Induzione della differenziazione cellulare e dell'immagine delle cellule singole di Vibrio parahaemolyticus Nuotatore e cellule Swarmer

L'obiettivo generale di questo metodo è quello di indurre il differenziamento cellulare del batterio Vibrio parahaemolyticus e la formazione di una popolazione di cellule swarmer differenziate facilmente disponibili per l'analisi di singole cellule mediante microscopia a fluorescenza. Questo metodo aiuterà gli scienziati a capire come i batteri regolano l'organizzazione intracellulare durante la differenziazione cellulare e la morfogenesi. Poiché l'imaging delle cellule all'interno delle comunità batteriche può essere impegnativo, il vantaggio principale di questa tecnica è che produce una popolazione di cellule swarmer differenziate che esistono in un singolo strato cellulare prontamente disponibile per l'analisi al microscopio a singola cellula.

Le implicazioni di questa tecnica si estendono verso una migliore comprensione di come i batteri regolano i cambiamenti nel ciclo cellulare, nella morfologia cellulare e nell'organizzazione intracellulare durante la differenziazione cellulare. La dimostrazione di questo metodo è fondamentale in quanto l'induzione affidabile della differenziazione cellulare e la formazione di cellule disponibili per l'analisi di singole cellule sono difficili da ottenere. Per preparare la soluzione di agar per la produzione di piastre di sciamatura, sospendere quattro grammi di infuso di cuore, o polvere di H.I.agar, e 100 millilitri di acqua distillata doppia.

Far bollire con cura la soluzione di H.I.agar in un forno a microonde, agitando di tanto in tanto il flacone fino a quando la polvere non si sarà sciolta. Autoclavare la soluzione di agar a 121 gradi Celsius per 20 minuti, raffreddare la soluzione di agar a 60 t0 65 gradi Celsius agitando costantemente. Il passaggio successivo prevede la manipolazione di 2,2'Bipiridil, che è altamente tossico, quindi è necessario indossare guanti e occhiali protettivi.

Aggiungere 2,2'Bipiridile a una concentrazione finale di 50 micromolari. Aggiungere cloruro di calcio a una concentrazione finale di quattro millamolari. Inoculare una piccola quantità di cellule di V. parahaemolyticus dal bordo di una singola colonia in 5 millilitri di brodo LB.

Incubare la coltura a 37 gradi Celsius in un incubatore shaker fino a raggiungere una densità ottica a 600 nanometri di 0,8. Questo di solito richiede circa due o tre ore. Mentre la coltura cellulare è in crescita, pipettare da 30 a 35 millilitri della soluzione finale di H.I.agar in una capsula di Petri rotonda da 150 millimetri e lasciare solidificare l'agar.

Poco prima di individuare la coltura cellulare, asciugare la piastra di agar in posizione verticale con un coperchio aperto a 37 gradi Celsius per almeno 10 minuti, o fino a quando eventuali residui liquidi non sono scomparsi, ma non oltre. Posizionare un microlitro di coltura cellulare al centro della piastra di sciamatura H.I.agar e lasciare asciugare la macchia. Sigillare la piastra con del nastro di plastica trasparente, avendo cura di evitare la formazione di bolle d'aria e pieghe al nastro.

Incubare la piastra a 24 gradi Celsius durante la notte. Ciò si tradurrà nella formazione di una colonia di sciami di V.Parahaemolyticus con razzi di sciami che si estendono dal centro della colonia, come mostrato in questo video clip time lapse. Il primo passo di questa procedura consiste nella preparazione dei vetrini di agarosio per la microscopia.

Aggiungere un grammo di agarosio a 100 millilitri di una soluzione di brodo al 20% di PBS e al 10% di libbra. Far bollire con cura la soluzione nel microonde per sciogliere l'agarosio, quindi lasciarla raffreddare a 65-70 gradi Celsius mescolando con un'ancoretta magnetica. Posizionare un vetrino da microscopio pulito su una sezione perfettamente piana di un banco di lavoro.

Fissare il vetrino al banco coprendo entrambe le estremità del vetrino con due strati di nastro adesivo da laboratorio per uso generale. La distanza tra i due pezzi di nastro dovrebbe essere di circa tre centimetri. Pipettare circa 250 microlitri della soluzione di agarosio precedentemente preparata sulla superficie di vetro non coperta.

Posizionare un secondo vetrino da microscopio con lo stesso orientamento del vetrino inferiore sulla parte superiore e premere leggermente verso il basso in modo che l'agarosio residuo possa fuoriuscire ai lati. Lascia solidificare l'agarosio per uno o due minuti. Utilizzare un bisturi per tagliare eventuali residui di agarosio attaccati ai lati del vetrino del microscopio.

Quando l'agarosio si è solidificato, estrarre lentamente il vetrino superiore da quello inferiore con un movimento orizzontale. Rimuovere lentamente il nastro dalle estremità del vetrino del microscopio. Il vetrino di agarosio deve essere utilizzato il prima possibile, poiché inizierà lentamente ad asciugarsi.

Immediatamente prima del trasferimento delle cellule dello sciame sul vetrino del microscopio, utilizzare un bisturi per tagliare il nastro di plastica dalla piastra dello sciame precedentemente preparata. Durante l'escissione dell'agar sciamatore, è importante dirigere il taglio dall'esterno verso l'interno della colonia sciamatura per evitare di contaminare le torce sciamatura con cellule che hanno origine dal centro della colonia. Usa un bisturi fresco per ritagliare un pezzo di agar sciame di tre millimetri per 10 millimetri dal bordo più esterno di una colonia sciamatrice, assicurandoti di dirigere i tagli dall'esterno del bordo della colonia sciamatura all'interno della colonia.

Trasferire il pezzo di agar sciamato sul vetrino di agarosio da microscopio con le cellule rivolte verso il tampone di agarosio per imprimere le cellule sciamate sul tampone di agarosio. Dopo aver atteso circa 30 secondi, rimuovere con cura il pezzo di agar dal tampone di agarosio. Posizionare un vetrino coprioggetti sul tampone di agarosio dove sono state impresse le cellule.

Le cellule sono ora pronte per la microscopia a fluorescenza. L'imaging al microscopio stereoscopico di una colonia di sciami di V. parahaemolyticus con ingrandimento crescente mostra brillamenti di sciami che si estendono dalla periferia della colonia di sciami. Le celle nei brillamenti sono raggruppate solo in mono o due strati, mentre le celle al centro della colonia di sciami sono impilate in più strati.

L'imaging al microscopio DIC ha rivelato che le riacutizzazioni consistono solo in una popolazione completamente differenziata di cellule dello sciame, mentre le cellule del centro della colonia dello sciame sono significativamente più corte e probabilmente rappresentano una miscela di cellule nuotatrici e sciame. A riprova di principio, la DIC e l'imaging al microscopio a fluorescenza sono stati eseguiti su cellule nuotatrici e sciame selvatiche di V.Parahaemolyticus, che esprimono ectopicamente una proteina essenziale della chemiotassi, YFP-CheW. Nelle cellule nuotatrici, YFP-CheW si localizza in modo unipolare e bipolare, ma nelle cellule swarmer, YFP-CheW è sempre localizzato bipolarmente e forma anche cluster posizionati casualmente lungo la lunghezza della cellula.

I cambiamenti nel modello di localizzazione di YFP-CheW durante la differenziazione delle cellule da nuotatore a sciame, sono stati mostrati anche dalla visualizzazione della distribuzione dei focolai e dalle analisi demografiche dei profili di intensità della fluorescenza. Dopo il suo sviluppo, questa tecnica ha aperto la strada ai ricercatori nel campo della biologia delle cellule microbiche per esplorare come il batterio Vibrio parahaemolyticus regola la sua organizzazione interna durante i suoi distinti stati differenziati di cellule nuotatrici e sciame. Dopo aver visto questo video, dovresti avere una buona comprensione di come indurre la differenziazione cellulare del batterio Vibrio parahaemolyticus e come preparare una popolazione di cellule swarmer differenziate per l'analisi di singole cellule mediante microscopia a fluorescenza.

Non dimenticare che il Vibrio parahaemolyticus è un agente patogeno umano e che dovrebbero essere applicate procedure e regolamenti adeguati su come gestire gli agenti patogeni BSL 2 nella tua regione.