Name: Arricchimento di aggregati proteici di detersivo-insolubili da cervello post mortem umano (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-10-24T12:30:00.000+00:00
Duration: 9 min 35 s
Description: Impara un protocollo di frazionamento per arricchire aggregati proteici insolubili in detergente da tessuto cerebrale umano post morte. Questo metodo facilita la ricerca sulle malattie neurodegenerative.

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Gli autori ringraziano la d. ssa Jim Lah e Allan Levey, Emory dipartimento di neurologia, per suggerimenti e commenti utili. Questo lavoro è stato parzialmente finanziato dalla Partnership di medicina accelerando concessione (U01AG046161-02), la Emory Alzheimer malattia Research Center (P50AG025688) e un Istituto nazionale su invecchiamento concedere (R01AG053960-01) di N.T.S Questa ricerca è stata anche sostenuta in parte dal nucleo della neuropatologia della sovvenzione Emory neuroscienze NINDS Core strutture, P30NS055077.

etica istruzione: tutti i tessuti del cervello sono stati ottenuti da Emory Alzheimer &#39; s malattia Research Center (ADRC) Brain Bank. Tessuti umani post mortem sono stati acquisiti sotto protocolli appropriati Institutional Review Board (IRB).
 1. omogeneizzazione e frazionamento <ol><li>selezione del tessuto Nota: Frozen tessuto corteccia frontale post mortem da sani di controllo (Ctl) e patologico casi confermati di annuncio sono stati selezionati dalla Emory Banca di cervello ADRC (n = 2). Post mortem neuropathological valutazione della distribuzione della placca dell'amiloide è stato eseguito secondo il Consorzio di istituire un registro per Alzheimer &#39; s malattia semi-quantitativa segnando criteri 24, anche se patologia neurofibrillary di groviglio è stata valutata in conformità con il sistema di stadiazione di Braak. 16 <ol><li>ottenere congelato tessuto cerebrale post mortem da sani di controllo (Ctl) e patologico confermato casi di AD. Utilizzando contenitori di ghiaccio secco, pinze e una lama di rasoio, asportare ~ porzioni di 250 mg di materia grigia da ogni campione di tessuto su monouso tarato pesano barche, avendo cura di evitare che il tessuto dallo scongelamento. Registrare il peso di ciascun pezzo di omogeneizzati.</li>
		<li>Accise ~ 250 mg di sostanza grigia utilizzando forcipe e rasoio controllando visivamente per individuare l'interfaccia tra la materia grigia esterna e interna della materia bianca. Evitare di materia bianca e ancora più importante, qualsiasi grandi vasi sanguigni o regioni sanguinose, meningi o mater aracnoide. Mantenere il tessuto congelato durante il processo di taglio lavorando rapidamente e frequentemente posizionando barca pesatura con tessuto cerebrale in contenitori di polistirolo con ghiaccio secco</li>
		<li>Registra il peso esatto di materia grigia asportato da ogni pezzo congelato utilizzando una bilancia analitica. Calcolare il volume di tampone di basso contenuto di sale (LS) (Vedi tabella 1) necessaria per omogeneizzazione lisata (5 mL/g o 20% w/v).</li>
		<li>Preparare 10 mL LS tampone con 1x dell'inibitore di proteasi e fosfatasi cocktail e chill sul ghiaccio.</li>
		<li>Rimuovere tessuto pesato e pesatura barca da ghiaccio secco e dadi pezzetti di circa 2 x 2 mm come si scioglie. Trasferimento a una provetta da 2 mL pre-refrigerati lisata omogeneizzatore su Ice.</li>
		<li>Aggiungere 5 mL/g (20% w/v) del buffer ghiacciata basso contenuto di sale (LS) con 1 X cocktail di inibitore della proteasi e fosfatasi.</li>
		<li>Omogenizzazione del tessuto di cervello sul ghiaccio con circa 10 colpi di clearance elevata pestello A e 15 colpi di pestello bassa clearance B.</li>
		<li>Trasferire tutti omogeneato ad un tubo in polipropilene da 2 mL utilizzando un pipetta Pasteur di vetro. Etichettare la provetta con &#8220; TH &#8221; (Totale omogeneato), il tessuto caso numero e volume omogeneato. aliquota 0,8 mL in una provetta con etichetta 1,5 mL. Qualsiasi omogeneato in eccesso può essere similmente aliquotati e conservati a -80 ° C.</li>
		<li>Per ogni aliquota di mL 0,8, aggiungere 100 µ l di 5 M di NaCl e sarkosyl 10% (p/v) a concentrazioni di 0,5 M e 1% w/v, rispettivamente. Tubi di mescolare bene capovolgendo e incubare in ghiaccio per 15 min. Etichettare provette con &#34; TH-S &#34; (Totale omogeneato-Sarkosyl) per indicare che gli omogeneati sono nel sarkosyl-buffer (tabella 1).</li>
		<li>Sonicare ogni tubo per gli impulsi di tre 5 s a 30% ampiezza sul ghiaccio (intensità massima = 40%) utilizzando una sonda microtip.</li> <li>determinare le concentrazioni di proteina degli omogeneati usando l'acido bicinconinico (BCA) dosaggio 25 Metodo. 
		Nota: La concentrazione media di proteine degli omogeneati TH-S preparati alle LS da 5 mL per grammo di tessuto è 15-20 mg/mL. Gli omogeneati possono essere frazionati immediatamente o conservati a-80 ° C fino all'utilizzo.</li>
		<li>Omogeneati diluire TH-S a 10 mg/mL utilizzando ghiacciata sark buffer (tabella 1) con inibitori di proteasi e fosfatasi: 1x.</li>
		<li>Trasferire 5 mg proteina (0,5 mL) di ogni omogeneato TH-S in 500 µ l in policarbonato ultracentrifuga provette e coppia-equilibrio con buffer di sark. Caricare i tubi in un rotore pre-refrigerato e ultracentrifuga a 180.000 x g per 30 min a 4 surnatanti di trasferimento sarkosyl-solubile ° C. (S1) per provette da 1,5 mL e conservare a -80 ° C. 
		Nota: (Lavaggio facoltativo) aggiungere 200 µ l di sark-tampone per l'ultracentrifuga tubi contenenti le frazioni di detersivo-insolubili (P1) e sloggiare i pellet (P1) dalla parte inferiore dei tubi ultracentrifuga utilizzando una punta di pipetta 200 µ l.</li>
		Tubi di <li>brevemente impulso-spin invertito per 2-3 s (&#8804; 2.500 x g) in una microcentrifuga per trasferire il pellet (P1) e il buffer nelle provette da 1,5 mL qui sotto. Risospendere il pellet insolubile (P1) nel buffer di sark pipettando su e giù per assicurare il pellet è perturbato.</li>
		<li>Coppia-equilibrio e centrifugare a 180.000 x g per altri 30 min a 4 ° C.</li>
		<li>Scartare il surnatante di lavaggio opzionale (S2) e incubare i pellet sarkosyl-insolubile (P2) in 50-75 µ l di tampone di urea (tabella 1) con 1 x PIC (inibitore di proteasi e fosfatasi cocktail) per 30 min a temperatura ambiente per solubilizzare il pellet. 
		Nota: Buffer di urea calda a temperatura ambiente prima dell'uso per evitare la precipitazione di SDS. Per le applicazioni sensibili al detersivo, omettere SDS dal buffer di urea e considerare lavare il precipitato insolubile (P2) in basso tampone salino prima ematico nel buffer di urea.</li>
		<li>Trasferire il sedimento pellet (P2) in 0,5 mL provette e utilizzare breve (1 s) microtip sonicazione a 20% ampiezza (intensità massima = 40%) per solubilizzare completamente il pellet.</li>
		<li>Determinare le concentrazioni di proteina di sarkosyl-solubile (S1) e - metodo di analisi insolubile (P2) frazioni utilizzando la BCA. Utilizzare queste frazioni immediatamente o conservare a-80 ° C fino all'utilizzo.</li>
	</ol></li></ol> 2. Immunoblotting <ol><li>Western blotting Nota: macchiare occidentale è stato eseguito secondo le procedure precedentemente segnalate con lievi modifiche. 5 , 10 <ol><li>preparare 40 µ g campioni di totali omogeneati (TH-S), sark-solubile (S1) e le frazioni (P2) di sark insolubile nel buffer del campione di 1 X Laemmli SDS-page con pH compreso tra 5 mM TCEP 7. Incubare i campioni a 95 ° C per 5 min.</li>
		<li>Carico campione su una Bis-Tris 10 pozzetti prefabbricati 4-12% SDS-PAGE gel. Elettroforesi a 80 V per il primo centimetro (10 min) e 120 V per il resto (60 min) o fino a quando la tintura di rilevamento raggiunge il fondo del gel.</li>
		<li>Utilizzare una lama di rasoio fresco e gel coltello per Spalato-Apri il vassoio del gel prefabbricato. Tagliare delicatamente i pettini e il fondo del gel con una lama di rasoio fresco.</li>
		<li>Risospendere il pellet insolubile (P1) in 200 µ l di sark-tampone con 1 x PIC pipettando su e giù.</li>
		<li>Trasferimento ad una membrana di nitrocellulosa 0,2 µm utilizzando un metodo di trasferimento asciutto su una macchina macchiante (Vedi materiali tavolo).</li>
		<li>Bloccare la membrana in tampone bloccante (BB) senza Tween 20 per 30 min, seguita con BB con 0.05% Tween 20 (BB/T) per 30 min. Dopo il blocco, risciacquare la membrana in TBS/T (0.1% Tween 20) per 5 min rimuovere l'eccesso tampone bloccante.</li>
		<li>Preparare diluizioni di 1:1,000 della pT231 di anticorpi primari, Tau-2 (pan tau), AT8 ed EEA1 in BB/T (0.05% Tween 20).</li>
		<li>Incubare le membrane in soluzione di anticorpo primario durante la notte a 4 ° C con agitazione circolare. Lavare la membrana in TBS/T per un minimo di 3 x 15</li>
		<li>Sonda la membrana con una diluizione di 1: 20,000 di fluorescente-identificato vicino-IR anticorpo secondario in BB/T per 60 min a temperatura ambiente al buio su agitatore. Risciacquare la membrana per 3 x 10 min in TBS/T e 2 x 5 min in TBS.</li>
		<li>Scan la membrana utilizzando una porta a infrarossi imaging sistema alla lunghezza d'onda di eccitazione appropriato (ad es. 700 nm (canale rosso) per tintura infrarosso 680 capra anti-topo IgG (H + L) secondaria e 800 nm (canale verde) per tintura infrarosso 790 asino anti-rabbit IgG (H + L secondaria)).</li>
		<li>Utilizzare il software di imaging per quantificare l'intensità del segnale ed eseguire misurazioni densitometria secondo il produttore &#39; s istruzioni, assicurando auto-sfondo impostazione è impostata su media l'intero sfondo.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>

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</ol>

Gli autori non hanno nulla a rivelare.

Qui introduciamo e discutere un protocollo di detersivo-frazionamento passo singolo abbreviato che è applicabile a una vasta gamma di applicazioni sperimentali che vanno dall'analisi basati sulla spettrometria di massa proteomica funzionale proteina misfolding saggi e western blotting. 5 , 6 , 7 , 10 questa metodologia è forse più efficace quando usato per studiare proteinopathies neurodegenera...

Malattie neurodegenerative come il morbo di Alzheimer (annuncio), malattia di Parkinson (MDP), malattia di Huntington (HD), sclerosi laterale amiotrofica (ALS) e le malattie da prioni strettamente correlati sono proteinopathies caratterizzata dall'accumulo graduale di aggregati di detersivo-insolubili della proteina nel cervello con l'accompagnamento conoscitivo declino. 1 , 2 questa caratteristica patologica comune è pensata per svolgere un ruolo centrale nell'eziologia e patofisiologia di queste malattie neurodegenerative. 2 questi aggregati consistono tipicamente di fibre amiloidi polimeriche, che sono composti da unità di proteine misfolded espositrici Croce βripetute-struttura. 1 , 2 , 3 , 4 biochimicamente, aggregati amiloidi sono altamente resistenti alla denaturazione termica o chimica e solubilizzazione,3 che presenta sfide uniche per la loro purificazione, analisi e studiano tramite tecniche biochimiche tradizionali. 2 , 5 , 6 , 7 , 8 , 9 , 10 , 11 non sorprende, la frazione di detersivo-insolubili della proteina è stato al centro di molte ricerche nella patofisiologia delle malattie neurodegenerative che coinvolgono l'accumulo di proteine misfolded. 6 , 12 , 13 , 14
Tecniche di frazionamento biochimici sono stati utilizzati spesso per arricchire la frazione di detersivo-insolubili da omogenati di cervello post mortem. 6 , 12 , 13 , 14 uno dei metodi più comuni comporta l'estrazione sequenza degli omogeneati del tessuto con buffer e detergenti di crescente rigore, seguita da ultracentrifugazione di partizionare le frazioni solubili e insolubili. Un frazionamento sequenziale comunemente usato protocollo6,14 comporta l'omogeneizzazione di campioni di tessuto congelato in un buffer senza detersivo basso contenuto di sale (LS) e i pellet insolubili risultanti quindi vengono estratte in sequenza con buffer contenente sale alto, detergenti non ionici, alta saccarosio, detergenti ionici e infine chaotropes come urea. 6 , 14 un evidente svantaggio di tali protocolli di un frazionamento sequenziale è la notevole di tempo e l'impegno di lavoro necessario per completarle. Omogeneizzazione e ultracentrifugazione, un protocollo tipico cinque fasi frazionamento può richiedere diverse ore o anche giorni per completare. 4 , 6 , 7 , 10 , 15 , 16 , 17 , 18 inoltre, aggregati di proteine patologiche come molti rimangono insolubili in tutti, ma le più dure condizioni19,20 la maggior parte delle frazioni generate sono di scarso valore. Così, i passaggi di meno-rigorosi frazionamento che utilizzano alte concentrazioni saline e detergenti non ionici sono in gran parte ridondanti.
Gli studi precedenti hanno dimostrato che il detergente ionico N-lauril-sarcosina (sarkosyl) è un candidato eccellente per un protocollo semplificato passo singolo detergente frazionamento. 5 , 6 , 12 , 13 , 14 , 21 , 22 , 23 come un detergente denaturante, sarkosyl è sufficientemente rigorosi per solubilizzare la stragrande maggioranza delle proteine in modo nativo piegati nel cervello senza solubilizzanti aggregati di proteine misfolded composti di beta-amiloide (Aβ),6,11 tau fosforilata (pTau),6 TAR DNA-proteina 43 (TDP-43),14 alfa-synuclein,12,13 scrapie,23 o U1 piccole ribonucleoproteine nucleari (U1 snRNPs) come U1 - 70K. 5 , 21 , 22 Come sarkosyl è meno rigorose rispetto l'onnipresente anionici detergente sodio dodecil solfato (SDS), conserva meno robuste forme oligomeriche di aggregati di proteine misfolded che non possono sopportare un trattamento di SDS. 9
In precedenza, abbiamo descritto un protocollo di detersivo-frazionamento abbreviato che ha raggiunto risultati paragonabili alle metodologie di frazionamento sequenziale più laboriose. 5 omettendo i passaggi meno rigorosi di frazionamento, siamo stati in grado di sviluppare un protocollo facile passo singolo frazionamento per l'arricchimento di aggregati proteici di detersivo-insolubili da post mortem del cervello umano. 5 questo protocollo dettagliato qui descritto è adatto per una vasta gamma di applicazioni sperimentali che vanno da Western blotting e saggi basati sulla spettrometria di massa proteomica a funzionale misfolding e aggregazione semina. 5 , 6 , 21

<table><tbody><tr><td>Cocktail di proteasi e inibitori della fosfatasi, senza EDTA (100X)</td><td>Thermo Fisher</td><td>78441</td><td>cocktail di proteasi e inibitori della fosfatasi</td></tr><tr><td>Sistema di dismembratore sonico (ultrasuonatore)</td><td>Ultrasuoni a</td><td>micropunta</td><td>Fisher Scientific FB505110</td></tr><tr><td>Optimax TLX Ultracentrifuga</td><td>Beckman Coulter</td><td>361545</td> rotore <td>refrigerato</td></tr><tr><td>TLA120.1</td><td>Rotore per ultracentrifuga</td> <td>Beckman Coulter</td><td>362224</td></tr><tr><td>500 ul (8 x 34 mm) Provette in policarbonato, parete spessa</td><td>Provette per ultracentrifuga Beckman Coulter</td><td>343776</td><td>per rotore TLA120.1</td></tr><tr><td>4X SDS tampone per campioni</td> N/A SDS <td>fatto in casa</td> Soluzione TCEP <td>SDS-PAGE</td><td></td></tr><tr><td>, pH neutro</td><td>Thermo Fisher</td><td>77720</td> tampone bloccante agente <td>riducente</td></tr> <tr><td>(TBS)</td><td>Thermo Fisher</td><td>37542</td><td>tampone di</td></tr> <tr><td>blocco (TBS) tampone di blocco + 0,05% Tween 20</td><td>Thermo Fisher</td><td>37543</td><td>tampone di blocco e diluente anticorpale</td></tr><tr><td>4-12% Bolt Bis-Tris Plus gel, 10 pozzetti</td><td>Thermo Fisher</td><td>NW04120BOX</td><td>gel prefabbricati SDS-PAGE</td></tr><tr><td>MES Running Buffer (20X)</td><td>Thermo Fisher</td><td>B0002</td><td>SDS-PAGE buffer di corsa</td></tr><tr><td>N-Lauroylsarcosine sale sodico (sarkosyl)</td><td>Sigma Detergente Aldrich</td><td>L5777-50G</td><td></td></tr><tr><td>Anticorpo anti-Tau-2 (pan tau) Anticorpi</td><td>Chemicon</td><td>MAB375</td><td>Anticorpo</td></tr><tr><td>anti-fosfo-treonina 231 Tau Anticorpi</td><td>Millipore</td><td>MAB5450</td><td>Anticorpi</td></tr><tr><td>Anti-fosfo-sieroina 202 e treonina 205 Anticorpo Tau (AT8)</td><td>Thermo Fisher</td><td>MN1020</td><td>Anticorpi</td></tr><tr><td>Anti-antigene endosoma precoce 1 (EEA1) abcam</td><td></td><td>anticorpi ab2900</td><td></td></tr> Alexa <tr><td>Fluor 680 anticorpo secondario IgG (H+L) anticorpo di capra Thermo</td><td>Fisher</td><td>A21058</td><td>anticorpi</td></tr><tr><td>Alexa Fluor 790 asino anti-coniglio IgG (H+L) anticorpi</td><td>Thermo Fisher</td><td>A11374</td><td>anticorpi</td></tr><tr><td>iBlot2 Dry Blotting System</td><td>Thermo Fisher</td><td>IB21001</td><td>Gel transfer</td></tr><tr><td>iBlot2 Pile di trasferimento, nitrocellulosa, mini</td><td>Thermo Fisher</td><td>IB23002</td><td>Trasferimento di gel</td></tr></tbody></table>

arricchimento di aggregati proteici di detersivo-insolubili da cervello post mortem umano

Enrichment of Detergent-insoluble Protein Aggregates from Human Postmortem Brain

In questo studio, descriviamo un protocollo abbreviato passo singolo frazionamento per l'arricchimento di aggregati proteici di detersivo-insolubili dal cervello umano post mortem. Il detergente ionico N-lauril-sarcosina (sarkosyl) solubilizza efficacemente nativamente piegati proteine nel tessuto cerebrale permettendo l'arricchimento degli aggregati della proteina detersivo-insolubili da una vasta gamma di proteinopathies neurodegenerative, come Morbo di Alzheimer (annuncio), morbo di Parkinson e sclerosi laterale amiotrofica e malattie da prioni. Controllo umano e tessuti di cervello post mortem AD sono stati omogeneizzati e sedimentato di ultracentrifugazione in presenza di sarkosyl per arricchire di aggregati proteici di detersivo-insolubili tra cui tau fosforilata patologica, il componente principale di neurofibrillary grovigli in annuncio. Macchiarsi occidentale ha dimostrato la solubilità differenziale aggregati fosforilato-tau e la proteina detergente solubile, presto 1 antigene Endosome (EEA1) in controllo e cervello dell'annuncio. Analisi proteomica ha rivelato anche arricchimento di β-amiloide (Aβ), tau, snRNP70 (U1 - 70K) e l'apolipoproteina E (APOE) nelle frazioni sarkosyl-insolubile del cervello dell'annuncio rispetto a quelli di controllo, coerenza con le precedenti strategie di frazionamento del tessuto . Così, questo protocollo semplice arricchimento è ideale per una vasta gamma di applicazioni sperimentali che vanno da Western blotting e funzionale della proteina saggi co-aggregazione a basati sulla spettrometria di massa proteomica.

Il protocollo abbreviato passo singolo sarkosyl-frazionamento è stato utilizzato per arricchire di aggregati proteici di detersivo-insolubili da controllo e cervello post mortem dell'annuncio (Figura 1). Proteine da frazioni TH-S, S1, S2 e P2 sono stati risolti da SDS-PAGE, fissato per 15 min in Coomassie blu tampone fissativo seguita dalla macchiatura delicata con buffer colorante Coomassie Brilliant Blue G-250. Il passo di risospensione è facoltativo in qua...

Un protocollo di frazionamento abbreviato per l'arricchimento di aggregati proteici di detersivo-insolubili dal cervello umano post mortem è descritto.

Arricchimento di aggregati proteici di detersivo-insolubili da cervello post mortem umano

In this study, we describe an abbreviated single-step fractionation protocol for the enrichment of detergent-insoluble protein aggregates from human ...

L'obiettivo generale di questo protocollo di frazionamento è arricchire gli aggregati proteici insolubili nei detergenti a partire da tessuto cerebrale umano post-mortem. Questo metodo può quindi aiutare a rispondere a domande fondamentali nel campo della neurodegenerazione, come l'identificazione e la caratterizzazione degli aggregati proteici malripiegati nella patologia. Il principale vantaggio di questa tecnica consiste nell'arricchimento rapido e nell'isolamento degli aggregati proteici insolubili nei detergenti a partire dal tessuto cerebrale in un breve lasso di tempo.La dimostrazione di questa procedura sarà effettuata da Tram Nguyen, un tecnico del mio laboratorio. Ottenere tessuto cerebrale post mortem congelato da soggetti sani e da casi di AD confermati patologicamente. Utilizzare pinze e una lametta per asportare porzioni di circa 250 milligrammi di sostanza grigia da ciascun campione di tessuto. Lasciare scongelare il segmento cerebrale per un minuto.Ora, mentre si scongela, tagliare un pezzo di tessuto in cubetti di circa due millimetri. Trasferire in un tubo di omogeneizzazione Dounce da due millilitri preraffreddato e posto sul ghiaccio. Ricordare di evitare la sostanza bianca e qualsiasi vaso sanguigno di grandi dimensioni.Lavorare rapidamente e posizionare il tessuto su barche di pesatura monouso TARE. Prestare attenzione a evitare che il tessuto si scongeli, riponendo frequentemente la barca di pesatura con il tessuto cerebrale in contenitori di polistirolo con ghiaccio secco. Dopo aver dissezionato e pesato tutti i pezzi di tessuto necessari, rimuovere una barca di pesatura contenente un pezzo di tessuto dal ghiaccio secco.Successivamente, aggiungere cinque millilitri di tampone a basso contenuto salino freddo di ghiaccio contenente un cocktail di inibitori della proteasi e della fosfatasi per ogni grammo di tessuto, quindi omogeneizzare sul ghiaccio eseguendo circa 10 passaggi con la pestella A ad alto spazio libero e 15 passaggi con la pestella B a basso spazio libero. Utilizzare quindi una pipetta Pasteur di vetro da nove pollici per trasferire ogni omogenato in un tubo in polipropilene da due millilitri precedentemente etichettato. Aliquotare l'omogenato rimanente in ulteriori tubi da 1,5 millilitri etichettati, in modo analogo, per la conservazione a meno 80 gradi Celsius. Per proseguire con la frazionatura, aggiungere 100 microlitri di cloruro di sodio cinque molar e 100 microlitri di sarkosil al 10 percento a ciascun'aliquota da 0,8 millilitri.Mescolare bene capovolgendo il tubo. Quindi incubare sul ghiaccio per 15 minuti. Al termine dell'incubazione, utilizzare un sonicator dotato di sonda microtip per erogare tre impulsi di cinque secondi ciascuno a un'ampiezza del 30 percento.Dopo aver determinato le concentrazioni proteiche degli omogenati mediante il metodo dell'acido bicinconinico, aggiungere a ciascun campione il buffer sark freddo con inibitori della proteasi e della fosfatasi fino a una concentrazione finale di 10 milligrammi per millilitro. Trasferire quindi 500 microlitri di ciascun campione in provette ultracentrifughe in policarbonato da 500 microlitri. Posizionare le provette in un rotore preraffreddato e sottoporle a ultracentrifugazione a 180.000 ×g per 30 minuti a quattro gradi Celsius.Dopo la centrifugazione, trasferire i soprannatanti solubili in sarkosil S1 in provette da 1,5 millilitri e conservare a meno 80 gradi Celsius. Aggiungere 200 microlitri di sark buffer alle provette dell'ultracentrifuga contenenti le frazioni P1 insolubili nel detergente ed utilizzare la punta della pipetta per staccare i pellet dal fondo delle provette. Successivamente, trasferire i pellet P1 risospesi in nuove provette per ultracentrifuga da 500 microlitri, bilanciarle a coppie e centrifugare a 180.000 volte g per ulteriori 30 minuti a quattro gradi Celsius.Scartare il sopranatante S2. Quindi aggiungere da 50 a 75 microlitri di tampone ureico contenente una miscela di inibitori della proteasi e della fosfatasi ai pellet insolubili in sarkosyl e incubare per 30 minuti a temperatura ambiente per solubilizzare il pellet P2. Al termine dell'incubazione, trasferire i pellet P2 risospesi in provette da 0,5 millilitri opportunamente etichettate e solubilizzare completamente i pellet mediante una breve sonica con microsonda di un secondo al 20 percento di ampiezza.Determinare le concentrazioni proteiche delle frazioni solubili e insolubili nel sarkosil utilizzando il metodo del saggio BCA. Preparare campioni da 40 microgrammi di omogenato totale, frazioni S1 solubile nel sarkosil e P2 insolubile nel sarkosil, in un buffer campione Laemmli SDS-PAGE 1x contenente TCEP 5 millimolare a pH 7. Incubare i campioni a 95 gradi Celsius per cinque minuti.Caricare i campioni su gel SDS-PAGE Bis-Tris preformati da 10 pozzetti con gradiente dal 4 al 12 percento. Eseguire l'elettroforesi a 80 volt per il primo centimetro e a 120 volt per circa un'ora o fino a quando il colorante di corsa raggiunge il fondo del gel. Immergere le cassetta dei gel preformati in acqua distillata e quindi utilizzare una lametta nuova e un coltello per gel per aprirle.Tagliare delicatamente le strisce e la parte inferiore di ogni gel con una nuova lametta da rasoio. Trasferirle su membrane di nitrocellulosa da 0,2 micron utilizzando un metodo di trasferimento a secco su un apparato per blotting. Dopo il trasferimento, bloccare le membrane nel buffer di blocco senza Tween-20 per 30 minuti, seguito dal buffer di blocco con il 0,5 percento di Tween-20 per altri 30 minuti.Dopo il blocco, sciacquare le membrane in TBS con lo 0,1 percento di Tween-20 per cinque minuti per rimuovere l'eccesso di soluzione di blocco. Preparare diluizioni 1:1.000 degli anticorpi primari nella soluzione di blocco con lo 0,5 percento di Tween-20. In questo caso si utilizzano Phospho-Tau pT231 e EEA1.Incubare le membrane nella soluzione di anticorpo primario durante la notte a quattro gradi Celsius con agitazione circolare. Il giorno successivo, risciacquare le membrane in TBS con lo 0,1 percento di Tween-20 tre volte per 15 minuti ciascuna. Saggiare le membrane con una diluizione 1:20.000 dell'anticorpo secondario fluorescente marcato con infrarosso e tampone bloccante con lo 0,5 percento di Tween-20 per 60 minuti a temperatura ambiente al buio su un agitatore.Dopo l'incubazione, sciacquare la membrana tre volte per 10 minuti ciascuna in TBS con lo 0,1 percento di Tween-20 e due volte in TBS per cinque minuti ciascuna. Scansionare la membrana utilizzando un sistema di imaging a infrarossi alla lunghezza d'onda di eccitazione appropriata per l'anticorpo secondario utilizzato. Questa gel colorata con Coomassie mostra 20 mcg di proteina dalle frazioni TH-S, S1, S2 e P2.L'analisi mediante Western blot dimostra chiaramente che nel cervello di pazienti con AD, l'aggregato patologico di Tau fosforilato ad alto peso molecolare è insolubile in sarkosil e solo una minima quantità di Tau fosforilato rimane nelle frazioni solubili in sarkosil. EEA1 è stato utilizzato come marcatore generale per la maggior parte delle proteine native non patologiche, che sono naturalmente solubili in sarkosil e si distribuiscono nella frazione S1 sia nel cervello di controllo che in quello affetto da AD. È degno di nota che il segnale per EEA1 nella frazione solubile fosse leggermente inferiore rispetto a quello nella frazione TH-S, indicando che una piccola quota di EEA1 è probabilmente insolubile in sarkosil, ma al di sotto del limite di rilevazione mediante Western blot con questo particolare anticorpo.Questa figura mostra l'analisi proteomica delle proteine patologiche dell'AD mediante un protocollo di frazionamento in un unico passaggio o multipasso. La tecnica di frazionamento in un unico passaggio può essere vantaggiosa per le proteine a bassa abbondanza, poiché le perdite complessive del campione sono notevolmente ridotte. Durante l'esecuzione di questa procedura, è importante ricordare di asportare la maggior quantità possibile di sostanza bianca dal tessuto cerebrale.Dopo aver seguito questa procedura, altri metodi come la proteomica basata sulla spettrometria di massa possono essere eseguiti al fine di identificare e caratterizzare i componenti proteici principali degli aggregati patologici nelle loro malattie degenerative.

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