Un metodo di isolamento di romanzo Clinical Grade per rene umano perivascolari cellule stromali

L'obiettivo generale di questo metodo di isolamento di grado clinico è isolare cellule stromali perivascolari renali umane, o kPSC, per il trattamento terapeutico cellulare di varie malattie renali. Questo metodo può contribuire a rispondere a domande fondamentali nel campo della medicina rigenerativa, come ad esempio se le kPSC umane siano adatte alla terapia cellulare per le malattie renali e per il trapianto. I principali vantaggi di questa tecnica sono la sua applicabilità clinica e la capacità di generare un numero sufficiente di kPSC a fini terapeutici.

Ellen Lievers, un tecnico del nostro laboratorio, illustrerà il test funzionale dei kPSC. Prima di iniziare la procedura di isolamento delle cellule renali, collegare un vassoio di perfusione sterilizzato a un bagno termico in posizione verticale. Una volta che il vassoio di perfusione è stato riscaldato dall'acqua, posizionarlo in modo orizzontale, mantenendolo comunque collegato al bagno termico, quindi inserire un tubo L/S 25 nella pompa.

Posizionare le pinze della coltura su un'estremità del tubo e lasciare che il tubo poggia sul fondo del vassoio. Posizionare una garza sterile sopra il tubo per prevenire ostruzioni e collegare un connettore luer all'altra estremità del tubo; quindi aggiungere circa 100 millilitri di mezzo al vassoio e iniziare a lavare il tubo L/S 25 a una velocità della pompa di 100 millilitri al minuto. Per isolare le cellule renali, trasferire il rene dai sacchetti sterili doppi sul vassoio di perfusione sterile ed utilizzare forbici e un'accurata dissezione per rimuovere il tessuto adiposo perirenale e la capsula renale.

Dopo aver individuato l'arteria renale sulla toppa aortica, utilizzare il picco accessorio per cannulare l'arteria renale e fissare il picco con un fermo sterilizzato. Con la pompa accesa, collegare l'estremità del tubo della pompa al connettore luer. Quindi, lavare il rene con il mezzo presente nel vassoio a una portata di 100 millilitri al minuto.

Aggiungere successivamente 20 millilitri di collagenasi e 2,5 millilitri di DNAasi al vassoio di perfusione, e lasciare che gli enzimi digeriscano il rene, girando delicatamente l'organo di tanto in tanto a mano finché non diventa morbido e il liquido di perfusione inizia a diventare opaco. La durata della digestione con collagenasi è critica: troppo breve porterà a grumi cellulari, mentre troppo lunga causerà la morte cellulare. Al termine della perfusione enzimatica, massaggiare delicatamente il rene fino a ottenere una sospensione cellulare, quindi rimuovere il materiale non digerito e l'ago.

Aggiungere 50 millilitri di siero umano normale alla sospensione cellulare, quindi, con la pompa impostata su un flusso ridotto, posizionare il tubo collegato al rene sopra diversi tubi da raccolta da 50 millilitri in modo che la sospensione cellulare defluisca dal vassoio di perfusione nei tubi di raccolta. Una volta raccolte tutte le cellule, centrifugare le sospensioni cellulari e lavare i pellet due volte con mezzo di lavaggio, integrato con il 10% di siero umano normale. Dopo il secondo lavaggio, risospendere i pellet in un volume uguale di mezzo di coltura cellulare rispetto a quello dei pellet cellulari.

Per coltivare le cellule renali grezze, aggiungere circa un millilitro di sospensione cellulare a 24 millilitri di mezzo di coltura cellulare alpha-MEM con lisato piastrinico al 5% per ogni fiasco di coltura cellulare T175 e incubare i fiaschi a 37 gradi Celsius e 5% di anidride carbonica. Dopo due giorni, rimuovere il surnatante e i detriti cellulari e rifornire le cellule con 25 millilitri di mezzo di coltura fresco. Quando le cellule sono confluenti, isolare la frazione positiva per NG2 mediante separazione cellulare magnetica, secondo protocolli standard.

Quindi seminare quattro volte 10 alla terza cellule positive per NG2 per centimetro quadrato in un’adeguata provetta da coltura cellulare e posizionare la provetta nell’incubatrice per colture cellulari. Quando le cellule raggiungono una confluenza del 90-100%, raccogliere il sopranatante e lavare le cellule aderenti due volte con PBS. Staccare le cellule utilizzando il volume appropriato di tripsina in base alle dimensioni della provetta, fermando la reazione con il sopranatante riservato dopo cinque minuti.

Ri-sospendere delicatamente le cellule, quindi trasferire la sospensione cellulare in un tubo conico di dimensioni adeguate per la centrifugazione, e ripiattare le cellule a una densità di quattro per dieci alla terza cellule per centimetro quadrato. A volte, dopo l'arricchimento per NG2, le cellule smettono di proliferare o iniziano a crescere in strutture tridimensionali. Questo problema può essere risolto sottoponendo le cellule a tripsinizzazione e ripiattendole.

Dopo quattro o cinque passaggi, seminare le kPSC in una piastra a sei pozzetti a una concentrazione di due volte 10 alla quinta cellule per due millilitri di mezzo per pozzetto, e seminare cinque volte 10 alla quinta cellule epiteliali del tubulo prossimale in due millilitri di mezzo per cellule epiteliali del tubulo prossimale per pozzetto in una piastra a sei pozzetti separata. Collocare entrambe le piastre nell'incubatore per colture cellulari per 48 ore, raccogliendo il sopranatante delle kPSC alla fine dell'incubazione, quindi rimuovere il sopranatante delle cellule epiteliali del tubulo prossimale ed utilizzare la punta gialla di una pipetta per eseguire un graffio nel monostrato cellulare sul fondo di ogni pozzetto. Lavare le cellule graffiate con PBS e aggiungere il mezzo condizionato proveniente dalle colture di cellule stromali vascolari renali.

Quindi acquisire l'immagine della ferita a 4, 8, 12 e 24 ore nella stessa posizione segnata mediante microscopio invertito a campo chiaro per valutare la percentuale di chiusura nel tempo. Le cellule stromali perivascolari del rene sono cellule aderenti alla plastica, di forma fusiforme, positive per i marcatori delle cellule stromali e perivascolari e negative per i marcatori CD31, CD34, CD45 e HLA-DR. Tipicamente, una popolazione omogenea di cellule stromali perivascolari del rene può essere ottenuta al quarto passaggio, con le cellule che raggiungono la senescenza intorno al nono-diesimo passaggio.

In questo saggio rappresentativo di scratch su ferita, per valutare la capacità funzionale delle kPSC, quando è stato aggiunto il mezzo condizionato da una coltura di cellule stromali perivascolari renali, la ferita si è chiusa significativamente più rapidamente rispetto alle pozzette coltivate con il mezzo di controllo. Una volta padroneggiata la tecnica di isolamento primario, questa richiederà circa due ore; occorreranno da uno a due mesi per ottenere una popolazione omogenea di kPSC. Durante l'esecuzione di questa procedura, è importante interrompere il trattamento con collagenasi non appena il rene diventa morbido e i liquidi risultano meno trasparenti.

Oltre alle procedure qui dimostrate, queste tecniche potrebbero essere utilizzate anche per l'isolamento di cellule stromali perivascolari da altri organi solidi. Le kPSC isolate con questa tecnica possono essere impiegate per studiare il potenziale rigenerativo di queste cellule in diversi modelli di malattia renale e di trapianto. Dopo aver visto questo video, si dovrebbe essere in grado di isolare e coltivare le kPSC in maniera conforme agli standard clinici.

Non dimenticare che lavorare con materiale umano comporta il rischio di trasmissione di virus; prendi sempre precauzioni come il test per HIV, epatite B ed epatite C quando esegui questa procedura.