Un'analisi di inibizione (HI) ottimizzato emagglutinazione per quantificare i titoli dell'anticorpo specifico dell'Influenza
1 dicembre 2017
I protocolli presentati viene descritto come eseguire un'analisi di inibizione di emagglutinazione per quantificare i titoli dell'anticorpo specifico dell'influenza da campioni di siero dei destinatari del vaccino di riossidazione. Il primo test determina concentrazioni di antigene virale ottimale di emagglutinazione. Il secondo test quantifica i titoli dell'anticorpo specifico dell'influenza di inibizione di emagglutinazione.
L'obiettivo generale di questo test di inibizione dell'emoagglutinazione è misurare i titoli anticorpali contro specifici virus di interesse. Questo metodo può aiutare a rispondere a domande chiave nel campo della vaccinologia sull'immunità e la protezione mediate dal vaccino all'interno di diverse popolazioni e in vari gruppi di età e pazienti. I principali vantaggi di questa tecnica sono che è accurata e che consente la determinazione rapida del titolo della presenza di anticorpi neutralizzanti.
Sebbene questo metodo possa fornire informazioni sui titoli anticorpali umani, può essere applicato anche ad altri sistemi, come i titoli anticorpali per il siero di topo, nonché i surnatanti di coltura. Iniziare etichettando le piastre per microtitolazione a 96 pozzetti con le informazioni sperimentali appropriate. Quindi ruotare la piastra con orientamento verticale e utilizzare una pipetta multicanale per aggiungere 25 microlitri di PBS a ogni pozzetto, ad eccezione del primo pozzetto della riga di titolazione posteriore inferiore.
Aggiungere 50 microlitri della soluzione antigenica di interesse appena preparata al primo pozzetto della riga di titolazione posteriore, seguito dall'aggiunta di 25 microlitri di campioni di siero trattati con RDE ai primi pozzetti delle prime dieci file. Aggiungere 25 microlitri dell'antisiero appropriato al primo pozzetto dell'11a fila come controllo positivo. Il trasferimento di 25 microlitri dal primo pozzetto di ogni fila ai pozzetti successivi per eseguire diluizioni seriali doppie.
Pipettare su e giù da 10 a 15 volte per ogni fase di diluizione, scartando gli ultimi 25 microlitri dagli ultimi pozzetti. Successivamente, aggiungere 25 microlitri della soluzione antigenica a ciascun pozzetto delle file da uno a 11 e 25 microlitri di PBS solo a ciascun pozzetto della riga di titolazione posteriore. Picchiettare attentamente il piatto 10 volte su tutti e quattro i lati per mescolare.
Quindi coprire il piatto per 30 minuti a temperatura ambiente. Al termine dell'incubazione, aggiungere 50 microlitri di soluzione di globuli rossi a ciascun pozzetto e mescolare la piastra con più picchiettamento. Quindi coprire nuovamente la piastra e incubare i globuli rossi secondo la specie utilizzata come indicato nella tabella.
Dopo aver aggiunto i globuli rossi alla piastra, rispettare il tempo di incubazione appropriato per il tipo di sangue utilizzato nel test. Un'incubazione troppo breve o troppo lunga porterà ad un'interpretazione errata dei risultati. Al termine dell'incubazione, valutare l'emoagglutinazione inclinando la piastra di 90 gradi per 25 secondi e segnare i risultati per ogni pozzetto, mentre la piastra è ancora inclinata, su uno schema stampato della piastra a 96 pozzetti.
In questo esperimento, la risposta anticorpale indotta dal vaccino è stata valutata in 26 volontari sani che hanno ricevuto un vaccino antinfluenzale trivalente inattivato contenente influenza A/H1N1/California/2009, A/H3N2/Texas/2012 e B/Massachusetts/O2/2012 prima della stagione influenzale del 24 2015. È stata osservata una risposta immunitaria cross-reattiva per i ceppi virali A/H3N2/Switzerland/2013 e A/H3N2/Texas/2012, con titoli di inibizione dell'emoagglutinazione media geometrica significativamente più bassi e sieroprotezione indotta contro l'influenza A/H3N2/Switzerland/2013 rispetto all'influenza A/H3N2/Texas/2012. Dopo la vaccinazione, i titoli anticorpali contro entrambi i ceppi sono aumentati, anche se il ceppo A/H3N2/Svizzera/2013 non era presente nel vaccino.
L'emoagglutinina virale dimostra un potenziale specie-dipendente per l'emoagglutinazione eritrocitaria. È interessante notare che il sangue di porcellino d'india non si emoagglutina correttamente con l'influenza B e il sangue di tacchino ha il potenziale per l'emoagglutinazione con titoli elevati e una bassa reattività crociata. Una volta padroneggiata, questa tecnica può essere completata nelle tre ore se eseguita correttamente.
Durante il tentativo di questa procedura è importante ricordare di siero con RDE per inattivare eventuali inibitori aspecifici e legami aspecifici durante l'emoagglutinazione del virus. Seguendo questa procedura, è possibile eseguire altri metodi come l'ELISA per rispondere a ulteriori domande sul ruolo delle immunoglobuline specifiche del singolo patogeno. Dopo il suo sviluppo, questa tecnica ha aperto la strada ai ricercatori nel campo dell'immunologia virale per approfondire la nostra comprensione dell'immunità correlata al vaccino in pazienti sani e immunodepressi all'interno di diversi gruppi di età.
Dopo aver visto questo video, dovresti avere una buona comprensione di come eseguire un test di inibizione dell'emoagglutinazione per quantificare i titoli anticorpali specifici del ceppo influenzale su larga scala. Non dimenticare che lavorare con antigeni virali, sangue animale e campioni di siero umano può essere estremamente pericoloso e che durante l'esecuzione di questa procedura è necessario prendere sempre precauzioni come lavorare in un laboratorio BSL2.
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Panoramica
Questo articolo presenta protocolli per l'esecuzione di un saggio di inibizione dell'emagglutinazione per quantificare i titoli di anticorpi specifici per l'influenza da campioni di siero. Il metodo è fondamentale per comprendere l'immunità mediata dal vaccino in diverse popolazioni.
Componenti Chiave dello Studio
Ambito Scientifico
- Vaccinologia
- Immunologia
- Sierologia
Sfondo
- Il saggio di inibizione dell'emagglutinazione misura le risposte anticorpali contro l'influenza.
- Fornisce informazioni sull'efficacia del vaccino e sull'immunità della popolazione.
- Questo metodo può essere applicato a diversi tipi di campioni, inclusi sieri umani e di topo.
- Comprendere i titoli anticorpali è essenziale per valutare l'efficacia del vaccino.
Scopo dello studio
- Quantificare i titoli di anticorpi specifici per l'influenza nei soggetti vaccinati.
- Valutare la risposta immunitaria in diverse popolazioni demografiche.
- Fornire un metodo rapido e accurato per la determinazione dei titoli.
Metodi Utilizzati
- Etichettatura di piastre microtitolazione a 96 pozzetti con informazioni sperimentali.
- Utilizzo di una pipetta multicanale per aggiungere PBS nei pozzetti.
- Esecuzione dell'emagglutinazione per determinare le concentrazioni ottimali di antigene virale.
- Effettuazione dell'inibizione dell'emagglutinazione per quantificare i titoli anticorpali.
Risultati principali
- Il saggio quantifica con precisione i titoli anticorpali contro l'influenza.
- Dimostra la presenza di anticorpi neutralizzanti nei campioni di siero.
- I risultati possono orientare lo sviluppo di vaccini e le strategie di sanità pubblica.
- Il metodo è adattabile a diversi tipi di campioni e popolazioni.
Conclusioni
- Il saggio di inibizione dell'emagglutinazione è uno strumento affidabile per misurare le risposte immunitarie.
- Questa tecnica migliora la comprensione dell'immunità indotta dai vaccini.
- Applicazioni future potrebbero estendersi ad altre infezioni virali e popolazioni.
Domande Frequenti
Rilevanza Industriale del Contenuto
La quantificazione accurata dei titoli di anticorpi specifici per l'influenza è essenziale per valutare l'immunità indotta dal vaccino e guidare le valutazioni sull'immunogenicità nello sviluppo preclinico e clinico. Il saggio di inibizione dell'emagglutinazione (HI) fornisce un metodo standardizzato e rapido per misurare le risposte di anticorpi neutralizzanti in popolazioni diverse, supportando decisioni basate sui dati riguardo al proseguimento o meno dello sviluppo del vaccino. Permettendo l'analisi della reattività incrociata tra ceppi e l'ottimizzazione degli eritrociti specifici per specie, questo saggio aumenta la fiducia predittiva negli studi di immunologia traslazionale.
Applicazioni Strategiche nella Ricerca e Sviluppo in Biopharma
Scoperta Precoce e Validazione del Target
- Valore scientifico: Indaga le risposte immunitarie mediate dal vaccino quantificando i titoli anticorpali specifici per ceppo, supportando la riduzione meccanicistica dei rischi associati ai bersagli antigenici.
- Valore operativo: Permette la validazione funzionale dell'emagglutinina come antigene influenzale chiave attraverso l'inibizione dell'agglutinazione virale.
Sviluppo di screening e saggi
- Valore scientifico: Standardizza le concentrazioni di antigene mediante titolazione emagglutinante (HA), garantendo input riproducibili per lo screening successivo di inibizione dell'emagglutinazione (HI).
- Valore operativo: Consente lo screening ad alto rendimento di sieri mediante diluizioni seriali a due tempi in formato a 96 pozzetti, migliorando la scalabilità del saggio.
- Valore scientifico: Riduce al minimo le reazioni incrociate attraverso la selezione empirica di globuli rossi animali (ad esempio, di criceto, di tacchino), aumentando la specificità del saggio per il virus dell'influenza B e per ceppi eterologhi.
Ricerca Translazionale e Preclinica
- Valore scientifico: Misura la sieroprotezione indotta dal vaccino e i titoli medi geometrici (GMT) in coorti sane, fornendo biomarcatori traslazionali di immunogenicità.
- Valore operativo: Consente il confronto intersettoriale delle risposte immunitarie tra diversi gruppi di età e popolazioni di pazienti mediante cutoff standardizzati dei titoli.
- Valore scientifico: Rileva risposte immunitarie cross-reattive nei confronti di ceppi non contenuti nel vaccino (ad esempio, A/H3N2/Svizzera/2013), fornendo informazioni per la progettazione di vaccini a spettro ampio.
Integrazione di Pipeline e Flusso di Lavoro
Il saggio di inibizione dell'emagglutinazione si inserisce nel flusso di lavoro relativo all'immunogenicità, dalla fase iniziale di scoperta fino alla validazione preclinica, fornendo dati quantitativi sugli anticorpi che guidano la selezione dell'antigene, l'ottimizzazione dell'adjuvante e gli studi di determinazione del dosaggio.
- Biologia della scoperta: Supporta la verifica delle ipotesi sull'efficacia del vaccino misurando l'inibizione funzionale degli anticorpi dell'emagglutinazione.
- Screening: Fornisce risultati quantitativi riproducibili del titolo a partire da diluizioni seriali, consentendo una valutazione affidabile di composti o candidati vaccini.
- Analisi: Genera titoli finali e medie geometriche che permettono il confronto statistico delle risposte immunitarie tra diversi gruppi sperimentali.
- Ricerca traslazionale: Assicura continuità preclinica mediante la valutazione dell'immunogenicità in modelli animali (ad esempio, siero di topo) prima dei trial umani.
- Riutilizzo aziendale: Stabilisce una piattaforma standardizzata di sierologia applicabile a diverse ceppi influenzali e formati vaccinali.
Impatto Operativo ed Aziendale
- Valore scientifico: Fornisce una previsione affidabile dell'immunità indotta dal vaccino misurando i titoli di anticorpi neutralizzanti come parametro correlato alla protezione.
- Valore operativo: Garantisce la riproducibilità del saggio attraverso una preparazione standardizzata dell'antigene, l'uso di siero trattato con RDE e tempi di incubazione specifici per specie in merito agli eritrociti.
- Valore strategico: Migliora le decisioni di avanzamento o interruzione identificando precocemente un'immunogenicità insufficiente, riducendo i rischi biologici in fasi avanzate.
- Impatto sul portafoglio: Permette una priorizzazione dei candidati vaccinali basata sull'ampiezza del titolo cross-strain e sui tassi di sieroprotezione, adeguata al livello di rischio.
Considerazioni sull'implementazione
- Richiede competenze specifiche in virologia e sierologia per la manipolazione degli antigeni virali, la preparazione del siero trattato con RDE e l'interpretazione dei punti finali dell'emagglutinazione.
- È subordinato all'accesso a strutture conformi al livello di biosicurezza BSL2 per la manipolazione sicura dei virus influenzali e dei prodotti sanguigni umani o animali.
- Necessita della standardizzazione delle fonti di eritrociti (ad esempio, criceto, tacchino, gruppo sanguigno O umano) per ridurre al minimo le reazioni incrociate e garantire l'agglutinazione specifica per specie.
- Richiede un controllo preciso dei tempi durante l'incubazione degli eritrociti per evitare letture di emagglutinazione falsamente negative o falsamente positive.
- È limitato alla misurazione dell'attività funzionale degli anticorpi; non consente la quantificazione di classi di immunoglobuline non neutralizzanti o non funzionali senza l'ausilio di saggi complementari (ad esempio, ELISA).
