Name: Un metodo di isolamento di romanzo Clinical Grade per rene umano perivascolari cellule stromali (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-08-07T13:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 5 s
Description: Scopri un metodo clinico per isolare cellule stromali perivascolari renali umane mediante perfusione d'organo e arricchimento NG2. Questa tecnica genera popolazioni cellulari omogenee per terapie rigenerative nel trattamento delle malattie renali.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Questa ricerca ha ricevuto un finanziamento dalla settimo programma Comunità europea quadro (FP7/2007-2013) sotto la concessione numero di contratto 305436 STELLAR.

Il comitato etico medico locale e il comitato consultivo etico del consorzio europeo (STELLAR) hanno approvato la ricerca e la raccolta di reni umani da trapianto scartati principalmente per motivi chirurgici. Il consenso alla ricerca è stato dato per tutti i reni.
1. Preparazioni per la coltura cellulare
<ol>
	<li>Preparare una pool di lisati piastrinici.
	<ol>
		<li>Conservare le piastrine che sono scadute per meno di 2 giorni a -80 °C fino all'uso (per un massimo di 1 anno). 
		NOTA: Le piastrine sono state originariamente acquistate da un fornitore commerciale. Sono state ottenute le eccedenze ospedaliere distribuite dalla banca del sangue locale.</li>
		<li>Scongelare le piastrine di almeno 5 donatori (preferibilmente 10) O/N a 4 °C.</li>
		<li>Raccogliere le piastrine in un grande flacone sterile, trasferirle in provette da centrifuga coniche e centrifugare per 10 minuti a 1.960 x g a 4 °C. 
		NOTA: Il volume delle piastrine dipende dal numero di donatori e dalla quantità di materiale in eccesso dell'ospedale per donatore.</li>
		<li>Pipettare il surnatante nelle sacche di sangue (50 ml/sacca) attraverso il fusto di una siringa da 50 ml. Conservare a -80 °C.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Preparazione del terreno di coltura cellulare.
	<ol>
		<li>Scongelare una sacca di lisati piastrinici a bagnomaria a 37 °C.</li>
		<li>Aggiungere 1 L (cioè 2 flaconi) di Minimum Essential Medium - alpha modification (alphaMEM), 5 mL 200 mM di glutammina e 20 mL di penicillina (5.000 U/mL)/streptomicina (5.000 μg/mL) (penna/streptococco) alla sacca.</li>
		<li>Incubare per 3 ore a 37 °C.</li>
		<li>Agitare il sacchetto per il degelling picchiettando delicatamente sul sacchetto quando il sacchetto è appoggiato su una superficie piana.</li>
		<li>Filtrare il terreno di lisi piastrinico al 5% tirando i lisati attraverso il filtro del sistema trasfusionale con una siringa sterile da 50 ml.</li>
		<li>Aliquotare il terreno in provette da 50 mL e conservare a -80 °C fino al momento dell'uso. 
		NOTA: Ogni nuovo lotto di lisati piastrinici viene testato in coltura cellulare e confrontato con il lotto precedente facendo crescere le cellule di interesse (bmMSC o kPSC) fino alla confluenza in entrambi i lotti. In termini di numero di cellule e vitalità, le kPSC o bmMC coltivate nel nuovo lotto non devono differire più del 10% e l'espressione dei marcatori di CD73, CD90, CD105 e CD31, CD34 e CD45 analizzati mediante citometria a flusso non deve differire. I metodi di coltura cellulare sono descritti nella sezione 6 del protocollo (Coltura di kPSC).</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
2. Preparativi per la raccolta di cellule
<ol>
	<li>Preparazione delle soluzioni.
	<ol>
		<li>Preparare il terreno semplice aggiungendo 10 ml di penna/strep a 500 ml (1 flacone) di Dulbecco's Minimum Essential Medium (DMEM)-F12.</li>
		<li>Preparare il terreno di lavaggio aggiungendo 50 ml di siero umano normale (NHS) e 10 ml di penna/streptococco a 1 flacone di DMEM-F12.</li>
		<li>Preparare il tampone enzima-stock aggiungendo 2,9 mL di acido 4-(2-idrossietil)-1-piperazineetansolfonico (HEPES), 1,2 mL di NaHCO3 2,5% [p/v] e 160 μL di CaCl2 (1 M) a 160 mL di soluzione University of Wisconsin.</li>
		<li>Preparare la soluzione di collagenasi aggiungendo lentamente 20 ml di tampone enzimatico al flacone di collagenasi di grado GMP contenente >2.000 U/flacone di collagenasi. Sciogliere a 4 °C per circa 40 min. Agitare delicatamente più volte durante il periodo di dissoluzione.</li>
		<li>Preparare il terreno di congelamento aggiungendo 5 mL di dimetilsolfossido (DMSO) a 45 mL di NHS.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Preparazione del vassoio di perfusione (Figura 1A).
	<ol>
		<li>Pulire la cabina di flusso e coprirla con teli chirurgici. Riscaldare un bagnomaria a circa 40 - 45 °C per riscaldare la vaschetta di perfusione a 37 °C. Indossare camici e guanti chirurgici.</li>
		<li>Collegare una vaschetta di perfusione sterilizzata al bagnomaria per preriscaldare la vaschetta di perfusione con acqua tiepida. Assicurarsi che non ci sia aria nella vaschetta di perfusione iniziando con la vaschetta di perfusione in posizione verticale. Se necessario, aggiungere altra acqua al bagnomaria per evitare l'infusione di aria nella vaschetta di perfusione.</li>
		<li>Posizionare il tubo LS25 nella pompa. Lasciare entrambe le estremità sterili del tubo nella cabina di flusso. Posizionare una pinza di Kocher su un'estremità del tubo e lasciarla riposare sul fondo del vassoio di perfusione. Posizionare una garza sterile sopra il tubo per evitare ostruzioni. Collegare un connettore Luer all'altra estremità del tubo.</li>
		<li>Aggiungere circa 100 mL di terreno semplice nel vassoio di perfusione e iniziare a lavare la provetta a una velocità della pompa di 100 mL/min.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
3. Isolamento delle cellule renali
<ol>
	<li>Preparazione del rene.
	<ol>
		<li>Rimuovere il rene dalle sacche sterili doppie e posizionarlo sul vassoio di perfusione sterile (Figura 1B). Rimuovere il tessuto adiposo perirenale e la capsula renale con le forbici e una leggera lacrimazione (Figura 1C) e identificare l'arteria renale sul cerotto aortico come mostrato in Figura 1D.</li>
		<li>Incannulare l'arteria renale con la punta accessoria, fissarla con un tirante sterilizzato e fissarla all'estremità del tubo della pompa con il connettore Luer mentre la pompa è accesa. Se i tubi non sono completamente riempiti, aggiungere prima altro fluido al vassoio e lavare i tubi avviando la pompa (Figura 1E - F). Lavare il rene con terreno semplice tramite la pompa con un flusso di 100 ml/min.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Trattamento con collagenasi e isolamento delle cellule renali.
	<ol>
		<li>Aggiungere la collagenasi (20 mL, >2.000 U) e la DNasi (2,5 mL, 1 mg/mL) al vassoio di perfusione (Figura 1G). Girare delicatamente il rene di tanto in tanto a mano. Attendere che il rene diventi morbido e il liquido di perfusione diventi meno trasparente (circa 30 - 40 minuti).</li>
		<li>Massaggiare delicatamente il rene (Figura 1H) fino ad ottenere una sospensione cellulare (Figura 1I). Rimuovere il materiale non digerito e la punta nell'arteria renale.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Lavaggio e raccolta di cellule renali.
	<ol>
		<li>Aggiungere 50 mL di NHS alla sospensione cellulare. Drenare la sospensione cellulare dal vassoio di perfusione mettendo la pompa a basso flusso e posizionando la provetta prima collegata al rene sopra le provette da 50 mL (Figura 1J).</li>
		<li>Centrifugare a 300 x g per 7 minuti a 4 °C e rimuovere il surnatante. Lavare i pellet con un terreno di lavaggio contenente il 10% di NHS e centrifugare nuovamente a 300 x g per 7 min. Ripetere il lavaggio ancora una volta. Misurare il volume dei pellet cellulari e aggiungere un volume uguale di terreno di coltura cellulare.</li>
		<li>Crioconservare le cellule da qui aggiungendo un mezzo di congelamento 1:1 alla sospensione cellulare e conservarle in fiale criogeniche secondo i protocolli standard, oppure continuare a coltivare le cellule (sezione 4). 
		NOTA: La sospensione cellulare contiene grumi cellulari e richiede passaggi aggiuntivi per ottenere singole cellule, il che si traduce in un aumento della morte cellulare. Pertanto, le cellule vengono mantenute in sospensione e non vengono conteggiate in questa fase.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
4. Coltura cellulare di cellule renali grezze
<ol>
	<li>Aggiungere circa 1 mL di sospensione cellulare a 24 mL di lisati piastrinici alphaMEM 5% (terreno di coltura cellulare) in un pallone di coltura cellulare T175 (Figura 1K) e coltura a 37 °C, 5% CO2. Rimuovere il terreno e i detriti cellulari dopo 2 giorni dalle cellule aderenti e rinfrescare il terreno con 25 mL di terreno di coltura cellulare.</li>
	<li>Rinfrescare il terreno di coltura due volte alla settimana rimuovendo metà del terreno (12,5 ml) e aggiungendo terreno fresco (12,5 ml) utilizzando tecniche asettiche.</li>
	<li>Coltura fino a confluente (di solito 5 - 7 d) (Figura 1L). Rimuovere il terreno, lavare due volte con PBS e tripsinizzare le cellule aggiungendo 5 mL di tripsina a ciascun pallone T175 per 5 minuti a 37 °C. Lavare nel terreno di coltura e centrifugare a 490 x g per 5 minuti e rimuovere il surnatante.</li>
</ol>
5. Arricchimento cellulare per NG2 mediante separazione cellulare magnetica (Figura 1M)
<ol>
	<li>Preparare il tampone di separazione cellulare secondo il protocollo del produttore.</li>
	<li>Risospendere le kPSC tripsinizzate in un tampone di separazione cellulare da 10 mL. Centrifugare a 490 x g per 5 minuti, scartare il surnatante e risospendere le cellule in un tampone di separazione cellulare da 300 μl.</li>
	<li>Aggiungere 100 μL di reagen bloccante FcR/5 x 107 cellule, aggiungere 100 μL di perle anti-melanoma (NG2) per 5 x 107 cellule e incubare per 30 minuti a 4 °C. Separare la frazione NG2-positiva secondo il protocollo del produttore. Aggiungere 10 mL di terreno e centrifugare le celle per 5 minuti a 490 x g.</li>
	<li>Contare le celle utilizzando una camera di conteggio Bürker secondo il protocollo del produttore. Seminare le cellule in un pallone di coltura (circa 4 x 103 cellule/cm2) e incubare. 
	NOTA: Seminare le cellule nelle seguenti concentrazioni: <250.000 in un pallone T25, 250.000 - 500.000 in un pallone T75 e 700.000 - 800.000 in un pallone T175. Dopo l'arricchimento delle celle magnetiche, viene isolata una frazione positiva di circa l'1 - 2%. Tuttavia, poiché questa fase è l'arricchimento cellulare e non lo smistamento cellulare, altri tipi di cellule saranno presenti nella coltura (Figura 1N). Dopo diversi passaggi (di solito intorno a 4 - 5), è presente solo una popolazione omogenea di kPSC (Figura 1P).</li>
</ol>
6. Cultura delle kPSC
<ol>
	<li>Rinfrescare il terreno due volte alla settimana rimuovendo metà del terreno e sostituirlo con un terreno di coltura appena scongelato (Figura 1N). 
	NOTA: Le kPSC tendono ad essere più vitali e proliferative quando solo la metà del mezzo viene aggiornata.</li>
	<li>Superamento della media dei kPSCs. 
	NOTA: Passare le kPSC al 90 - 100% di confluenza, o quando compaiono strutture 3D (vedi Figura 1O), o quando non c'è stata crescita cellulare per più di una settimana. Gli ultimi due in particolare potrebbero verificarsi nei primi passaggi dopo l'arricchimento cellulare. In questo caso, dopo il passaggio, le cellule di solito ricominciano a crescere in coltura monostrato (Figura 1P).
	<ol>
		<li>Rimuovere il terreno dalle celle confluenti al 90 - 100% (conservare il terreno per un uso successivo). Lavare il matraccio due volte con PBS (1 mL in T25, 5 mL in T75, 10 mL in T175). Aggiungere la tripsina (0,5 mL in T25, 2 mL in T75, 5 mL in T175) e incubare per 5 minuti a 37 °C. Aggiungere il vecchio terreno nel pallone e risospendere delicatamente.</li>
		<li>Trasferire in una provetta da 15 o 50 ml (a seconda del volume) e centrifugare a 490 x g per 5 minuti. Contare le cellule vitali e la piastra <250.000 in un T25, 250.000 - 500.000 in un T75 o 700.000 - 800.000 in un T175 (circa 4 x 103 cellule/cm2).</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Testare le kPSC al passaggio 5 o 6 (ad esempio, test di graffio, sezione 7). 
	NOTA: Caratterizzare le cellule propagate mediante citometria a flusso utilizzando protocolli standard. L'espressione dei marcatori di NG2, PDGFR-β, CD146, CD73, CD90, CD105, HLA-ABC dovrebbe essere positiva e CD31, CD34, CD45 e HLA-DR dovrebbero essere negativi. Test per micoplasmi, batteri e funghi nel terreno di coltura secondo i protocolli standard del laboratorio di microbiologia clinica. Testare funzionalmente le kPSC in un test di graffio della ferita epiteliale renale. Gli esperimenti vengono solitamente eseguiti con popolazioni di kPSC sterili, confermate dalla citometria a flusso, con capacità di guarigione della ferita tra il passaggio 6-8.</li>
	<li>Crioconservare le kPSC aggiungendo 0,5 mL di terreno di crioconservazione a 0,5 mL di sospensione cellulare (2 milioni di cellule per mL di terreno di coltura) utilizzando protocolli standard. 
	NOTA: Dopo lo scongelamento, seminare le kPSC a una densità maggiore (106 celle in un T175).</li>
</ol>
7. Test funzionale delle kPSC: Saggio di graffio della ferita epiteliale renale
<ol>
	<li>Coltura delle kPSC in una piastra a 6 pozzetti a una densità di 200.000 cellule/pozzetto in terreno di coltura da 2 mL. Dopo 48 ore di coltura a 37 °C, 5% CO2, raccogliere il surnatante. Questo è il mezzo condizionato.</li>
	<li>Seminare l'HK-2 (cellule epiteliali tubulari prossimali)17 in 2 mL di terreno di cellule epiteliali tubulari prossimali (PTEC) costituito da un rapporto 1:1 di DMEM-F12 integrato con insulina (5 mg/mL), transferrina (5 mg/mL), selenio (5 ng/mL), idrocortisone (36 ng/mL), triiodotirinina (40 pg/mL), fattore di crescita epidermico (10 ng/mL) e penna/streptococco, in una densità di 500.000 cellule per pozzetto in una piastra di coltura cellulare a 6 pozzetti.</li>
	<li>Coltura per 48 ore a 37 °C, 5% CO2. Rimuovere il terreno di coltura cellulare degli HK-2 e creare una ferita da graffio nel monostrato degli HK-2 facendo un graffio con la punta di una pipetta gialla dall'alto verso il basso del pozzetto. Lavare gli HK-2 con PBS e aggiungere il mezzo condizionato dei kPSC o del mezzo di controllo. Segnare sul fondo della lastra l'area da fotografare. 
	NOTA: Gli HK-2 devono essere confluenti. Immagina due aree per pozzetto.</li>
	<li>Visualizzare il graffio a 4, 8, 12 e 24 ore nella stessa posizione contrassegnata con un microscopio a campo chiaro invertito.</li>
	<li>Misura l'area di graffio nell'immagine J utilizzando lo strumento di selezione poligono per determinare la percentuale di chiusura.</li>
</ol>

<ol><li>Friedenstein, A. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Precursors+for+fibroblasts+in+different+populations+of+hematopoietic+cells+as+detected+by+the+in+vitro+colony+assay+method%5BTitle%5D)+AND+%22Exp+Hematol%22%5BJournal%5D)">Precursors for fibroblasts in different populations of hematopoietic cells as detected by the in vitro colony assay method.</a> Exp Hematol. 2 (2), 83-92 (1974).</li>
<li>Dominici, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Minimal+criteria+for+defining+multipotent+mesenchymal+stromal+cells.+The+International+Society+for+Cellular+Therapy+position+statement%5BTitle%5D)+AND+%22Cytotherapy%22%5BJournal%5D)">Minimal criteria for defining multipotent mesenchymal stromal cells. The International Society for Cellular Therapy position statement.</a> Cytotherapy. 8 (4), 315-317 (2006).</li>
<li>Pittenger, M. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multilineage+potential+of+adult+human+mesenchymal+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Multilineage potential of adult human mesenchymal stem cells.</a> Science. 284 (5411), 143-147 (1999).</li>
<li>Leuning, D. G., Reinders, M. E., de Fijter, J. W., Rabelink, T. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Clinical+translation+of+multipotent+mesenchymal+stromal+cells+in+transplantation%5BTitle%5D)+AND+%22Semin+Nephrol%22%5BJournal%5D)">Clinical translation of multipotent mesenchymal stromal cells in transplantation.</a> Semin Nephrol. 34 (4), 351-364 (2014).</li>
<li>Reinders, M. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Autologous+bone+marrow-derived+mesenchymal+stromal+cells+for+the+treatment+of+allograft+rejection+after+renal+transplantation%3A+results+of+a+phase+I+study%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cells+Transl+Med%22%5BJournal%5D)">Autologous bone marrow-derived mesenchymal stromal cells for the treatment of allograft rejection after renal transplantation: results of a phase I study.</a> Stem Cells Transl Med. 2 (2), 107-111 (2013).</li>
<li>Perico, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Autologous+mesenchymal+stromal+cells+and+kidney+transplantation%3A+a+pilot+study+of+safety+and+clinical+feasibility%5BTitle%5D)+AND+%22Clin+J+Am+Soc+Nephrol%22%5BJournal%5D)">Autologous mesenchymal stromal cells and kidney transplantation: a pilot study of safety and clinical feasibility.</a> Clin J Am Soc Nephrol. 6 (2), 412-422 (2011).</li>
<li>Perico, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mesenchymal+stromal+cells+and+kidney+transplantation%3A+pretransplant+infusion+protects+from+graft+dysfunction+while+fostering+immunoregulation%5BTitle%5D)+AND+%22Transpl+Int%22%5BJournal%5D)">Mesenchymal stromal cells and kidney transplantation: pretransplant infusion protects from graft dysfunction while fostering immunoregulation.</a> Transpl Int. 26 (9), 867-878 (2013).</li>
<li>Tan, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Induction+therapy+with+autologous+mesenchymal+stem+cells+in+living-related+kidney+transplants%3A+a+randomized+controlled+trial%5BTitle%5D)+AND+%22JAMA%22%5BJournal%5D)">Induction therapy with autologous mesenchymal stem cells in living-related kidney transplants: a randomized controlled trial.</a> JAMA. 307 (11), 1169-1177 (2012).</li>
<li>Crisan, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+perivascular+origin+for+mesenchymal+stem+cells+in+multiple+human+organs%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Stem+Cell%22%5BJournal%5D)">A perivascular origin for mesenchymal stem cells in multiple human organs.</a> Cell Stem Cell. 3 (3), 301-313 (2008).</li>
<li>Sacchetti, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((No+Identical+%22Mesenchymal+Stem+Cells%22+at+Different+Times+and+Sites%3A+Human+Committed+Progenitors+of+Distinct+Origin+and+Differentiation+Potential+Are+Incorporated+as+Adventitial+Cells+in+Microvessels%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cell+Reports%22%5BJournal%5D)">No Identical "Mesenchymal Stem Cells" at Different Times and Sites: Human Committed Progenitors of Distinct Origin and Differentiation Potential Are Incorporated as Adventitial Cells in Microvessels.</a> Stem Cell Reports. 6 (6), 897-913 (2016).</li>
<li>Chen, W. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+myocardial+pericytes%3A+multipotent+mesodermal+precursors+exhibiting+cardiac+specificity%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cells%22%5BJournal%5D)">Human myocardial pericytes: multipotent mesodermal precursors exhibiting cardiac specificity.</a> Stem Cells. 33 (2), 557-573 (2015).</li>
<li>Dekel, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+and+characterization+of+nontubular+sca-1%2Blin-+multipotent+stem%2Fprogenitor+cells+from+adult+mouse+kidney%5BTitle%5D)+AND+%22J+Am+Soc+Nephrol%22%5BJournal%5D)">Isolation and characterization of nontubular sca-1+lin- multipotent stem/progenitor cells from adult mouse kidney.</a> J Am Soc Nephrol. 17 (12), 3300-3314 (2006).</li>
<li>Li, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Collecting+duct-derived+cells+display+mesenchymal+stem+cell+properties+and+retain+selective+in+vitro+and+in+vivo+epithelial+capacity%5BTitle%5D)+AND+%22J+Am+Soc+Nephrol%22%5BJournal%5D)">Collecting duct-derived cells display mesenchymal stem cell properties and retain selective in vitro and in vivo epithelial capacity.</a> J Am Soc Nephrol. 26 (1), 81-94 (2015).</li>
<li>Pelekanos, R. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comprehensive+transcriptome+and+immunophenotype+analysis+of+renal+and+cardiac+MSC-like+populations+supports+strong+congruence+with+bone+marrow+MSC+despite+maintenance+of+distinct+identities%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cell+Res%22%5BJournal%5D)">Comprehensive transcriptome and immunophenotype analysis of renal and cardiac MSC-like populations supports strong congruence with bone marrow MSC despite maintenance of distinct identities.</a> Stem Cell Res. 8 (1), 58-73 (2012).</li>
<li>Leuning, D. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Clinical-Grade+Isolated+Human+Kidney+Perivascular+Stromal+Cells+as+an+Organotypic+Cell+Source+for+Kidney+Regenerative+Medicine%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cells+Transl+Med%22%5BJournal%5D)">Clinical-Grade Isolated Human Kidney Perivascular Stromal Cells as an Organotypic Cell Source for Kidney Regenerative Medicine.</a> Stem Cells Transl Med. , (2016).</li>
<li>Bruno, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+and+characterization+of+resident+mesenchymal+stem+cells+in+human+glomeruli%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cells+Dev%22%5BJournal%5D)">Isolation and characterization of resident mesenchymal stem cells in human glomeruli.</a> Stem Cells Dev. 18 (6), 867-880 (2009).</li>
<li>Ryan, M. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((HK-2%3A+an+immortalized+proximal+tubule+epithelial+cell+line+from+normal+adult+human+kidney%5BTitle%5D)+AND+%22Kidney+Int%22%5BJournal%5D)">HK-2: an immortalized proximal tubule epithelial cell line from normal adult human kidney.</a> Kidney Int. 45 (1), 48-57 (1994).</li>
<li>Nijhoff, M. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Glycemic+Stability+Through+Islet-After-Kidney+Transplantation+Using+an+Alemtuzumab-Based+Induction+Regimen+and+Long-Term+Triple-Maintenance+Immunosuppression%5BTitle%5D)+AND+%22Am+J+Transplant%22%5BJournal%5D)">Glycemic Stability Through Islet-After-Kidney Transplantation Using an Alemtuzumab-Based Induction Regimen and Long-Term Triple-Maintenance Immunosuppression.</a> Am J Transplant. , (2015).</li>
</ol>

D.G.L., M.A.E., e T.J.R. sono associati con una domanda di brevetto per quanto riguarda questa ricerca. Gli altri autori non hanno nulla a rivelare.

Cellule perivascolari sono state isolate da molti diversi organi solidi umani, tra cui pancreas, grasso, cartilagine e il rene9,15,16. Maggior parte dei metodi, tuttavia, sono basata su piccoli campioni di tessuto, che vengono sezionati e successivamente trattati con gli enzimi digestivi. Inoltre, questo solitamente non viene eseguito con prodotti grado clinico. Questo rende queste strategie meno adatto per traduzione clinica diretta dove sono necessarie grandi quantità di cellule di uso clinico.
Qui vi mostriamo un metodo di isolamento romanzo di kPSCs umana per organi interi basato su aspersione con enzimi di grado clinico e materiali. Il protocollo è adattato dal protocollo di isolamento clinico isolotti di Langerhans attualmente in uso per l'applicazione clinica nel nostro centro18.
Questo è il primo metodo di grado clinico in cui è possibile ottenere grandi quantità di kPSCs. La variabilità nel rendimento delle celle è in gran parte dipendente da donatore. Tuttavia, quando il rendimento delle celle che attualmente otteniamo da una frazione della sospensione delle cellule grezza di tre diversi donatori è estrapolato, in teoria, potrebbe conseguire un rendimento medio di 2,7 x 1012 kPSCs per donatore. Come terapia MSC è in genere costituito da 2 infusioni delle cellule con 1-2 x 106 cellule/kg corpo peso4, questi numeri di cellulare sono sufficienti per il trattamento allogenico di parecchi pazienti.
Un passaggio critico nella procedura di isolamento è la durata della digestione della collagenosi. Quando il periodo di digestione è troppo breve, grandi ciuffi di tessuto rimarrà, che sarà più difficile alla cultura. Quando il periodo di perfusione è troppo lungo, si può osservare aumentata delle cellule morte. Pertanto, non appena il rene inizia a diventare morbida e i fluidi meno trasparenti, il rene deve essere massaggiato delicatamente e il collagenosi trattamento deve essere interrotto.
Un altro punto critico è la cultura delle cellule dopo arricchimento cella NG2. A volte dopo l'arricchimento di cella NG2, le cellule perivascolari non iniziare a proliferare o iniziano a crescere in strutture 3D. In questo caso, quando le cellule vengono tripsinizzate e reinizializzate, le cellule di solito inizia a crescere in coltura dello strato monomolecolare.
Come materiale di partenza, trapianto umano reni di grado scartati principalmente per motivi chirurgici sono stati usati. Questi sono organi funzionali senza fibrosi principale. Riconosciamo che questo potrebbe essere una limitazione come questo è una malattia relativamente rara e difficile da ottenere organo sorgente. Reni espiantati potrebbero essere un'altra fonte; Tuttavia, a seconda del motivo dell'espianto di rene, questi reni potrebbero contenere più fibrosi e così myofibroblasts e pertanto si dovrebbe prestare attenzione poiché myofibroblasts potrebbe essere isolati e coltivati invece di cellule perivascolari.
Come il kPSCs isolato con questo spettacolo di protocollo organo-typic proprietà con rene epiteliale ferita guarigione capacità15, terapia cellulare con kPSCs in malattie del rene e trapianto sarebbe un'interessante applicazione futura. Per questo scopo, ci sono diverse strategie cellula/cellula della consegna del prodotto. La prima strategia è infusione IV di kPSCs, come attualmente utilizzati negli studi clinici bmMSC. Un'altra applicazione interessante è l'uso di kPSCs o fattori kPSC-escreto nell'aspersione di macchina prima di trapianto. In questo modo, la qualità del rene espiantato potrebbe migliorare che potrebbe portare ad una migliore funzionalità renale dopo trapianto. Per entrambe le strategie, i kPSCs sono un'interessante fonte cellulare nuovo di esplorare ulteriormente per scopi clinici.

Cellule stromali mesenchimali (MSC) sono cellule modulatore immuni che sono state originariamente isolate dal midollo osseo. Si distinguono per la loro morfologia, capacità di differenziarsi in grasso, osso e cartilagine e aderenza plastica fusiformi. MSCs esprimono i marcatori stromali CD73, CD90, CD105 pur essendo negativo per i marcatori CD31 e CD451,2,3. MSCs sono un candidato promettente per la terapia cellulare dovuto il loro tessuto omeostatico e capacità immunomodulatoria. bmMSCs sono attualmente allo studio in studi clinici per diverse malattie, tra cui malattie del rene e trapianto di rene come Recensito altrove4.
Precedentemente è stato dimostrato che cellule perivascolari da diversi organi solidi differenti, compreso il tessuto adiposo, placenta e muscolo scheletrico condividono caratteristiche con MSCs9. Tuttavia, queste cellule presentano anche funzioni di tessuto-specifici che possono provocare organotipiche riparazione10. Le cellule perivascolari del miocardio umano, ad esempio, ha stimolato risposte angiogeniche dopo ipossia e differenziano nei cardiomiociti, mentre cellule perivascolari isolate da altri tessuti non hanno mostrato questi potenziali11.
Cellule stromali perivascolare possono anche essere isolate dal mouse12,13,14 e rene umano15,16. Abbiamo ampiamente caratterizzata kPSCs e confrontato questi per bmMSCs. Abbiamo trovato che kPSCs, simile a bmMSCs, hanno capacità immunosoppressive e può supportare la formazione di plesso vascolare. Tuttavia, ci è tessuto specifiche differenze tra i tipi di cellule, come kPSCs ha mostrato una firma di espressione trascrizionale organotipiche, compresi i fattori di trascrizione nephrogenic HoxD10 e HoxD11. kPSCs, in contrasto con bmMSCs, non hanno subito la trasformazione dei miofibroblasti dopo stimolazione con TGF-β e sono stati in grado di differenziarsi in adipociti. Inoltre, kPSCs accelerato l'integrità epiteliale in un'analisi gratta e Vinci della ferita epiteliale tubolare renale, un fenomeno che non è stato osservato con bmMSCs. Questa ferita avanzata riparazione è stata mediata attraverso il rilascio di fattore di crescita dell'epatocita. Inoltre, kPSCs ha migliorato il danno renale in un modello murino di insufficienza renale acuta lesioni15. Pertanto, kPSCs sembrano avere la capacità di riparazione renale superiore e sono una fonte interessante di nuova per la terapia cellulare in patologie renali.
Per poter utilizzare kPSCs per scopi di terapia cellulare, kPSCs dovrebbe essere isolato in un modo di grado clinico con gli enzimi grado clinici e protocolli. Inoltre, per essere in grado di trattare parecchi pazienti con kPSCs da 1 donatore, sufficiente numeri di cell dovrebbero essere ottenuti. Qui vi mostriamo nel dettaglio, la procedura di isolamento clinico grado di kPSCs da reni di grado intero trapianto, producendo un numero sufficiente di cellule da utilizzare per cliniche di terapia cellulare.

<table><tbody><tr><td>Sacche Baxter</td><td>Fenwal</td><td>R4R-7004</td><td></td></tr><tr><td>Piastrine umane</td><td>Sanquin</td><td></td><td>ospedale materiale in eccesso scaduto per meno di 2 d viene utilizzato</td></tr><tr><td>lisato</td><td></td><td></td> piastrinico <td>su misura</td></tr><tr><td>Flaconi sterili monouso</td><td>Corning</td><td>09-761-11</td><td></td></tr><tr><td>500 mL PP provette da centrifuga</td><td>Corning</td><td>431123</td><td></td></tr><tr><td>a-MEM medium</td><td>Lonza</td><td>BE12-169F</td><td></td></tr><tr><td>glutamax</td><td>thermo fisher</td><td>35050038</td><td></td></tr><tr><td>pen/streptococco</td><td>Sistema</td> trasfusionale <td>di 15070063</td><td></td>Invitrogen</tr><tr><td></td><td>Codan</td><td>455609</td><td></td></tr><tr><td>DMEM-F12</td><td>life technologies</td><td>11320-074</td><td></td></tr><tr><td>Siero umano normale (NHS)</td><td>Sanquin</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Hepes 1 M</td><td>Lonza</td><td>BE-17-737E</td><td></td></tr><tr><td>NaHCO3 7,5%</td><td>Lonza</td><td>BE17-613E</td><td></td></tr><tr><td>CaCl2 1 M</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>10043-52-4</td><td></td></tr><tr><td>UW</td><td>Ponte alla vita</td><td>32911</td><td></td></tr><tr><td>Eparina</td><td>Leo Pharma</td><td></td><td></td></tr><tr><td>collagenasi NB1 GMP grado</td><td>SERVA</td><td>17455.03</td><td></td></tr><tr><td>DMSO</td><td>Sigma Aldrich</td><td>D2650-100ml</td><td></td></tr><tr><td>teli chirurgici</td><td>3M Nederland</td><td>DH999969404</td><td></td></tr><tr><td>pompa di perfusione</td><td>metrohm</td><td>x007528300</td><td></td></tr><tr><td>testa della pompa</td><td>metrohm</td><td>x077202600</td><td></td></tr><tr><td>vassoio</td><td></td><td></td> di perfusione <td>su misura</td></tr><tr><td>tubi masterflex LS25</td><td>Masterflex</td><td>HV-96410-25</td><td></td></tr><tr><td>punta accessoria</td><td>Gambro DASCO</td><td>6038020</td><td></td></tr><tr><td>pulmozyme</td><td>fiasche di</td> coltura 25 <td></td><td></td></tr><tr><td> cm2</td><td>greiner</td><td>690175</td><td></td></tr><tr><td>pallone di coltura 75 cm2</td><td>greiner</td><td>658170</td><td></td></tr><tr><td>pallone di coltura 175 cm2</td><td>greiner</td><td>661160</td><td></td></tr><tr><td>Tripsina</td><td>sigma</td><td>t4174</td><td></td></tr><tr><td>Albumina sierica bovina (BSA)</td><td>Sigma</td><td>A2153</td><td></td></tr><tr><td>EDTA</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>E5134-500g</td><td></td></tr><tr><td>Reagente bloccante FcR</td><td>miltenyi</td><td>130-059-901</td><td></td></tr><tr><td>perle anti melanoma (NG2)</td><td>miltenyi</td><td>130-090-452</td><td></td></tr><tr><td>colino cellulare 70 &; m</td><td>Corning</td><td>352350</td><td></td></tr><tr><td>colonne LS</td><td>Miltenyi</td><td>130-042-401</td><td></td></tr><tr><td>magnete MACS</td><td>miltenyi</td><td>130-090-976</td><td></td></tr><tr><td>CD34 FITC</td><td>BD&nbsp;</td><td></td><td></td>555821</tr><tr><td>CD45 APC</td><td>BD&nbsp;</td><td></td><td></td>555485</tr><tr><td>CD146 PE</td><td>BD&nbsp;</td><td></td><td></td>550315</tr><tr><td>NG2 APC</td><td>R& D</td><td>FAB2585A</td><td></td></tr><tr><td>CD90 PE</td><td>BD&nbsp;</td><td></td><td></td>555596</tr><tr><td>HLA ABC APC</td><td>BD&nbsp;</td><td></td><td></td>555555</tr><tr><td>CD105 FITC</td><td>Ancell</td><td>326-040</td><td></td></tr><tr><td>HLA DR APC</td><td>BD</td><td></td><td></td>559866</tr><tr><td>CD56 PE</td><td>BD&nbsp;</td><td></td><td></td>555516</tr><tr><td>CD73 PE</td><td>BD&nbsp;</td><td></td><td></td>550257</tr><tr><td>CD31 FITC BD</td><td>&nbsp;</td><td></td><td></td>555445</tr><tr><td>CD133 PE</td><td>miltenyi</td><td>130-090-853</td><td></td></tr><tr><td>PDGF-r&nbsp;</td><td>R& D</td><td>mab 1263</td><td></td></tr><tr><td>topo IgG1 FITC</td><td>BD&nbsp;</td><td></td><td></td>345815</tr><tr><td>mouse IgG1 PE</td><td>BD&nbsp;</td><td></td><td></td>345816</tr><tr><td>mouse IgG1 APC</td><td>BD&nbsp;</td><td></td><td></td>345818</tr><tr><td>IgG2b PE</td><td>BD&nbsp;</td><td></td><td></td>555743</tr><tr><td>capra anti topo PE</td><td>Dako</td><td>R0480</td><td></td></tr><tr><td>sodio azide</td><td>Merck</td><td>822335</td><td></td></tr><tr><td>DMEM Ham' s F12</td><td>Gibco</td><td>31331-028</td><td></td></tr><tr><td>ITS (insulina, transferrina, selenio)</td><td>Sigma</td><td>I1884</td><td></td></tr><tr><td>idrocortisone</td><td>Sigma</td><td>H0135</td><td></td></tr><tr><td>triiodottirinina</td><td>Sigma</td><td>T5516</td><td></td></tr><tr><td>Fattore di crescita epidermico (EGF)</td><td>sigma</td><td>E9644</td><td></td></tr><tr><td>Immortalized human renal PTEC (HK2)</td><td></td><td></td><td>courtesey di M. Ryan, collegio universitario Dublino</td></tr></tbody></table>

un metodo di isolamento di romanzo clinical grade per rene umano perivascolari cellule stromali

A Novel Clinical Grade Isolation Method for Human Kidney Perivascular Stromal Cells

Cellule stromali mesenchimali (MSCs) sono omeostatici e immuni modulatoria cellule del tessuto che hanno dimostrato gli effetti benefici nel trapianto e malattie renali. Le cellule Stromal perivascolari (PSC) condividono caratteristiche con midollo osseo MSCs (bmMSCs). Tuttavia, possiedono anche, molto probabilmente a causa di locali imprinting, proprietà di tessuto-specifici e giocare un ruolo nell'omeostasi del tessuto locale. Questa specificità tissutale può provocare riparazione specifico del tessuto, anche all'interno del rene umano. Precedentemente abbiamo indicato che gli sportelli unici di rene umano (kPSCs) sono migliorati arrotolata epiteliale renale mentre bmMSCs non ha avuto questo potenziale di guarigione. Inoltre, kPSCs può migliorare di lesioni renali in vivo. Pertanto, kPSCs costituiscono una fonte interessante per la terapia cellulare, in particolare per malattie del rene e trapianto renale. Qui vi mostriamo il metodo di isolamento e coltura dettagliato per kPSCs dal grado di trapianto di reni umani basati su tutto-organo aspersione di enzimi digestivi tramite l'arteria renale e un arricchimento per il marcatore perivascolare NG2. In questo modo, può essere ottenuto quantità di grandi cellule che sono adatti per la terapia cellulare.

Il metodo di isolamento kPSCs grado clinico è riassunto nella Figura 1. Cellule di rene di greggio sono isolate dal trapianto umano reni di grado tramite aspersione di collagenasi. La sospensione cellulare risultante è coltivata fino al confluente nel 5% delle piastrine lisati. Quindi la frazione di cellule stromali perivascolare è isolata basato sull'espressione di NG2.
kPSCs sono cellule fusiformi aderenti in plastica (Figura 2A) e sono positivi per gli indicatori di stromal marcatori CD73, CD90, CD105 e perivascolare NG2, PDGFR-B e CD146, mentre negativo per CD31, CD34, CD45 e HLA-DR (Figura 2B). In genere, una popolazione omogenea di kPSCs può essere raggiunto al passaggio 4 e kPSCs raggiungere senescenza intorno passaggio 9-10 (Figura 2C). Consigliamo quindi di eseguire esperimenti tra passaggio 5-8.
Per valutare la capacità funzionale del kPSCs isolato, eseguiamo un'analisi gratta e Vinci in vitro rene epiteliale ferita su ogni nuovo lotto di kPSCs, come abbiamo dimostrato in precedenza che il medium condizionato di kPSCs può accelerare la guarigione arrotolata epiteliale in questo dosaggio zero15. Il medium condizionato kPSC fatta di coltura kPSCs per 48 h in alphaMEM 5% della piastrina lisati e raccogliere il surnatante. Successivamente, il rene umano immortalato tubulo prossimale cellule epiteliali (HK-2)17 sono coltivate fino a confluenza e quindi viene effettuata una ferita gratta e Vinci. Quindi sia il medium condizionato di mezzo kPSCs o controllo viene aggiunto ai pozzetti e viene misurata la velocità di guarigione delle ferite. Quando viene aggiunto il medium condizionato di kPSCs, la ferita si chiude significativamente più veloce (Figura 2D).
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/55841/55841fig1.jpg"> 
Figura 1 : Grado clinico metodo di isolamento di umana kPSCs. Trapianto di reni di grado sono cannulati e irrorati con collagenasi via l'arteria renale (A - G) e la sospensione cellulare risultante viene lavata e sia crioconservato o messi in coltura (H - K). Dopo che le cellule raggiungono la confluenza (L), NG2 arricchimento delle cellule è effettuato (M). Le cellule vengono tripsinizzate quando entrambi sono confluenti, hanno smesso di proliferazione o quando strutture 3D appaiono (N - P). I criteri di rilascio per kPSCs sono sterilità, espressione del marcatore e la capacità di migliorare la guarigione arrotolata epiteliale tubolare (Q). Freccia: dell'arteria renale. Barra della scala = 200 µm. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55841/55841fig1large.jpg" target="_blank">Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/55841/55841fig2.jpg"> 
Figura 2: kPSCs caratterizzazione dei diritti dell'uomo. Un) kPSCs sono fusiformi, plastica cellule aderenti. B) kPSCs sono positivi per gli indicatori mesenchymal CD73, CD90, CD105, perivascolare marcatori NG2, PDGFR-β e CD146, mentre negativo per CD31, CD34 e CD45. kPSCs express MHC di classe I (HLA-ABC) ma non di classe II (HLA-DR). C) caratteristiche di crescita di tre differenti kPSC donatori da citometria a flusso ha confermato popolazioni positivi NG2 omogenee (al passaggio 4). kPSCs raggiungere senescenza intorno passaggio 9-10. D) kPSCs sono in grado di esaltare il riparazione epiteliale renale in un'analisi di gratta e Vinci di ferita. Immagini rappresentative di controllo medio e medio kPSC condizionata a t = 0, 4, 8 e 12 h sono mostrati. Barra della scala nel A) = 200 µm, d) = 100 µm. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55841/55841fig2large.jpg" target="_blank">Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>

Qui presentiamo un metodo di isolamento e coltura di romanzo grado clinico per rene perivascolare di cellule stromali (kPSCs) basato sulla perfusione d'organo intero con gli enzimi digestivi e arricchimento NG2-cella. Con questo metodo, è possibile acquisire il numero di celle sufficiente per una terapia cellulare.

Un metodo di isolamento di romanzo Clinical Grade per rene umano perivascolari cellule stromali

Mesenchymal Stromal Cells (MSCs) are tissue homeostatic and immune modulatory cells that have shown beneficial effects in kidney diseases and ...

L'obiettivo generale di questo metodo di isolamento di grado clinico è isolare cellule stromali perivascolari renali umane, o kPSC, per il trattamento terapeutico cellulare di varie malattie renali. Questo metodo può contribuire a rispondere a domande fondamentali nel campo della medicina rigenerativa, come ad esempio se le kPSC umane siano adatte alla terapia cellulare per le malattie renali e per il trapianto. I principali vantaggi di questa tecnica sono la sua applicabilità clinica e la capacità di generare un numero sufficiente di kPSC a fini terapeutici.Ellen Lievers, un tecnico del nostro laboratorio, illustrerà il test funzionale dei kPSC. Prima di iniziare la procedura di isolamento delle cellule renali, collegare un vassoio di perfusione sterilizzato a un bagno termico in posizione verticale. Una volta che il vassoio di perfusione è stato riscaldato dall'acqua, posizionarlo in modo orizzontale, mantenendolo comunque collegato al bagno termico, quindi inserire un tubo L/S 25 nella pompa.Posizionare le pinze della coltura su un'estremità del tubo e lasciare che il tubo poggia sul fondo del vassoio. Posizionare una garza sterile sopra il tubo per prevenire ostruzioni e collegare un connettore luer all'altra estremità del tubo; quindi aggiungere circa 100 millilitri di mezzo al vassoio e iniziare a lavare il tubo L/S 25 a una velocità della pompa di 100 millilitri al minuto. Per isolare le cellule renali, trasferire il rene dai sacchetti sterili doppi sul vassoio di perfusione sterile ed utilizzare forbici e un'accurata dissezione per rimuovere il tessuto adiposo perirenale e la capsula renale.Dopo aver individuato l'arteria renale sulla toppa aortica, utilizzare il picco accessorio per cannulare l'arteria renale e fissare il picco con un fermo sterilizzato. Con la pompa accesa, collegare l'estremità del tubo della pompa al connettore luer. Quindi, lavare il rene con il mezzo presente nel vassoio a una portata di 100 millilitri al minuto.Aggiungere successivamente 20 millilitri di collagenasi e 2,5 millilitri di DNAasi al vassoio di perfusione, e lasciare che gli enzimi digeriscano il rene, girando delicatamente l'organo di tanto in tanto a mano finché non diventa morbido e il liquido di perfusione inizia a diventare opaco. La durata della digestione con collagenasi è critica: troppo breve porterà a grumi cellulari, mentre troppo lunga causerà la morte cellulare. Al termine della perfusione enzimatica, massaggiare delicatamente il rene fino a ottenere una sospensione cellulare, quindi rimuovere il materiale non digerito e l'ago.Aggiungere 50 millilitri di siero umano normale alla sospensione cellulare, quindi, con la pompa impostata su un flusso ridotto, posizionare il tubo collegato al rene sopra diversi tubi da raccolta da 50 millilitri in modo che la sospensione cellulare defluisca dal vassoio di perfusione nei tubi di raccolta. Una volta raccolte tutte le cellule, centrifugare le sospensioni cellulari e lavare i pellet due volte con mezzo di lavaggio, integrato con il 10% di siero umano normale. Dopo il secondo lavaggio, risospendere i pellet in un volume uguale di mezzo di coltura cellulare rispetto a quello dei pellet cellulari.Per coltivare le cellule renali grezze, aggiungere circa un millilitro di sospensione cellulare a 24 millilitri di mezzo di coltura cellulare alpha-MEM con lisato piastrinico al 5% per ogni fiasco di coltura cellulare T175 e incubare i fiaschi a 37 gradi Celsius e 5% di anidride carbonica. Dopo due giorni, rimuovere il surnatante e i detriti cellulari e rifornire le cellule con 25 millilitri di mezzo di coltura fresco. Quando le cellule sono confluenti, isolare la frazione positiva per NG2 mediante separazione cellulare magnetica, secondo protocolli standard.Quindi seminare quattro volte 10 alla terza cellule positive per NG2 per centimetro quadrato in un’adeguata provetta da coltura cellulare e posizionare la provetta nell’incubatrice per colture cellulari. Quando le cellule raggiungono una confluenza del 90-100%, raccogliere il sopranatante e lavare le cellule aderenti due volte con PBS. Staccare le cellule utilizzando il volume appropriato di tripsina in base alle dimensioni della provetta, fermando la reazione con il sopranatante riservato dopo cinque minuti.Ri-sospendere delicatamente le cellule, quindi trasferire la sospensione cellulare in un tubo conico di dimensioni adeguate per la centrifugazione, e ripiattare le cellule a una densità di quattro per dieci alla terza cellule per centimetro quadrato. A volte, dopo l'arricchimento per NG2, le cellule smettono di proliferare o iniziano a crescere in strutture tridimensionali. Questo problema può essere risolto sottoponendo le cellule a tripsinizzazione e ripiattendole.Dopo quattro o cinque passaggi, seminare le kPSC in una piastra a sei pozzetti a una concentrazione di due volte 10 alla quinta cellule per due millilitri di mezzo per pozzetto, e seminare cinque volte 10 alla quinta cellule epiteliali del tubulo prossimale in due millilitri di mezzo per cellule epiteliali del tubulo prossimale per pozzetto in una piastra a sei pozzetti separata. Collocare entrambe le piastre nell'incubatore per colture cellulari per 48 ore, raccogliendo il sopranatante delle kPSC alla fine dell'incubazione, quindi rimuovere il sopranatante delle cellule epiteliali del tubulo prossimale ed utilizzare la punta gialla di una pipetta per eseguire un graffio nel monostrato cellulare sul fondo di ogni pozzetto. Lavare le cellule graffiate con PBS e aggiungere il mezzo condizionato proveniente dalle colture di cellule stromali vascolari renali.Quindi acquisire l'immagine della ferita a 4, 8, 12 e 24 ore nella stessa posizione segnata mediante microscopio invertito a campo chiaro per valutare la percentuale di chiusura nel tempo. Le cellule stromali perivascolari del rene sono cellule aderenti alla plastica, di forma fusiforme, positive per i marcatori delle cellule stromali e perivascolari e negative per i marcatori CD31, CD34, CD45 e HLA-DR. Tipicamente, una popolazione omogenea di cellule stromali perivascolari del rene può essere ottenuta al quarto passaggio, con le cellule che raggiungono la senescenza intorno al nono-diesimo passaggio.In questo saggio rappresentativo di scratch su ferita, per valutare la capacità funzionale delle kPSC, quando è stato aggiunto il mezzo condizionato da una coltura di cellule stromali perivascolari renali, la ferita si è chiusa significativamente più rapidamente rispetto alle pozzette coltivate con il mezzo di controllo. Una volta padroneggiata la tecnica di isolamento primario, questa richiederà circa due ore; occorreranno da uno a due mesi per ottenere una popolazione omogenea di kPSC. Durante l'esecuzione di questa procedura, è importante interrompere il trattamento con collagenasi non appena il rene diventa morbido e i liquidi risultano meno trasparenti.Oltre alle procedure qui dimostrate, queste tecniche potrebbero essere utilizzate anche per l'isolamento di cellule stromali perivascolari da altri organi solidi. Le kPSC isolate con questa tecnica possono essere impiegate per studiare il potenziale rigenerativo di queste cellule in diversi modelli di malattia renale e di trapianto. Dopo aver visto questo video, si dovrebbe essere in grado di isolare e coltivare le kPSC in maniera conforme agli standard clinici.Non dimenticare che lavorare con materiale umano comporta il rischio di trasmissione di virus; prendi sempre precauzioni come il test per HIV, epatite B ed epatite C quando esegui questa procedura.

a-novel-clinical-grade-isolation-method-for-human-kidney-perivascular

Research

Ricerca

JoVE Journal

Medicine

Medicina

Questo video descrive il metodo per isolare i glomeruli intatti dai reni di topo. I glomeruli incapsulati e decapsulati così ottenuti possono essere ulteriormente utilizzati per la coltura di escrescenze di cellule epiteliali parietali dal rene murino.

Isolamento dei glomeruli: una tecnica per ottenere glomeruli intatti dal rene murino

In questo video, dimostriamo i passaggi per isolare e purificare le cellule epiteliali tubulari renali per un'ampia gamma di studi di biologia molecolare e colture cellulari.

Isolamento di cellule renali mure: una tecnica per isolare e generare colture primarie di cellule epiteliali tubulari renali

Questo protocollo descrive la decellularizzazione dei reni di ratto Sprague Dawley mediante perfusione anterograda di detergenti attraverso il sistema vascolare, producendo matrici extracellulari renali acellulari che fungono da modelli per il ripopolamento con cellule epiteliali renali umane. La ricellularizzazione e l'uso del saggio di perfusione della resazurina per monitorare la crescita vengono eseguiti all'interno di bioreattori di perfusione appositamente progettati.

Ripopolamento cellule epiteliali e preparazione di roditori matrice extracellulare Ponteggi per lo sviluppo del tessuto renale

Per le applicazioni a valle sono necessarie tecniche affidabili ed efficienti per l'isolamento delle cellule immunitarie renali. Ciò richiede la marcatura degli anticorpi di superficie di un piccolo numero di cellule immunitarie renali. Qui, descriviamo un metodo conciso per l'isolamento delle cellule immunitarie renali che sembra raggiungere questo obiettivo.

Affidabile e di alta efficienza di estrazione del rene cellule immunitarie

Tessutale renale costrutti forniscono una soluzione per la carenza di organi e deleteri effetti della dialisi. Qui, descriviamo un protocollo a micro sezionare murini reni per isolamento di segmenti cortico-midollare. Questi segmenti sono impiantati nei costrutti senza impalcatura cellulare, formando organoids renale.

Microdissection di segmenti di tessuto renale primario e incorporazione con tecnologia romanzo costrutto senza impalcatura

L'obiettivo principale di questo protocollo è quello di isolare in modo efficiente culture vitale primaria glomeruli con contaminanti minimale per l'uso in una varietà di applicazioni a valle. Glomeruli isolati mantengono relazioni strutturali tra tipi di componenti delle cellule e possono essere coltivate ex vivo per un breve periodo.

Un metodo efficiente di setacciatura per isolare i Glomeruli intatti dal rene di ratto adulto.

Presentato qui è un protocollo per progettare un sistema organo-on-a-chip personalizzato che ricapitola la struttura e la funzione della barriera di filtrazione glomerulare renale integrando cellule endoteliali epiteliali e vascolari geneticamente abbinate differenziate dalle cellule staminali pluripotenti indotte umane. Questo sistema bioingegnerizzato può far progredire la medicina di precisione renale e le applicazioni correlate.

Chip glomerulo renale isogenico ingegnerizzato da cellule staminali pluripotenti indotte umane

L'articolo descrive il metodo per isolare cellule endoteliali glomerulari condizionatamente immortalizzate dai reni di topi transgenici che esprimono il virus termolabile delle scimmie 40 e mitocondri fotoattivabili, PhAMasportato. Descriviamo la procedura per l'isolamento dei glomeruli da reni interi usando perline, fasi di digestione, semina e coltura di GEC-CD31 positivi.

Isolamento di cellule endoteliali glomerulari di topo condizionatamente immortalizzate con mitocondri fluorescenti

Qui presentiamo protocolli che consentono l'isolamento di cellule stromali da osso murino, midollo osseo, timo e tessuto timico umano compatibile con la multiomica a singola cellula.

Isolamento delle cellule stromali da organi ematopoietici

Presentiamo un protocollo ottimizzato per l'elaborazione di interi reni umani per isolare e coltivare cellule epiteliali del tubulo prossimale renale primario e l'applicazione di queste cellule in una piattaforma microfluidica tridimensionale, microfluidica e microfisiologica per ricapitolare il tubulo prossimale renale.

Isolamento di cellule epiteliali primarie del tubulo prossimale umano e loro utilizzo nella creazione di un modello microfisiologico del tubulo prossimale renale

Questo studio ha sviluppato un protocollo ottimizzato per l'isolamento di cellule mesangiali murine (MC) e la loro coltura cellulare ex vivo . Queste cellule possono essere fatte passare più volte, congelate, rianimate e coltivate senza compromettere la crescita cellulare o l'espressione proteica.

Ottimizzazione dell'isolamento e della purificazione delle cellule mesangiali glomerulari murine

Scopri un metodo clinico per isolare cellule stromali perivascolari renali umane mediante perfusione d'organo e arricchimento NG2. Questa tecnica genera popolazioni cellulari omogenee per terapie rigenerative nel trattamento delle malattie renali.

Un metodo di isolamento di romanzo Clinical Grade per rene umano perivascolari cellule stromali

Esplora altri video