Citometria del flusso microfluidico di imaging mediante rilevazione asimmetrica Microscopia ottica di stretching (ATOM)
June 28th, 2017
Questo protocollo descrive l'implementazione di un sistema di microscopia ottica a tempo determinato di rilevamento asimmetrico per l'imaging a celle singole in flusso microfluidico ultravioletto e le sue applicazioni nella citometria a flusso di immagini.
L'obiettivo generale di questo protocollo è quello di preparare e utilizzare un sistema di microscopia ottica a tempo di rilevamento asimmetrico per l'imaging di singole cellule ad alto contrasto senza etichetta in un flusso microfluidico ultraveloce. Il vantaggio principale di ATOM è che consente l'acquisizione ultraveloce delle immagini con velocità di scansione lineare fino a decine di megahertz, migliorando al contempo il contrasto dell'immagine sulle celle non etichettate. ATOM consente un'analisi morfologica complessa delle strutture cellulari e subcellulari con saggi basati su cellule non centrate fino a 100.000 cellule al secondo, cosa che non è possibile con la citometria a flusso standard.
Per iniziare a configurare il sistema, utilizzare un collimatore in fibra per accoppiare un laser pulsato a banda larga femto o pico secondo vicino all'IR a una fibra ottica dispersiva monomodale collegata a un amplificatore ottico. Illuminare una classificazione di diffrazione di trasmissione con il laser per produrre una pioggia spettrale. Orientare la classificazione vicino alla configurazione del littrow per massimizzare l'efficienza di diffrazione.
Configura un gruppo di lenti a relè telescopiche in un sistema di imaging 4f per dirigere la pioggia spettrale sul piano focale posteriore di una lente dell'obiettivo sotto una piattaforma di campionamento. Assicurarsi che la doccia spettrale riempia l'apertura posteriore dell'obiettivo. Posizionare un'altra lente dell'obiettivo con uno specchio piano all'apertura posteriore sopra la piattaforma del campione.
Regolare le lenti dell'obiettivo finché i loro piani focali non si sovrappongono. Verificare che la pioggia spettrale superi il piano dell'immagine e segua lo stesso percorso fino alla gradazione. Posizionare un chip microfluidico sulla piattaforma del campione e assicurarsi che la pioggia spettrale cada attraverso il canale microfluidico.
Reindirizzare la luce di ritorno con un divisore di fascio dopo che è passata attraverso la classificazione. Separare la luce di ritorno in due raggi con un altro divisore di raggio. Utilizzare collimatori in fibra per accoppiare i raggi a fibre monomodali di diverse lunghezze per introdurre un ritardo tra i raggi.
Collegare le fibre a un oscilloscopio in tempo reale tramite un accoppiatore in fibra e un fotorilevatore. Regolare il guadagno dell'amplificatore ottico fino a quando il rapporto segnale/rumore del segnale ottico è superiore a 10 decibel. Quindi bloccare circa la metà di ciascuna trave restituita con blocchi di trave a lama di coltello.
Regolare i blocchi del raggio fino a quando la potenza ottica misurata in ciascuna fibra è circa la metà della potenza prima del blocco. Verificare che la larghezza di banda e la frequenza di campionamento dell'oscilloscopio siano sufficientemente alte da non influenzare la risoluzione dell'immagine. Per iniziare l'esperimento, diluire i campioni cellulari a una percentuale compresa tra 10 e la 5a e tra 10 e 6 cellule per millilitro con soluzione salina tamponata con fosfato o acqua di sorgente.
Quindi caricare la soluzione cellulare in una siringa da 10 millilitri. Collegare la siringa all'ingresso del canale microfluidico. Dirigere l'uscita del canale microfluidico verso una provetta da centrifuga.
Fissare la siringa in una pompa a siringa e impostare la portata in modo appropriato per la larghezza del canale. Scegliere il numero di punti dati da salvare per l'esperimento. Quindi acquisire e salvare i dati del segnale ottico.
Digitalizza ed esporta i dati dall'oscilloscopio a un computer. Elabora i dati in immagini 2D ed estrai una libreria di parametri dalle immagini. Importare le immagini nella libreria dei parametri in un programma di visualizzazione.
Assegnare un parametro di interesse a ciascun asse e selezionare il set di dati da visualizzare come grafico a dispersione. Controllare le immagini delle celle associate a ciascun gruppo nel grafico per identificare le tendenze. Utilizza il gating manuale o visualizza set di dati aggiuntivi per ulteriori analisi, se necessario.
ATOM è stato utilizzato per acquisire immagini di singole cellule ad alto contrasto di cellule umane e fitoplancton. Strutture cellulari caratteristiche come vacuoli, pirenoidi e flagelli sono visibili nelle immagini del fitoplancton. Parametri come la dimensione e la circolarità delle cellule sono stati determinati dalle immagini ATOM per classificare le cellule per l'analisi citometrica.
I risultati della classificazione possono essere visualizzati come grafici a dispersione 2D. Qui è stato tracciato il volume rispetto alla circolarità per un MCF7 mostrato in giallo e PBMC mostrato in rosso. Sono stati osservati due cluster per MCF7.
Identificando le immagini ad alto contrasto corrispondenti ai singoli punti dati, si è scoperto che il cluster inferiore corrispondeva a frammenti di cellule e detriti. Una volta padroneggiato, il sistema di imaging può essere configurato in due o tre ore se viene eseguito correttamente. Le procedure di imaging possono essere eseguite entro un'ora.
Non dimenticare di prestare particolare attenzione alla sicurezza degli occhi mentre lavori con la sorgente laser e l'allineamento del raggio laser. Precauzioni come indossare occhiali di sicurezza devono essere sempre prese durante l'esecuzione di queste procedure. Durante l'esecuzione di questa procedura, ricordarsi di monitorare l'allineamento del raggio ottico durante l'intero processo di configurazione del sistema di imaging per garantire una qualità di imaging ottimale.
Sebbene questa tecnica possa fornire informazioni sul rilevamento e la quantificazione di cellule rare o apparenti durante il processo patologico, può anche essere applicata alla classificazione dei tipi di cellule, all'interno di popolazioni cellulari grandi ed eterogenee. Questa tecnica è particolarmente vantaggiosa quando si cerca di superare la limitazione della produttività della citometria per immagini, preservando la qualità dell'immagine. Dopo aver visto questo video, dovresti avere una buona comprensione di come implementare ATOM dalla configurazione del sistema alle procedure di imaging.
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Panoramica
Questo protocollo descrive l'implementazione di un sistema di microscopia ottica a tempo-stretch con rilevamento asimmetrico per l'imaging di singole cellule senza etichetta a elevato contrasto in flusso microfluidico ultraveloce. Il sistema ATOM consente una cattura delle immagini ultraveloce e migliora il contrasto delle immagini su cellule non etichettate, consentendo un'analisi morfologica complessa.
Componenti chiave dello studio
Area della scienza
- Microscopia ottica
- Imaging di singole cellule
- Microfluidica
Sfondo
- ATOM consente l'imaging a velocità di scansione di linea fino a decine di megahertz.
- Migliora il contrasto delle immagini per cellule non etichettate.
- Consente l'analisi di strutture cellulari e subcellulari.
- Supporta test basati su cellule non centrate ad alto rendimento.
Obiettivo dello studio
- Preparare e utilizzare un sistema di microscopia ottica a tempo-stretch con rilevamento asimmetrico.
- Raggiungere l'imaging senza etichetta ad alto contrasto di singole cellule.
- Facilitare l'imaging in flusso microfluidico ultraveloce.
Metodi utilizzati
- Il setup prevede l'utilizzo di un collimatore in fibra e un laser a impulsi IR vicino.
- Accoppiamento del laser a una fibra ottica dispersiva a singolo modo.
- Utilizzo di un amplificatore ottico per migliorare il segnale.
- Illuminazione di una griglia di diffrazione a trasmissione per produrre una pioggia spettrale.
Risultati principali
- Raggiunto l'imaging fino a 100.000 cellule al secondo.
- Dimostrazione di un contrasto migliorato per cellule non etichettate.
- Consentito un'analisi morfologica complessa non possibile con la citometria a flusso standard.
- Fornito un nuovo approccio per l'imaging ad alto rendimento.
Conclusioni
- ATOM rappresenta un significativo avanzamento nella tecnologia di imaging di singole cellule.
- Consente un'analisi rapida e dettagliata delle strutture cellulari.
- Questo metodo può trasformare gli approcci nella citometria a flusso e in campi correlati.
Domande frequenti
Executive Industry Relevance
ATOM addresses the throughput limitation of imaging flow cytometry by enabling high-speed, label-free single-cell imaging at up to 100,000 cells per second while preserving sub-cellular resolution and image contrast. This capability supports high-confidence statistical analysis through multidimensional morphological data, directly enhancing target validation and phenotypic screening in early discovery. By providing label-free biophysical phenotyping, ATOM complements biochemical assays and improves predictive confidence in cellular classification within heterogeneous populations.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Enables interrogation of therapeutic hypotheses through label-free morphological analysis of cellular and subcellular structures.
- Operational Value: Supports functional target validation by de-risking mechanistic ambiguity via high-throughput biophysical phenotyping.
- Predictive Value: Enhances portfolio triage by generating quantitative morphological parameters (e.g., size, circularity) for cytometric classification of cell states and functions.
Screening & Assay Development
- Scientific Value: Prepares validated biological systems for downstream workflows by delivering high-contrast, sub-cellular resolution images without labels or stains.
- Operational Value: Addresses assay standardization and reproducibility through ultrafast line scan rates and consistent optical signal processing.
- Scalability: Highlights screening readiness and platform reuse by enabling imaging flow cytometry at 100,000 cells/s, overcoming traditional throughput bottlenecks.
Translational & Preclinical Research
- Translational Continuity: Supports disease-relevant systems by detecting rare or aberrant cells in heterogeneous populations, as demonstrated with human cell lines and micro-algae.
- Preclinical Alignment: Facilitates continuity from discovery to preclinical validation through label-free imaging that complements biomarker-based assays.
- Risk-Adjusted Decisions: Enables data-driven advancement by linking morphological trends to functional outcomes via scatter plot analysis and manual gating.
Pipeline & Workflow Integration
ATOM integrates into the discovery continuum from hypothesis testing in early discovery to lead identification and preclinical validation, providing label-free imaging that supports mechanistic de-risking and predictive analytics.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing and pathway clarification by enabling complex morphological analysis of cellular structures in microfluidic flow.
- Screening: Delivers assay readiness and reproducibility through high-speed image capture and quantitative parameter extraction from single-cell images.
- Analytics: Provides measurable outputs such as cell size, circularity, and texture for comparative analysis and classification in scatter plots.
- Translational Research: Connects to preclinical continuity by enabling label-free imaging of heterogeneous cell populations, supporting biomarker-independent phenotypic screening.
- Enterprise Reuse: Functions as a reusable platform for high-throughput imaging across model systems, reducing dependency on staining protocols and accelerating assay development cycles.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Predictive confidence through label-free morphological de-risking and reduction of ambiguity in cellular classification.
- Operational Value: Standardization, reproducibility, and scalability via ultrafast imaging and consistent signal-to-noise ratio control (>10 dB).
- Strategic Value: Better go/no-go decisions, capital efficiency, and reduced late-stage biological risk by enabling early detection of rare or aberrant cells.
- Portfolio Impact: Risk-adjusted prioritization and advancement decisions based on quantitative morphological data from high-throughput imaging.
Implementation Considerations
- Requires expertise in optical microscopy, ultrafast laser systems, and microfluidic flow control.
- Needs broadband femtosecond/picosecond near-IR pulsed laser, optical amplifier, diffraction grating, and high-bandwidth oscilloscope.
- Demands cross-team standardization for beam alignment, knife-edge blocking, and fiber length calibration to maintain image contrast and timing.
- Involves adaptation considerations for varying cell types and microfluidic channel dimensions to ensure optimal spectral shower coverage.
- Includes practical limitations such as laser safety requirements and the need for precise optical path alignment to avoid resolution degradation.
