Valutazioni di neurobehavioral in un modello murino di ferita di cervello Hypoxic-ischemica neonatale

L'obiettivo generale della chirurgia delle cerebrolesioni neonatali ipossico-ischemichemica, seguita da test cognitivi e motori, è quello di avere un modello murino per studiare tali lesioni e il danno cerebrale correlato. Questo metodo può aiutare a rispondere a domande chiave sulla lesione cerebrale ipossico-ischemica neonatale, come ad esempio il modo in cui tali lesioni influenzano le funzioni motorie e cognitive. Il vantaggio principale di questa tecnica è che è ben nota ed è comunemente usata.

È anche un modello preclinico per la paralisi cerebrale infantile e l'ictus neonatale. In generale, gli individui che non conoscono questo metodo avranno difficoltà perché l'arteria carotide destra unilaterale è difficile da identificare. A dimostrare la procedura, insieme a me, sarà Yoon-Kyum Shin, uno studente laureato del nostro laboratorio.

Dopo aver anestetizzato almeno cinque cuccioli di topo P-seven, posizionare un cucciolo sotto un microscopio da dissezione con l'addome rivolto verso l'alto. Quindi, pulire il collo con alcool. Per iniziare l'intervento chirurgico, utilizzare le forbici per praticare un'incisione di 0,7 millimetri nel collo.

Quindi, rimuovere con cautela il tessuto adiposo, utilizzando una pinza, fino a quando l'arteria carotide destra unilaterale non è esposta. Successivamente, utilizzando una sutura 5-0, legare l'arteria carotide destra unilaterale. Ora, sutura l'incisione nel collo con nylon 5-0 e sterilizza l'incisione.

Quindi, lascia che il cucciolo si riprenda in una camera ipossica a 37 gradi Celsius con il coperchio aperto per circa un'ora. Posiziona un altro topo manipolato chirurgicamente nella camera ipossica per riprenderlo. Una volta che i cuccioli sono completamente svegli, chiudere il coperchio della camera e diminuire i livelli di gas per stabilire le condizioni di ipossia.

Dopo 90 minuti di ipossia, riporta i cuccioli cerebrolesi, nelle loro gabbie. Una settimana dopo, prepara i cuccioli per l'intervento chirurgico, come prima, per cercare prove della lesione. Praticare un'incisione nel cuoio capelluto per identificare la lesione cerebrale nell'area posterolaterale dell'emisfero destro.

Guarda attraverso il cranio semitrasparente per trovare prove di una lesione corticale e di una lesione ippocampale. Pertanto, classifica i cuccioli come controlli feriti o illesi. Dopo il controllo, chiudere il cuoio capelluto con la sutura e sterilizzare l'incisione.

Quando i topi hanno sei settimane, valutare la loro memoria in base all'apprendimento e all'evitamento di uno stimolo avversivo. Utilizzare un apparecchio di evitamento passivo a due scomparti commerciale per questo compito. Per iniziare, posiziona un mouse nello scomparto luminoso della scatola per 30 secondi.

Quindi, apri la porta tra gli scompartimenti e registra la latenza dell'animale per entrare nello scomparto buio. Attendere fino a 300 secondi per eseguire l'attività. Quando tutti e quattro gli arti del mouse sono completamente all'interno del compartimento buio, chiudi la porta.

Quindi, somministrare una scossa elettrica al piede da 1/2 milliampere per due secondi e rimettere il mouse nella sua gabbia. 24 ore dopo, ripetere il test. Questa volta, concedi al topo 300 secondi interi per muoversi nella camera buia e non scioccare il topo.

Eseguire il test della camminata su scala sui topi di sei settimane per discriminare tra lievi disturbi della funzione motoria, utilizzando analisi sia qualitative che quantitative. Innanzitutto, installa l'apparato a scala, quindi imposta una videocamera per registrare i movimenti degli arti di un topo sull'apparato. Quindi, posiziona il mouse sul pannello iniziale e inizia a effettuare una registrazione con la videocamera.

Assicurati che il video mostri le gambe ben a fuoco. Quando il mouse tocca l'ultimo pannello dell'apparato della scala, interrompere la registrazione. Quindi, riporta il mouse al pannello iniziale e registra nuovamente il mouse che attraversa l'apparato.

Fallo per un totale di quattro volte per mouse in ogni data di prova. Successivamente, durante l'analisi del video, conta manualmente il numero di scivolate effettuate da ciascun arto durante la riproduzione del video a velocità 1/10. Quando un arto scivola tra le sbarre, ciò costituisce uno scivolamento.

Quando i topi hanno sei settimane, valuta la loro forza di presa. Utilizzare un estensimetro push/pull, montato su un filo triangolare di due millimetri di diametro, il tutto fissato a un pannello. Posiziona il mouse sul pannello, tenendolo per la coda.

Quindi, consenti al mouse di raggiungere appena il filo metallico con gli arti anteriori. Non appena i topi afferrano il filo, tira delicatamente la coda finché non rilascia la presa. L'apparecchio registrerà la forza di picco sul filo in grammi.

Ripeti questo test cinque volte prima di far riposare il mouse. Durante il test della forza di presa, ci sono movimenti evidenti di prestazioni accurate. Cerca di trovare quei movimenti in cinque sforzi prima di far riposare il mouse, per almeno un minuto per ridurre l'affaticamento muscolare.

Dopo che il mouse si è riposato per almeno un minuto, ripeti nuovamente la serie di cinque prove. Quindi, fai riposare il mouse di nuovo ed esegui la serie un'ultima volta per quel giorno di test. Dai dati, utilizzare la media dei tre punteggi più grandi per gli arti anteriori o per entrambi gli arti anteriori per l'analisi.

Dopo aver prelevato il cervello di animali feriti da ipossia-ischemia di 14 settimane, i cervelli sono stati valutati morfologicamente come privi di lesioni corticali, lesioni lievi o gravi. Gli stessi animali sono stati scansionati da una risonanza magnetica una settimana prima, il che è stato anche molto rivelatore. Anche il cervello morfologicamente normale mostrava lievi lesioni nell'ippocampo.

A sei settimane di età, cinque settimane dopo l'infortunio, i topi sono stati valutati con vari compiti comportamentali. I topi con lesioni da ipossia-ischemia erano cognitivamente compromessi nel compito di evitamento passivo di 24 ore. Poiché solo l'emisfero destro era danneggiato, i topi mostravano funzioni motorie emiplegiche.

Ciò è stato rivelato dalla differenza nella percentuale di scivolamenti sui pioli trasversali della scala per ciascun arto anteriore. Inoltre, poiché la forza di presa coinvolge la corteccia motoria nel cervello, i gruppi con lesione normale e corticale hanno mostrato differenze nella potenza di presa. Non è stata osservata alcuna differenza tra i normali controlli e i topi categoricamente illesi, ma i topi feriti erano chiaramente compromessi.

Dopo aver visto questo video, dovresti avere una buona comprensione di come legare l'arteria carotide destra unilaterale per generare un topo ipossico-ischemico neonatale e di come eseguire l'analisi comportamentale di follow-up. È importante notare che anche quando non si osservano danni visibili sul cervello corticale sette giorni dopo la lesione, una risonanza magnetica può rivelare una lesione ippocampale. Inoltre, è importante ricordarsi di trattare i cuccioli con delicatezza e completare l'intervento il più rapidamente possibile.

I cuccioli hanno la pelle molto debole e sottile, quindi fai molta attenzione.