Arricchimento di aggregati proteici di detersivo-insolubili da cervello post mortem umano

L'obiettivo generale di questo protocollo di frazionamento è arricchire gli aggregati proteici insolubili nei detergenti a partire da tessuto cerebrale umano post-mortem. Questo metodo può quindi aiutare a rispondere a domande fondamentali nel campo della neurodegenerazione, come l'identificazione e la caratterizzazione degli aggregati proteici malripiegati nella patologia. Il principale vantaggio di questa tecnica consiste nell'arricchimento rapido e nell'isolamento degli aggregati proteici insolubili nei detergenti a partire dal tessuto cerebrale in un breve lasso di tempo.

La dimostrazione di questa procedura sarà effettuata da Tram Nguyen, un tecnico del mio laboratorio. Ottenere tessuto cerebrale post mortem congelato da soggetti sani e da casi di AD confermati patologicamente. Utilizzare pinze e una lametta per asportare porzioni di circa 250 milligrammi di sostanza grigia da ciascun campione di tessuto. Lasciare scongelare il segmento cerebrale per un minuto.

Ora, mentre si scongela, tagliare un pezzo di tessuto in cubetti di circa due millimetri. Trasferire in un tubo di omogeneizzazione Dounce da due millilitri preraffreddato e posto sul ghiaccio. Ricordare di evitare la sostanza bianca e qualsiasi vaso sanguigno di grandi dimensioni.

Lavorare rapidamente e posizionare il tessuto su barche di pesatura monouso TARE. Prestare attenzione a evitare che il tessuto si scongeli, riponendo frequentemente la barca di pesatura con il tessuto cerebrale in contenitori di polistirolo con ghiaccio secco. Dopo aver dissezionato e pesato tutti i pezzi di tessuto necessari, rimuovere una barca di pesatura contenente un pezzo di tessuto dal ghiaccio secco.

Successivamente, aggiungere cinque millilitri di tampone a basso contenuto salino freddo di ghiaccio contenente un cocktail di inibitori della proteasi e della fosfatasi per ogni grammo di tessuto, quindi omogeneizzare sul ghiaccio eseguendo circa 10 passaggi con la pestella A ad alto spazio libero e 15 passaggi con la pestella B a basso spazio libero. Utilizzare quindi una pipetta Pasteur di vetro da nove pollici per trasferire ogni omogenato in un tubo in polipropilene da due millilitri precedentemente etichettato. Aliquotare l'omogenato rimanente in ulteriori tubi da 1,5 millilitri etichettati, in modo analogo, per la conservazione a meno 80 gradi Celsius. Per proseguire con la frazionatura, aggiungere 100 microlitri di cloruro di sodio cinque molar e 100 microlitri di sarkosil al 10 percento a ciascun'aliquota da 0,8 millilitri.

Mescolare bene capovolgendo il tubo. Quindi incubare sul ghiaccio per 15 minuti. Al termine dell'incubazione, utilizzare un sonicator dotato di sonda microtip per erogare tre impulsi di cinque secondi ciascuno a un'ampiezza del 30 percento.

Dopo aver determinato le concentrazioni proteiche degli omogenati mediante il metodo dell'acido bicinconinico, aggiungere a ciascun campione il buffer sark freddo con inibitori della proteasi e della fosfatasi fino a una concentrazione finale di 10 milligrammi per millilitro. Trasferire quindi 500 microlitri di ciascun campione in provette ultracentrifughe in policarbonato da 500 microlitri. Posizionare le provette in un rotore preraffreddato e sottoporle a ultracentrifugazione a 180.000 ×g per 30 minuti a quattro gradi Celsius.

Dopo la centrifugazione, trasferire i soprannatanti solubili in sarkosil S1 in provette da 1,5 millilitri e conservare a meno 80 gradi Celsius. Aggiungere 200 microlitri di sark buffer alle provette dell'ultracentrifuga contenenti le frazioni P1 insolubili nel detergente ed utilizzare la punta della pipetta per staccare i pellet dal fondo delle provette. Successivamente, trasferire i pellet P1 risospesi in nuove provette per ultracentrifuga da 500 microlitri, bilanciarle a coppie e centrifugare a 180.000 volte g per ulteriori 30 minuti a quattro gradi Celsius.

Scartare il sopranatante S2. Quindi aggiungere da 50 a 75 microlitri di tampone ureico contenente una miscela di inibitori della proteasi e della fosfatasi ai pellet insolubili in sarkosyl e incubare per 30 minuti a temperatura ambiente per solubilizzare il pellet P2. Al termine dell'incubazione, trasferire i pellet P2 risospesi in provette da 0,5 millilitri opportunamente etichettate e solubilizzare completamente i pellet mediante una breve sonica con microsonda di un secondo al 20 percento di ampiezza.

Determinare le concentrazioni proteiche delle frazioni solubili e insolubili nel sarkosil utilizzando il metodo del saggio BCA. Preparare campioni da 40 microgrammi di omogenato totale, frazioni S1 solubile nel sarkosil e P2 insolubile nel sarkosil, in un buffer campione Laemmli SDS-PAGE 1x contenente TCEP 5 millimolare a pH 7. Incubare i campioni a 95 gradi Celsius per cinque minuti.

Caricare i campioni su gel SDS-PAGE Bis-Tris preformati da 10 pozzetti con gradiente dal 4 al 12 percento. Eseguire l'elettroforesi a 80 volt per il primo centimetro e a 120 volt per circa un'ora o fino a quando il colorante di corsa raggiunge il fondo del gel. Immergere le cassetta dei gel preformati in acqua distillata e quindi utilizzare una lametta nuova e un coltello per gel per aprirle.

Tagliare delicatamente le strisce e la parte inferiore di ogni gel con una nuova lametta da rasoio. Trasferirle su membrane di nitrocellulosa da 0,2 micron utilizzando un metodo di trasferimento a secco su un apparato per blotting. Dopo il trasferimento, bloccare le membrane nel buffer di blocco senza Tween-20 per 30 minuti, seguito dal buffer di blocco con il 0,5 percento di Tween-20 per altri 30 minuti.

Dopo il blocco, sciacquare le membrane in TBS con lo 0,1 percento di Tween-20 per cinque minuti per rimuovere l'eccesso di soluzione di blocco. Preparare diluizioni 1:1.000 degli anticorpi primari nella soluzione di blocco con lo 0,5 percento di Tween-20. In questo caso si utilizzano Phospho-Tau pT231 e EEA1.

Incubare le membrane nella soluzione di anticorpo primario durante la notte a quattro gradi Celsius con agitazione circolare. Il giorno successivo, risciacquare le membrane in TBS con lo 0,1 percento di Tween-20 tre volte per 15 minuti ciascuna. Saggiare le membrane con una diluizione 1:20.000 dell'anticorpo secondario fluorescente marcato con infrarosso e tampone bloccante con lo 0,5 percento di Tween-20 per 60 minuti a temperatura ambiente al buio su un agitatore.

Dopo l'incubazione, sciacquare la membrana tre volte per 10 minuti ciascuna in TBS con lo 0,1 percento di Tween-20 e due volte in TBS per cinque minuti ciascuna. Scansionare la membrana utilizzando un sistema di imaging a infrarossi alla lunghezza d'onda di eccitazione appropriata per l'anticorpo secondario utilizzato. Questa gel colorata con Coomassie mostra 20 mcg di proteina dalle frazioni TH-S, S1, S2 e P2.

L'analisi mediante Western blot dimostra chiaramente che nel cervello di pazienti con AD, l'aggregato patologico di Tau fosforilato ad alto peso molecolare è insolubile in sarkosil e solo una minima quantità di Tau fosforilato rimane nelle frazioni solubili in sarkosil. EEA1 è stato utilizzato come marcatore generale per la maggior parte delle proteine native non patologiche, che sono naturalmente solubili in sarkosil e si distribuiscono nella frazione S1 sia nel cervello di controllo che in quello affetto da AD. È degno di nota che il segnale per EEA1 nella frazione solubile fosse leggermente inferiore rispetto a quello nella frazione TH-S, indicando che una piccola quota di EEA1 è probabilmente insolubile in sarkosil, ma al di sotto del limite di rilevazione mediante Western blot con questo particolare anticorpo.

Questa figura mostra l'analisi proteomica delle proteine patologiche dell'AD mediante un protocollo di frazionamento in un unico passaggio o multipasso. La tecnica di frazionamento in un unico passaggio può essere vantaggiosa per le proteine a bassa abbondanza, poiché le perdite complessive del campione sono notevolmente ridotte. Durante l'esecuzione di questa procedura, è importante ricordare di asportare la maggior quantità possibile di sostanza bianca dal tessuto cerebrale.

Dopo aver seguito questa procedura, altri metodi come la proteomica basata sulla spettrometria di massa possono essere eseguiti al fine di identificare e caratterizzare i componenti proteici principali degli aggregati patologici nelle loro malattie degenerative.