Un metodo di isolamento di romanzo Clinical Grade per rene umano perivascolari cellule stromali

L'obiettivo generale di questo metodo di isolamento di grado clinico è isolare le cellule stromali perivascolari renali umane, o kPSC, per il trattamento terapeutico cellulare di varie malattie renali. Questo metodo può aiutare a rispondere a domande chiave nel campo della medicina rigenerativa, come ad esempio le kPSC umane adatte alla terapia nervosa centrale per le malattie renali e i trapianti. I principali vantaggi di questa tecnica sono che è clinica e che può essere utilizzata per generare un numero sufficiente di kPSC per scopi di terapia cellulare.

Ellen Lievers, un tecnico del nostro laboratorio, dimostrerà i test funzionali delle kPSC. Prima di iniziare la procedura di isolamento delle cellule renali, collegare una vaschetta di perfusione sterilizzata a un bagnomaria in posizione verticale. Quando la vaschetta di perfusione è stata riscaldata dall'acqua, portarla in posizione orizzontale, ma ancora collegata al bagnomaria, quindi inserire un tubo L/S 25 nella pompa.

Posizionare le pinze per colture su un'estremità della provetta e lasciare che la provetta poggi sul fondo del vassoio. Posizionare una garza sterile sulla parte superiore del tubo per evitare ostruzioni e collegare un connettore luer all'altra estremità del tubo, quindi aggiungere circa 100 millilitri di terreno al vassoio e iniziare a lavare il tubo L/S 25 a una velocità della pompa di 100 millilitri al minuto. Per isolare le cellule renali, trasferire il rene dalle doppie sacche sterili sul vassoio di perfusione sterile e utilizzare le forbici e una leggera lacrimazione per rimuovere il tessuto adiposo perirenale e la capsula renale.

Dopo aver posizionato l'arteria renale sul cerotto aortico, utilizzare la punta accessoria per incannulare l'arteria renale e fissare la punta con una fascetta sterilizzata. Con la pompa accesa, collegare l'estremità del tubo della pompa al connettore luer. E sciacquare il rene con il fluido nel vassoio a una portata di 100 millilitri al minuto.

Quindi aggiungi 20 millilitri di collagenasi e 2,5 millilitri di DNAsi al vassoio di perfusione e lascia che gli enzimi digeriscano il rene, ruotando delicatamente l'organo di tanto in tanto a mano fino a quando non diventa morbido e il liquido di perfusione inizia a diventare opaco. La durata della digestione della collagenasi è fondamentale, troppo breve porterà alla formazione di grumi cellulari, mentre troppo lungo porterà alla morte cellulare. Al termine della perfusione enzimatica, massaggiare delicatamente il rene fino ad ottenere una sospensione cellulare, e rimuovere il materiale non digerito e la punta.

Aggiungere 50 millilitri di siero umano normale alla sospensione cellulare, quindi con la pompa a bassa portata, posizionare il tubo collegato al rene sopra diverse provette di raccolta da 50 millilitri per consentire alla sospensione cellulare di defluire dal vassoio di perfusione nelle provette di raccolta. Quando tutte le cellule sono state raccolte, centrifugare le sospensioni cellulari e lavare i pellet due volte con un mezzo di lavaggio, integrato con il 10% di siero umano normale. Dopo il secondo lavaggio, risospendere i pellet in un volume di terreno di coltura cellulare uguale a quello dei pellet cellulari.

Per coltivare le cellule renali grezze, aggiungere circa un millilitro di sospensione cellulare a 24 millilitri di terreno di coltura cellulare alfa-MEM al 5% di lisato piastrinico per matraccio di coltura cellulare T 175 e incubare i flaconi a 37 gradi Celsius e 5% di anidride carbonica. Dopo due giorni rimuovere il surnatante e i detriti cellulari e nutrire le cellule con 25 millilitri di terreno di coltura cellulare fresco. Quando le cellule sono confluenti, isolare la frazione positiva NG2 mediante separazione magnetica delle cellule, secondo i protocolli standard.

Quindi seminare da quattro volte 10 al terzo NG2 cellule per centimetro quadrato in un pallone per coltura cellulare di dimensioni adeguate e posizionare il pallone nell'incubatore per colture cellulari. Quando le cellule raggiungono il 90-100% di confluenza, raccogliere il surnatante e lavare le cellule aderenti due volte in PBS. Staccare le cellule con il volume appropriato di tripsina in base alle dimensioni del pallone, interrompendo la reazione con il surnatante riservato dopo cinque minuti.

Risospendere delicatamente le cellule, quindi trasferire la sospensione cellulare in una provetta conica di dimensioni adeguate per la centrifugazione e riplaccare le cellule a una densità quattro volte 10 per terzo di centimetro quadrato. A volte, dopo l'arricchimento di NG2, le cellule smettono di proliferare o iniziano a crescere in strutture 3D. Questo può essere risolto tripsinizzando le cellule e riplaccandole.

Dopo quattro o cinque passaggi, seminare le kPSC in una piastra a sei pozzetti a due volte da 10 alla quinta cellula per due millilitri di terreno per concentrazione di pozzetti e seminare cinque volte 10 alla quinta cellula epiteliale tubulare prossimale in due millilitri di terreno di cellule epiteliali tubulari prossimali per pozzetto in una piastra separata a sei pozzetti. Posizionare entrambe le piastre nell'incubatore per colture cellulari per 48 ore, raccogliendo il surnatante delle cellule kPSC alla fine dell'incubazione, quindi rimuovere il surnatante delle cellule epiteliali tubulari prossimali e utilizzare una punta gialla per pipetta per fare un graffio nel monostrato cellulare sul fondo di ciascun pozzetto. Lavare le cellule graffiate con PBS e aggiungere la condizione al terreno dalle colture di cellule stromali vascolari renali.

Quindi visualizzare il graffio a quattro, otto, 12 e 24 ore nella stessa posizione contrassegnata su un microscopio a campo chiaro invertito per valutare la percentuale di chiusura nel tempo. Le cellule stromali perivascolari renali sono cellule plastiche aderenti a forma di fuso che sono positive per i marcatori delle cellule stromali e perivascolari e negative per i marcatori CD31, CD34, CD45 e HLA-DR. In genere una popolazione omogenea di cellule stromali perivascolari renali può essere raggiunta al passaggio quattro, con le cellule che raggiungono la senescenza intorno al passaggio da nove a 10.

In questo test rappresentativo di graffio della ferita, per valutare la capacità funzionale delle kPSC, quando è stato aggiunto un terreno condizionato da una coltura di cellule stromali perivascolari renali, la ferita si è chiusa significativamente più velocemente rispetto ai pozzetti coltivati con il mezzo di controllo. Una volta padroneggiata la tecnica di isolamento primaria, ci vorranno circa due ore, ci vorranno uno o due mesi per generare una popolazione omogenea di kPSC. Durante il tentativo di questa procedura, è importante interrompere il trattamento con collagenasi non appena il rene diventa morbido e i fluidi diventano meno trasparenti.

Oltre alle procedure qui dimostrate, queste tecniche potrebbero essere utilizzate anche per l'isolamento di cellule stromali perivascolari da altri organi solidi. Le kPSC isolate con questa tecnica possono essere utilizzate per studiare il potenziale rigenerativo di queste cellule in diversi modelli di malattia renale e trapianto. Dopo aver visto questo video, dovresti essere in grado di isolare e coltivare le kPSC in modo clinico.

Non dimenticare che lavorare con materiale umano comporta il rischio di trasmissione del virus, prendi sempre precauzioni come il test per HIV, epatite B, epatite C quando esegui questa procedura.