Un'analisi di inibizione (HI) ottimizzato emagglutinazione per quantificare i titoli dell'anticorpo specifico dell'Influenza

L'obiettivo generale di questo test di inibizione dell'emoagglutinazione è misurare i titoli anticorpali contro specifici virus di interesse. Questo metodo può aiutare a rispondere a domande chiave nel campo della vaccinologia sull'immunità e la protezione mediate dal vaccino all'interno di diverse popolazioni e in vari gruppi di età e pazienti. I principali vantaggi di questa tecnica sono che è accurata e che consente la determinazione rapida del titolo della presenza di anticorpi neutralizzanti.

Sebbene questo metodo possa fornire informazioni sui titoli anticorpali umani, può essere applicato anche ad altri sistemi, come i titoli anticorpali per il siero di topo, nonché i surnatanti di coltura. Iniziare etichettando le piastre per microtitolazione a 96 pozzetti con le informazioni sperimentali appropriate. Quindi ruotare la piastra con orientamento verticale e utilizzare una pipetta multicanale per aggiungere 25 microlitri di PBS a ogni pozzetto, ad eccezione del primo pozzetto della riga di titolazione posteriore inferiore.

Aggiungere 50 microlitri della soluzione antigenica di interesse appena preparata al primo pozzetto della riga di titolazione posteriore, seguito dall'aggiunta di 25 microlitri di campioni di siero trattati con RDE ai primi pozzetti delle prime dieci file. Aggiungere 25 microlitri dell'antisiero appropriato al primo pozzetto dell'11a fila come controllo positivo. Il trasferimento di 25 microlitri dal primo pozzetto di ogni fila ai pozzetti successivi per eseguire diluizioni seriali doppie.

Pipettare su e giù da 10 a 15 volte per ogni fase di diluizione, scartando gli ultimi 25 microlitri dagli ultimi pozzetti. Successivamente, aggiungere 25 microlitri della soluzione antigenica a ciascun pozzetto delle file da uno a 11 e 25 microlitri di PBS solo a ciascun pozzetto della riga di titolazione posteriore. Picchiettare attentamente il piatto 10 volte su tutti e quattro i lati per mescolare.

Quindi coprire il piatto per 30 minuti a temperatura ambiente. Al termine dell'incubazione, aggiungere 50 microlitri di soluzione di globuli rossi a ciascun pozzetto e mescolare la piastra con più picchiettamento. Quindi coprire nuovamente la piastra e incubare i globuli rossi secondo la specie utilizzata come indicato nella tabella.

Dopo aver aggiunto i globuli rossi alla piastra, rispettare il tempo di incubazione appropriato per il tipo di sangue utilizzato nel test. Un'incubazione troppo breve o troppo lunga porterà ad un'interpretazione errata dei risultati. Al termine dell'incubazione, valutare l'emoagglutinazione inclinando la piastra di 90 gradi per 25 secondi e segnare i risultati per ogni pozzetto, mentre la piastra è ancora inclinata, su uno schema stampato della piastra a 96 pozzetti.

In questo esperimento, la risposta anticorpale indotta dal vaccino è stata valutata in 26 volontari sani che hanno ricevuto un vaccino antinfluenzale trivalente inattivato contenente influenza A/H1N1/California/2009, A/H3N2/Texas/2012 e B/Massachusetts/O2/2012 prima della stagione influenzale del 24 2015. È stata osservata una risposta immunitaria cross-reattiva per i ceppi virali A/H3N2/Switzerland/2013 e A/H3N2/Texas/2012, con titoli di inibizione dell'emoagglutinazione media geometrica significativamente più bassi e sieroprotezione indotta contro l'influenza A/H3N2/Switzerland/2013 rispetto all'influenza A/H3N2/Texas/2012. Dopo la vaccinazione, i titoli anticorpali contro entrambi i ceppi sono aumentati, anche se il ceppo A/H3N2/Svizzera/2013 non era presente nel vaccino.

L'emoagglutinina virale dimostra un potenziale specie-dipendente per l'emoagglutinazione eritrocitaria. È interessante notare che il sangue di porcellino d'india non si emoagglutina correttamente con l'influenza B e il sangue di tacchino ha il potenziale per l'emoagglutinazione con titoli elevati e una bassa reattività crociata. Una volta padroneggiata, questa tecnica può essere completata nelle tre ore se eseguita correttamente.

Durante il tentativo di questa procedura è importante ricordare di siero con RDE per inattivare eventuali inibitori aspecifici e legami aspecifici durante l'emoagglutinazione del virus. Seguendo questa procedura, è possibile eseguire altri metodi come l'ELISA per rispondere a ulteriori domande sul ruolo delle immunoglobuline specifiche del singolo patogeno. Dopo il suo sviluppo, questa tecnica ha aperto la strada ai ricercatori nel campo dell'immunologia virale per approfondire la nostra comprensione dell'immunità correlata al vaccino in pazienti sani e immunodepressi all'interno di diversi gruppi di età.

Dopo aver visto questo video, dovresti avere una buona comprensione di come eseguire un test di inibizione dell'emoagglutinazione per quantificare i titoli anticorpali specifici del ceppo influenzale su larga scala. Non dimenticare che lavorare con antigeni virali, sangue animale e campioni di siero umano può essere estremamente pericoloso e che durante l'esecuzione di questa procedura è necessario prendere sempre precauzioni come lavorare in un laboratorio BSL2.