazione del Target
- Valore scientifico: Indaga le risposte immunitarie mediate dal vaccino quantificando i titoli anticorpali specifici per ceppo, supportando la riduzione meccanicistica dei rischi associati ai bersagli antigenici.
- Valore operativo: Permette la validazione funzionale dell'emagglutinina come antigene influenzale chiave attraverso l'inibizione dell'agglutinazione virale.
Sviluppo di screening e saggi
- Valore scientifico: Standardizza le concentrazioni di antigene mediante titolazione emagglutinante (HA), garantendo input riproducibili per lo screening successivo di inibizione dell'emagglutinazione (HI).
- Valore operativo: Consente lo screening ad alto rendimento di sieri mediante diluizioni seriali a due tempi in formato a 96 pozzetti, migliorando la scalabilità del saggio.
- Valore scientifico: Riduce al minimo le reazioni incrociate attraverso la selezione empirica di globuli rossi animali (ad esempio, di criceto, di tacchino), aumentando la specificità del saggio per il virus dell'influenza B e per ceppi eterologhi.
Ricerca Translazionale e Preclinica
- Valore scientifico: Misura la sieroprotezione indotta dal vaccino e i titoli medi geometrici (GMT) in coorti sane, fornendo biomarcatori traslazionali di immunogenicità.
- Valore operativo: Consente il confronto intersettoriale delle risposte immunitarie tra diversi gruppi di età e popolazioni di pazienti mediante cutoff standardizzati dei titoli.
- Valore scientifico: Rileva risposte immunitarie cross-reattive nei confronti di ceppi non contenuti nel vaccino (ad esempio, A/H3N2/Svizzera/2013), fornendo informazioni per la progettazione di vaccini a spettro ampio.
Integrazione di Pipeline e Flusso di Lavoro
Il saggio di inibizione dell'emagglutinazione si inserisce nel flusso di lavoro relativo all'immunogenicità, dalla fase iniziale di scoperta fino alla validazione preclinica, fornendo dati quantitativi sugli anticorpi che guidano la selezione dell'antigene, l'ottimizzazione dell'adjuvante e gli studi di determinazione del dosaggio.
- Biologia della scoperta: Supporta la verifica delle ipotesi sull'efficacia del vaccino misurando l'inibizione funzionale degli anticorpi dell'emagglutinazione.
- Screening: Fornisce risultati quantitativi riproducibili del titolo a partire da diluizioni seriali, consentendo una valutazione affidabile di composti o candidati vaccini.
- Analisi: Genera titoli finali e medie geometriche che permettono il confronto statistico delle risposte immunitarie tra diversi gruppi sperimentali.
- Ricerca traslazionale: Assicura continuità preclinica mediante la valutazione dell'immunogenicità in modelli animali (ad esempio, siero di topo) prima dei trial umani.
- Riutilizzo aziendale: Stabilisce una piattaforma standardizzata di sierologia applicabile a diverse ceppi influenzali e formati vaccinali.
Impatto Operativo ed Aziendale
- Valore scientifico: Fornisce una previsione affidabile dell'immunità indotta dal vaccino misurando i titoli di anticorpi neutralizzanti come parametro correlato alla protezione.
- Valore operativo: Garantisce la riproducibilità del saggio attraverso una preparazione standardizzata dell'antigene, l'uso di siero trattato con RDE e tempi di incubazione specifici per specie in merito agli eritrociti.
- Valore strategico: Migliora le decisioni di avanzamento o interruzione identificando precocemente un'immunogenicità insufficiente, riducendo i rischi biologici in fasi avanzate.
- Impatto sul portafoglio: Permette una priorizzazione dei candidati vaccinali basata sull'ampiezza del titolo cross-strain e sui tassi di sieroprotezione, adeguata al livello di rischio.
Considerazioni sull'implementazione
- Richiede competenze specifiche in virologia e sierologia per la manipolazione degli antigeni virali, la preparazione del siero trattato con RDE e l'interpretazione dei punti finali dell'emagglutinazione.
- È subordinato all'accesso a strutture conformi al livello di biosicurezza BSL2 per la manipolazione sicura dei virus influenzali e dei prodotti sanguigni umani o animali.
- Necessita della standardizzazione delle fonti di eritrociti (ad esempio, criceto, tacchino, gruppo sanguigno O umano) per ridurre al minimo le reazioni incrociate e garantire l'agglutinazione specifica per specie.
- Richiede un controllo preciso dei tempi durante l'incubazione degli eritrociti per evitare letture di emagglutinazione falsamente negative o falsamente positive.
- È limitato alla misurazione dell'attività funzionale degli anticorpi; non consente la quantificazione di classi di immunoglobuline non neutralizzanti o non funzionali senza l'ausilio di saggi complementari (ad esempio, ELISA).
