Citometria del flusso microfluidico di imaging mediante rilevazione asimmetrica Microscopia ottica di stretching (ATOM)
28 giugno 2017
Questo protocollo descrive l'implementazione di un sistema di microscopia ottica a tempo determinato di rilevamento asimmetrico per l'imaging a celle singole in flusso microfluidico ultravioletto e le sue applicazioni nella citometria a flusso di immagini.
L'obiettivo generale di questo protocollo è quello di preparare e utilizzare un sistema di microscopia ottica a tempo di rilevamento asimmetrico per l'imaging di singole cellule ad alto contrasto senza etichetta in un flusso microfluidico ultraveloce. Il vantaggio principale di ATOM è che consente l'acquisizione ultraveloce delle immagini con velocità di scansione lineare fino a decine di megahertz, migliorando al contempo il contrasto dell'immagine sulle celle non etichettate. ATOM consente un'analisi morfologica complessa delle strutture cellulari e subcellulari con saggi basati su cellule non centrate fino a 100.000 cellule al secondo, cosa che non è possibile con la citometria a flusso standard.
Per iniziare a configurare il sistema, utilizzare un collimatore in fibra per accoppiare un laser pulsato a banda larga femto o pico secondo vicino all'IR a una fibra ottica dispersiva monomodale collegata a un amplificatore ottico. Illuminare una classificazione di diffrazione di trasmissione con il laser per produrre una pioggia spettrale. Orientare la classificazione vicino alla configurazione del littrow per massimizzare l'efficienza di diffrazione.
Configura un gruppo di lenti a relè telescopiche in un sistema di imaging 4f per dirigere la pioggia spettrale sul piano focale posteriore di una lente dell'obiettivo sotto una piattaforma di campionamento. Assicurarsi che la doccia spettrale riempia l'apertura posteriore dell'obiettivo. Posizionare un'altra lente dell'obiettivo con uno specchio piano all'apertura posteriore sopra la piattaforma del campione.
Regolare le lenti dell'obiettivo finché i loro piani focali non si sovrappongono. Verificare che la pioggia spettrale superi il piano dell'immagine e segua lo stesso percorso fino alla gradazione. Posizionare un chip microfluidico sulla piattaforma del campione e assicurarsi che la pioggia spettrale cada attraverso il canale microfluidico.
Reindirizzare la luce di ritorno con un divisore di fascio dopo che è passata attraverso la classificazione. Separare la luce di ritorno in due raggi con un altro divisore di raggio. Utilizzare collimatori in fibra per accoppiare i raggi a fibre monomodali di diverse lunghezze per introdurre un ritardo tra i raggi.
Collegare le fibre a un oscilloscopio in tempo reale tramite un accoppiatore in fibra e un fotorilevatore. Regolare il guadagno dell'amplificatore ottico fino a quando il rapporto segnale/rumore del segnale ottico è superiore a 10 decibel. Quindi bloccare circa la metà di ciascuna trave restituita con blocchi di trave a lama di coltello.
Regolare i blocchi del raggio fino a quando la potenza ottica misurata in ciascuna fibra è circa la metà della potenza prima del blocco. Verificare che la larghezza di banda e la frequenza di campionamento dell'oscilloscopio siano sufficientemente alte da non influenzare la risoluzione dell'immagine. Per iniziare l'esperimento, diluire i campioni cellulari a una percentuale compresa tra 10 e la 5a e tra 10 e 6 cellule per millilitro con soluzione salina tamponata con fosfato o acqua di sorgente.
Quindi caricare la soluzione cellulare in una siringa da 10 millilitri. Collegare la siringa all'ingresso del canale microfluidico. Dirigere l'uscita del canale microfluidico verso una provetta da centrifuga.
Fissare la siringa in una pompa a siringa e impostare la portata in modo appropriato per la larghezza del canale. Scegliere il numero di punti dati da salvare per l'esperimento. Quindi acquisire e salvare i dati del segnale ottico.
Digitalizza ed esporta i dati dall'oscilloscopio a un computer. Elabora i dati in immagini 2D ed estrai una libreria di parametri dalle immagini. Importare le immagini nella libreria dei parametri in un programma di visualizzazione.
Assegnare un parametro di interesse a ciascun asse e selezionare il set di dati da visualizzare come grafico a dispersione. Controllare le immagini delle celle associate a ciascun gruppo nel grafico per identificare le tendenze. Utilizza il gating manuale o visualizza set di dati aggiuntivi per ulteriori analisi, se necessario.
ATOM è stato utilizzato per acquisire immagini di singole cellule ad alto contrasto di cellule umane e fitoplancton. Strutture cellulari caratteristiche come vacuoli, pirenoidi e flagelli sono visibili nelle immagini del fitoplancton. Parametri come la dimensione e la circolarità delle cellule sono stati determinati dalle immagini ATOM per classificare le cellule per l'analisi citometrica.
I risultati della classificazione possono essere visualizzati come grafici a dispersione 2D. Qui è stato tracciato il volume rispetto alla circolarità per un MCF7 mostrato in giallo e PBMC mostrato in rosso. Sono stati osservati due cluster per MCF7.
Identificando le immagini ad alto contrasto corrispondenti ai singoli punti dati, si è scoperto che il cluster inferiore corrispondeva a frammenti di cellule e detriti. Una volta padroneggiato, il sistema di imaging può essere configurato in due o tre ore se viene eseguito correttamente. Le procedure di imaging possono essere eseguite entro un'ora.
Non dimenticare di prestare particolare attenzione alla sicurezza degli occhi mentre lavori con la sorgente laser e l'allineamento del raggio laser. Precauzioni come indossare occhiali di sicurezza devono essere sempre prese durante l'esecuzione di queste procedure. Durante l'esecuzione di questa procedura, ricordarsi di monitorare l'allineamento del raggio ottico durante l'intero processo di configurazione del sistema di imaging per garantire una qualità di imaging ottimale.
Sebbene questa tecnica possa fornire informazioni sul rilevamento e la quantificazione di cellule rare o apparenti durante il processo patologico, può anche essere applicata alla classificazione dei tipi di cellule, all'interno di popolazioni cellulari grandi ed eterogenee. Questa tecnica è particolarmente vantaggiosa quando si cerca di superare la limitazione della produttività della citometria per immagini, preservando la qualità dell'immagine. Dopo aver visto questo video, dovresti avere una buona comprensione di come implementare ATOM dalla configurazione del sistema alle procedure di imaging.
Visualizza la trascrizione completa e accedi a migliaia di video scientifici
Panoramica
Questo protocollo descrive l'implementazione di un sistema di microscopia ottica time-stretch con rilevamento asimmetrico per l'acquisizione di immagini di singole cellule senza marcatura e con alto contrasto in flusso microfluidico ultra-rapido. Il sistema ATOM consente una cattura delle immagini estremamente veloce e migliora il contrasto delle immagini su cellule non marcate, permettendo analisi morfologiche complesse.
Componenti Chiave dello Studio
Area della Scienza
- Microscopia Ottica
- Immagini a Singola Cellula
- Microfluidica
Sfondo
- ATOM consente l'acquisizione di immagini con velocità di scansione lineare fino a decine di megahertz.
- Migliora il contrasto delle immagini per cellule non marcate.
- Permette l'analisi di strutture cellulari e subcellulari.
- Supporta saggi basati su cellule non centrate ad alta produttività.
Scopo dello studio
- Preparare e utilizzare un sistema di microscopia ottica asimmetrica a tempo-stretch con rilevamento asimmetrico.
- Realizzare immagini ad alto contrasto senza etichette di singole cellule.
- Facilitare l'acquisizione di immagini in flusso microfluidico ultra-rapido.
Metodi Utilizzati
- L'allestimento prevede l'utilizzo di un collimatore a fibra e di un laser a impulsi nel vicino infrarosso.
- Accoppiamento del laser a una fibra ottica dispersiva monomodale.
- Utilizzo di un amplificatore ottico per potenziare il segnale.
- Illuminazione di un reticolo di diffrazione in trasmissione per produrre una "pioggia" spettrale.
Risultati principali
- Acquisito l'immaginamento di fino a 100.000 cellule al secondo.
- Dimostrato un contrasto migliorato per cellule non marcate.
- Consentita un'analisi morfologica complessa non possibile con la citometria a flusso standard.
- Fornito un nuovo approccio per l'immaginamento ad alto rendimento.
Conclusioni
- ATOM rappresenta un notevole progresso nella tecnologia di imaging a singola cellula.
- Consente un'analisi rapida e dettagliata delle strutture cellulari.
- Questo metodo può trasformare gli approcci in citometria a flusso e nei campi correlati.
Domande frequenti
Rilevanza Industriale del Progetto
ATOM affronta il limite di throughput della citometria a flusso con imaging abilitando un imaging single-cellula senza etichette ad alta velocità, fino a 100.000 cellule al secondo, mantenendo al contempo una risoluzione subcellulare e un contrasto dell'immagine elevato. Questa capacità supporta analisi statistiche ad alta affidabilità attraverso dati morfologici multidimensionali, potenziando direttamente la validazione degli target e lo screening fenotipico nelle fasi iniziali della scoperta. Fornendo un fenotipaggio biofisico senza etichette, ATOM integra i saggi biochimici e migliora l'affidabilità predittiva nella classificazione cellulare all'interno di popolazioni eterogenee.
Applicazioni Strategiche nella Ricerca e Sviluppo in Biopharma
Scoperta Precoce e Validazione del Bersaglio
- Valore scientifico: Consente l'analisi di ipotesi terapeutiche mediante l'analisi morfologica senza etichette di strutture cellulari e subcellulari.
- Valore operativo: Supporta la validazione funzionale delle target riducendo l'ambiguità meccanicistica attraverso fenotipizzazione biofisica ad alto rendimento.
- Valore predittivo: Migliora la selezione dei portafogli generando parametri morfologici quantitativi (ad esempio, dimensione, circularità) per la classificazione citometrica degli stati e delle funzioni cellulari.
Sviluppo di screening e saggi
- Valore scientifico: Prepara sistemi biologici validati per flussi di lavoro successivi fornendo immagini ad alto contrasto con risoluzione subcellulare, senza l'uso di marcatori o colorazioni.
- Valore operativo: Affronta la standardizzazione e la riproducibilità dei saggi attraverso velocità di scansione lineare estremamente elevate ed elaborazione ottica del segnale costante.
- Scalabilità: Evidenzia la prontezza per lo screening e il riutilizzo della piattaforma abilitando la citometria a flusso con imaging a 100.000 cellule/s, superando i tradizionali colli di bottiglia in termini di produttività.
Ricerca Translazionale e Preclinica
- Continuità traslazionale: Supporta sistemi rilevanti per le malattie rilevando cellule rare o aberranti in popolazioni eterogenee, come dimostrato con linee cellulari umane e microalghe.
- Allineamento preclinico: Favorisce la continuità dalla scoperta alla validazione preclinica attraverso immagini senza marcatura che integrano saggi basati su biomarcatori.
- Decisioni basate sul rischio: Permette un avanzamento guidato dai dati collegando tendenze morfologiche a risultati funzionali mediante analisi di grafici a dispersione e selezione manuale.
Integrazione di Pipeline e Flusso di Lavoro
ATOM si integra nel percorso della scoperta, dal test delle ipotesi nella fase iniziale fino all'identificazione del composto promettente e alla validazione preclinica, fornendo immagini senza marcatura che supportano la riduzione del rischio meccanicistica e l'analisi predittiva.
- Biologia della scoperta: Supporta la verifica delle ipotesi e la chiarificazione dei percorsi mediante l'analisi morfologica complessa di strutture cellulari in flusso microfluidico.
- Screening: Garantisce prontezza e riproducibilità dei saggi grazie all'acquisizione rapida di immagini ed all'estrazione di parametri quantitativi da immagini di singole cellule.
- Analisi: Fornisce output misurabili come dimensione cellulare, circularità e trama per l'analisi comparativa e la classificazione in grafici a dispersione.
- Ricerca traslazionale: Si collega alla continuità preclinica permettendo l'immagine senza etichette di popolazioni cellulari eterogenee, sostenendo lo screening fenotipico indipendente da biomarcatori.
- Riutilizzo aziendale: Funziona come piattaforma riutilizzabile per l'acquisizione di immagini ad alto rendimento su diversi sistemi modello, riducendo la dipendenza dai protocolli di colorazione e accelerando i cicli di sviluppo dei saggi.
Impatto Operativo ed Aziendale
- Valore scientifico: Affidabilità predittiva grazie alla riduzione del rischio basata sulla morfologia senza etichette e alla diminuzione dell'ambiguità nella classificazione cellulare.
- Valore operativo: Standardizzazione, riproducibilità e scalabilità mediante imaging ultrarapido e controllo costante del rapporto segnale-rumore (>10 dB).
- Valore strategico: Decisioni più accurate su prosegui/non prosegui, maggiore efficienza del capitale e riduzione del rischio biologico in fasi avanzate, grazie alla rilevazione precoce di cellule rare o aberranti.
- Impatto sul portafoglio: Prioritizzazione e decisioni di avanzamento corrette per rischio basate su dati morfologici quantitativi ottenuti da imaging ad alto rendimento.
Considerazioni relative all'implementazione
- Richiede competenze specifiche in microscopia ottica, sistemi laser ultraveloci e controllo del flusso microfluidico.
- Necessita di un laser pulsato a banda larga nel vicino infrarosso (femtosecondi/picosecondi), amplificatore ottico, reticolo di diffrazione e oscilloscopio ad alta banda passante.
- Richiede standardizzazione tra i vari gruppi di lavoro per l'allineamento del fascio, il bloccaggio con lama a coltello (knife-edge) e la calibrazione della lunghezza della fibra, al fine di mantenere contrasto dell'immagine e sincronizzazione.
- Comporta considerazioni di adattamento relative ai diversi tipi cellulari e alle dimensioni dei canali microfluidici, per garantire una copertura ottimale della cascata spettrale.
- Include limitazioni pratiche, come i requisiti di sicurezza per l'uso del laser e la necessità di un allineamento preciso del percorso ottico per evitare un degrado della risoluzione.
