Name: Induzione della differenziazione cellulare e dellimmagine delle cellule singole di Vibrio parahaemolyticus Nuotatore e cellule Swarmer (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-05-15T15:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 38 s
Description: Scopri come indurre la differenziazione cellulare in Vibrio parahaemolyticus per ottenere cellule swarmer in un singolo strato. Questo metodo consente l'analisi microscopica a cellula singola per studiare l'organizzazione intracellulare durante la morfogenesi batterica.

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Questo lavoro è stato sostenuto dalla Società Max Planck.

1. Preparazione delle cellule V. parahaemolyticus elettrocompatibili e elettroporazione del DNA plasmidico nelle cellule nuotatori NOTA: La seguente sezione del protocollo consente la preparazione di celle elettro-competenti e la successiva elettroporazione del plasmide DNA in cellule nuotatori. Questo passo è importante se le proteine ​​fluorescenti vengono espresse ectopicamente da un plasmide. <ol><li> Sradicare le cellule V. parahaemolyticus da una riserva di glicerolo da -80 ° C su una piastra di LB agar fresca contenente 100 μg / mL di ampicillina e incubare per una notte a 37 ° C. </li><li> Il giorno seguente, inoculare 200 ml di mezzo LB con una singola colonia di V. parahaemolyticus e incubare a 37 ° C in condizioni di agitazione fino a raggiungere un OD 600 di 1,0. Richiede solitamente 5-6 h di incubazione per la coltura cellulare per raggiungere la densità ottica desiderata. </li><li> Trasferire immediatamente le celle su ghiaccio e perfTutte le ulteriori tappe su ghiaccio e in centrifughe pre-raffreddate a 4 ° C. </li><li> Raccogliere le cellule a 4 ° C per 10 minuti a 2.000 x g. </li><li> Scartare il surnatante decantando e ri-sospendere il pellet cellulare in 25 ml di soluzione fredda di saccarosio 273 mM (pH 7.4, tamponata con KOH). </li><li> Raccogli le cellule di nuovo a 4 ° C per 10 minuti a 2000 x g. Ripetere due ulteriori volte. </li><li> Riassemblare il pellet di cellule lavate in 400 μl di soluzione fredda di 273 mM di saccarosio. Successivamente aggiungere il glicerolo ad una concentrazione finale del 15% vol / vol. Le cellule sono pronte per l&#39;elettroporazione, ma possono anche essere congelate in aliquote di 70 μl a -80 ° C per un uso successivo. </li><li> Per l&#39;elettroporazione, mescolare una aliquota di elettrocompatibili da 70 μl con 100-1000 ng di DNA plasmidico e trasferire la miscela in una cuvetta di elettroporazione ghiacciata (intervallo di elettrodo 0,2 cm). Effettuare l&#39;elettroporazione con le seguenti impostazioni: 25 μF, 2400 V e 200 Ω. </li><li> Sospendi laLe cellule nella cuvetta di elettroporazione in 600 μL di brodo LB, trasferire in un tubo da 2 ml e incubare agitando a 37 ° C per 3 ore. </li><li> Spin giù le cellule a 2.000 xg per 5 min e ri-sospendere il pellet in 100 μL di brodo LB. Distribuire la sospensione cellulare su piastrine selettive di agar LB contenenti gli antibiotici necessari e incubare a 37 ° C per una notte. </li><li> Il giorno seguente, controllare le piastre per la formazione della colonia. Le colonie che crescono portano il gene di resistenza antibiotica corretta codificato sul plasmide e ora può essere utilizzato per ulteriori esperimenti. </li></ol> 2. Induzione della differenziazione delle cellule Swarmer NOTA: Le seguenti fasi descrivono come indurre la differenziazione del V. parahaemolyticus nel suo ciclo vitale della cellula swarmer e come stimolare la proliferazione sulle superfici solide. <ol><li> Sospendere 4 g di agar cuore infusione (HI) in 100 mL ddH 2 O per preparare le piastre di swarming. </li><li>Mescolare accuratamente la soluzione agar HI nel forno a microonde e scuotere la bottiglia di tanto in tanto finché la polvere non viene sciolta. Autoclave a 121 ° C per 20 min. </li><li> Dopo l&#39;autoclave, raffreddare l&#39;agar HI a 60-65 ° C. Aggiungere 2,2&#39;-Bipyridyl ad una concentrazione finale di 50 μM (soluzione di riserva di 50 mM in etanolo al 100%). Aggiungere CaCl 2 ad una concentrazione finale di 4 mM (soluzione di riserva di 4 M in ddH2O). Se necessario, aggiungete gli antibiotici nella soluzione per mantenere i plasmidi. NOTA: Se si prevede di utilizzare un plasmide inducibile, aggiungere agente induttivo alla sua concentrazione finale. ATTENZIONE: 2,2&#39;-Bipyridyl: tossicità acuta (orale, dermico, inalazione). Usare guanti e occhiali di protezione durante la manipolazione di questa sostanza chimica. </li><li> Versare 30 - 35 ml della soluzione finale agar HI in un piatto rotondo da 150 mm di Petri e lasciare che l&#39;agar si solidifichi. </li><li> Prima di individuare la coltura cellulare, asciugare la piastra agar a 37 ° C per almeno 10 minuti (o fino a quando nessun residuo liquidoSi avvicinò, ma non più) a destra con un coperchio aperto. NOTA: I tempi di essiccazione dipendono fortemente dall&#39;incubatrice utilizzata e le piastre asciutte non consentono lo scoramento di V. parahaemolyticus . (Questo passo è molto importante!) Le piastre devono essere utilizzate fresche e non devono essere più vecchie di 2 - 3 ore. Le vecchie lastre saranno troppo asciutte per stimolare lo swarming. </li><li> Inoculare una piccola quantità di cellule dal bordo di una singola colonia in 5 ml di brodo LB. Incubare la coltura agitando a 37 ° C fino a raggiungere OD 600 = 0.8, richiede solitamente circa 2-3 ore. Successivamente, le cellule sono pronte per essere individuate sulle piastre agar HI swarming. </li><li> Posizionare 1 μl di coltura cellulare al centro di una piastra di brigatura agar HI ( Figura 1A ). </li><li> Lasciare asciugare il punto ( Figura 1B ). </li><li> Sigillare la piastra con un nastro di plastica trasparente e assicurarsi che sia saldamente attaccato, altrimenti potrebbe staccarsi durante l&#39;incubazione durante la notte ( Figura 1C ). NOTA: ÈMolto importante che il sigillo sia perfetto. Evitare la formazione di bolle d&#39;aria e pieghe al nastro quando viene applicata. </li><li> Incubare la piastra a 24 ° C per una notte. Ciò comporterà la formazione di una colonia di V. parahaemolyticus con fasci di razza che si estendono dalla periferia della colonia ( Figura 2 ). </li></ol> 3. Preparazione delle cellule Swarmer V. parahaemolyticus per la microscopia a fluorescenza NOTA: Il seguente protocollo descrive come preparare le diapositive di agarosio a microscopia e la successiva imprinting di flaresci di swarming su un tampone di agarosio per ottenere singole cellule swarmer per la microscopia. <ol><li> Per preparare le diapositive agarose per microscopia aggiungere 1 g di agarosio a 100 ml di un 20% vol / vol PBS e 10% vol / vol LB broth solution. Mescolare accuratamente la soluzione nel forno a microonde per sciogliere l&#39;agarosio e lasciarlo raffreddare a 65-70 ° C mentre si mescola con un agitatore magnetico. </li><li> Luogo acScivolare il microscopio magro su una sezione perfettamente livellata di una panchina di lavoro. Coprire entrambe le estremità dello scivolo con due strati di nastro adesivo di laboratorio di uso generale, fissando la slitta alla panca di lavoro. La distanza tra i due pezzi di nastro dovrebbe essere di circa 3 cm. NOTA: i due strati di nastro creano una elevazione molto piccola, che determinerà l&#39;altezza del rilievo agarosio. È importante che lo spazio di lavoro sia livello per assicurarsi che le celle saranno nello stesso piano per l&#39;analisi microscopica. </li><li> Pipettare ~ 250 μL della soluzione di agarosio preparata in precedenza sulla superficie di vetro non coperta. </li><li> Ora posizionare una seconda scivola a microscopio nello stesso orientamento del fondo in alto e premere leggermente verso il basso in modo che l&#39;agarosio residuo possa scorrere verso i lati. </li><li> Lasciare che l&#39;agarosio si solidifichi per 1-2 min e poi tirare lentamente la scaletta di vetro superiore dal basso in un movimento orizzontale. </li><li> Utilizzando un bisturi, tagliare qualsiasi agarosio residuo che è attaccato alI lati dello scivolo del microscopio e rimuovere lentamente il nastro dalle estremità del vetrino del microscopio. NOTA: La scocca di agarosso è pronta e deve essere utilizzata il più presto possibile in quanto si inizia lentamente a seccare. </li><li> Per eseguire la microscopia su cellule swarmer, tagliare un pezzo di agarro da 3 mm x 10 mm dal bordo più esterno di una colonia di scorrimento ( Figura 1D ). E &#39;molto importante non rompere la guarnizione a nastro della piastra a scoppio fino immediatamente prima del trasferimento di cellule swarmer al vetrino del microscopio. Una volta che il nastro viene rimosso, le cellule V. parahaemolyticus innescano la differenziazione in cellule nuotatori. NOTA: Assicurarsi di indirizzare i tagli dall&#39;esterno del bordo della colonia di scorrimento verso l&#39;interno della colonia ( Figura 1D ). In questo modo è possibile impedire la &quot;contaminazione del nuotatore&quot; nel bordo della colonia di swarming. </li><li> Trasferire il pezzo di agar di scorrimento su un microscopio scivolo agaroso con le cellule affacciate sul agarosio paD ( figura 1E ). Questo imprime le cellule swarming sul tampone agarosio. </li><li> Dopo aver aspettato ~ 30 s, rimuovere attentamente il pezzo agar dal tampone agarosio ( Figura 1F ). </li><li> Mettere un coperchio di vetro sul tampone di agarosio dove le cellule sono state imprintate. Le cellule sono pronte per la microscopia. NOTA: è importante immaginare immediatamente le cellule swarmer, poiché le cellule swarmer iniziano lentamente la differenziazione allo stato nuotatore. </li></ol> 4. Preparazione di V. parahaemolyticus Swimmer Cell-cultures per microscopia a fluorescenza NOTA: Questa sezione del protocollo descrive come preparare una coltura di V. parahaemolyticus per eseguire la microscopia a fluorescenza sul tipo di nuotatore. <ol><li> Inoculare una piccola quantità di cellule dal bordo di una singola colonia in 5 ml di brodo LB. Incubare la coltura agitando a 37 ° C per 1 ora o fino a quando la leggera crescita cellulare diventa visibile. </li><li> AQuesta fase, se necessario, aggiungerà agente induttivo per l&#39;espressione di proteine ​​di interesse. In questo esempio, L-arabinosi è stata aggiunta ad una concentrazione finale dello 0,2% (w / vol) per indurre l&#39;espressione di YFP-CheW 9 . </li><li> Incubare la coltura agitando per altri 2 h a 37 ° C. </li><li> Seguire le fasi 3.1-3.7 per preparare le diapositive a microscopio agarosio. </li><li> Spot 1 μL di coltura cellulare al centro del tampone agarosio e lasciare incubare il punto fino a secco. </li><li> Posizionare una copertura in vetro sul rilievo di agarosio dove le cellule sono state individuate. Le cellule sono ora pronte per essere riprese sotto il microscopio a fluorescenza. </li></ol> 5. Analisi delle immagini Questa parte del protocollo descrive un flusso di lavoro per l&#39;analisi delle immagini, in particolare come estrarre i dati di fluorescenza delle singole celle per l&#39;analisi demografica. <ol><li> Prima di iniziare l&#39;analisi delle immagini assicurarsi che tutte le immagini di microscopia vengano salvate in formato TIF a 16 bit. </li><li> Caricare il DIC (o il contrasto di fase) e le corrispondenti immagini del canale fluorescente nel software. </li><li> Genera un&#39;immagine di sovrapposizione di entrambi i canali selezionando &quot;Mostra / Sovrapposizione immagini&quot;. Impostare il numero di immagini (&quot;# Immagini:&quot;) a due e selezionare l&#39;immagine DIC nel primo canale e l&#39;immagine fluorescente nel secondo canale. </li><li> Selezionare lo strumento &quot;Multi-Line&quot; dalla barra degli strumenti e contrassegnare le celle da un polo all&#39;altro attraverso la metà della cella. Per ottenere un elenco di tutte le linee generate (oggetti di linea), aprire &quot;Measure / Region Measurements&quot;. Configurare le misure della regione per visualizzare solo l&#39;etichetta della regione, la distanza e l&#39;intensità media. </li><li> Calibrare la dimensione dei pixel sotto &quot;Misura / calibrazione delle distanze&quot; alla dimensione del pixel specificata per la configurazione del microscopio e fare clic su &quot;Applica a tutte le immagini aperte&quot;. </li><li> Trasferisci tutte le regioni (oggetti di linea) all&#39;immagine del canale fluorescente. Sotto &quot;Regioni / TrasfEr Regions &quot;selezionare l&#39;immagine di origine (l&#39;immagine di sovrapposizione) e l&#39;immagine di destinazione (l&#39;immagine del canale fluorescente). Selezionare&quot; Tutte le regioni &quot;e premere&quot; OK &quot;. NOTA: Per riuscire a riprodurre le righe esatte (oggetti di linea, regioni, ROI), aprire &quot;Regioni / Salva regioni&quot; e salvare le regioni. </li><li> Esportare le misurazioni di tutte le regioni in un foglio di calcolo aprendo &quot;Measure / Measurements Region&quot; e premendo &quot;Open Log&quot;. Confermare di aprire ed esportare i dati. Una volta aperto il foglio di calcolo in background, esportare i dati premendo &quot;F9: Log Data&quot;. </li><li> Per determinare la posizione dei foci fluorescenti lungo la cella, aprire &quot;Measure / Linescan&quot;. Impostare &quot;Linescan Width&quot; in un valore in modo che l&#39;intera larghezza di una cella sia coperta dalla regione creata in precedenza. Fare clic con il pulsante destro del mouse sul grafico di scansione di linea e selezionare &quot;Mostra dati grafico&quot;. Cliccando con il tasto sinistro e trascinando il cursore del mouse lungo la linea di scansione sullo schermoPunto di interesse, la finestra &quot;Grafico dati&quot; visualizzerà la corrispondente pixel / distanza tra i due punti. Selezionare la riga evidenziata blu e quindi copiare il contenuto. NOTA: L&#39;intero profilo di intensità della scansione di linea può essere registrato in un foglio di calcolo premendo &quot;Log Data&quot; nella finestra &quot;Linescan&quot;. I dati estratti possono ora essere utilizzati per la visualizzazione in grafici o ulteriori analisi statistiche. I modelli di localizzazione del ciclo cellulare possono essere facilmente visualizzati in una rappresentazione demografica della lunghezza delle cellule e delle intensità fluorescenti lungo il corpo cellulare. Queste rappresentazioni possono essere ottenute utilizzando lo stesso ROI precedentemente selezionato. Le seguenti fasi forniranno un esempio di come generare demografia simile a quelle riportate nelle figure 3C e 4C . <ol><li> Nelle mappe di regione di caricamento di Figi / ImageJ (.rgn) precedentemente create nel software (passo 5.6) utilizzando il &quot;importatore di file Metamorph nd &amp; ROI&quot;;. In alternativa, le regioni di interesse (ROI) delle cellule da analizzare possono essere create direttamente in Figi / ImageJ utilizzando lo strumento &quot;Segmented Line&quot;. </li><li> Apri &quot;Analizza / Strumenti / Gestione ROI&quot; e segnala tutte le voci di elenco attivo &quot;. </li><li> Successivamente, fare clic su &quot;Altro / Multiplot&quot; e selezionare &quot;Elenco&quot; nella nuova finestra &quot;Multi Plot&quot;. Fare clic su una voce di tabella, quindi selezionare e &quot;copiare tutto&quot;. Successivamente, incollare in un nuovo foglio di lavoro. NOTA: Assicurarsi che i dati della cella più lunga (due colonne X e Y corrispondenti con il maggior numero di righe) siano l&#39;ultima a destra nel foglio di calcolo. </li><li> Salva il foglio di calcolo come &quot;CSV (delimitato da virgole) (* .csv)&quot;. </li><li> Scaricare gli script R qui da &quot;https://github.com/ta-cameron/Cell-Profiles&quot; 10. Gli script gestiscono le celle per lunghezza e normalizzano i profili di intensità fluorescenti di tutte le celle come una media della fluorescenza di ciascuna cellae. </li><li> Esegui l&#39;intero script &quot;profili di cella function.R&quot; in R [versione 3.0.1; 11 ]. </li><li> Modificare lo script &quot;example plots.R&quot; nella riga 30 in modo tale che il percorso del file si riferisca alla cartella in cui viene salvato il file .csv generato in precedenza. Inoltre, modificare il nome del file &quot;profile.csv&quot; nella riga 31 al nome del file scelto per il file .csv generato nel passaggio 5.9.4. Successivamente, eseguire &quot;esempio plots.R&quot; e seguire la documentazione da &quot;https://github.com/ta-cameron/Cell-Profiles&quot; nonché i commenti del file di script per generare l&#39;analisi demografica. </li></ol></li></ol>

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Nessun conflitto di interessi dichiarato.

Questo documento descrive un metodo per l&#39;imaging microscopico delle cellule swarmer V. parahaemolyticus seguito da analisi a valle destinate a risolvere e quantificare la localizzazione subcellulare e altre caratteristiche delle proteine ​​studiate fluorescenti. Sebbene esistano diversi strumenti per l&#39;elaborazione e l&#39;analisi di immagini microscopiche 14 , 15 , 16 , 1...

I batteri sperimentano costantemente cambiamenti nel loro ambiente esterno e hanno sviluppato diverse tecniche per modificare e adattare il loro comportamento di conseguenza. Uno di questi meccanismi comporta la differenziazione in tipi cellulari distinti che meglio integrano l&#39;ambiente alterato. La differenziazione comporta spesso importanti cambiamenti nella regolazione del ciclo cellulare, nella morfologia delle cellule e nell&#39;organizzazione spaziale delle cellule. Un organismo che può subire la differenziazione è Vibrio parahaemolyticus . V. parahaemolyticus appartiene alla Vibrionaceae , che è una famiglia di proteobatteri che abitano abitualmente acqua fresca o salata. Vibrionaceae sono ampiamente distribuite nell&#39;ambiente e includono diverse specie che causano infezioni del tratto intestinale nell&#39;uomo, incluso anche Vibrio cholerae.V. Parahaemolyticus è un organismo dimorfico ed è in grado di differenziarsi in due distinti tipi di cellule come risposta per accogliere i cambiamentiAmbiente esterno. In ambienti acquosi, esiste come una breve cella da nuoto a forma di bastoncello con un singolo flagello polare posizionato all&#39;antico palo di cella. A contatto con la superficie, viene attivata la differenziazione in una cellula swarmer. La differenziazione delle cellule swarmer comporta due importanti cambiamenti: la morfogenesi delle cellule swarmer attraverso l&#39;inibizione della divisione cellulare e l&#39;induzione di un secondo sistema flagella. Ciò determina la formazione di una cellula swarmer a forma di forma a forma di forma e molto allungata, che può continuare lo stile di vita swarmer, dove gli eventi di divisione producono cellule swarmer di progenie o alternativamente si differenziano in cellule nuotatori. Sono stati riportati diversi fattori per indurre o influenzare la differenziazione del swarmer. Lo stimolo primario sembra essere guidato da meccanosensing dove V. parahaemolyticus utilizza il flagello polare come un sensore tattile che rileva l&#39;inibizione della rotazione sul contatto di superficie, ma sono coinvolti diversi altri fattoriBene 1 . Nel laboratorio, la rotazione del flagello polare può essere inibita artificialmente mediante l&#39;aggiunta di fenamil, che blocca la rotazione flagellare guidata dal canale sodico, inducendo così la differenziazione swarmer 2 . Inoltre, in uno studio precedente , Vibrio alginolyticus è stato indotto a sciogliersi su supporti solidi quando le cellule sono state propagate su un mezzo di crescita in un piatto di Petri sigillato con chiaro nastro di plastica. La carta filtrante satura alcalina impediva lo swarming in queste condizioni, suggerendo pertanto che uno o più acidi volatili potrebbero essere coinvolti nell&#39;induzione dello swarming. Così, sigillare il piatto di Petri con nastro di plastica probabilmente consentito per l&#39;accumulo di acidi volatili, formati come sottoprodotti di metabolismo cellulare, all&#39;interno dello spazio testa della piastra. Lo stesso effetto è stato raggiunto quando H2O2 è stato aggiunto al mezzo di crescita in piatti Petri non sigillati per produrre artificialmente acidi volatili idrolizzando i componenti mediali <supClass = &quot;xref&quot;&gt; 3 , 4 , 5 . Tuttavia, l&#39;identità di tali acidi volatili rimane sconosciuta. Inoltre, è stato dimostrato che l&#39;eccesso di disponibilità del calcio 6 e della limitazione di ferro 7 aumentano entrambe la differenziazione e la proliferazione di swarmer sulle superfici solide. Le cellule possono essere affamate per il ferro aggiungendo il composto 2,2&#39;-Bipyridyl al mezzo di crescita, che ha dimostrato di influenzare la differenziazione del swarmer 8 . I fattori noti per la regolazione della differenziazione sono ora implementati nella progettazione di un protocollo che riproducibilmente induce la differenziazione di V. parahaemolyticus in cellule swarmer e la loro proliferazione sulle superfici agariche solide. V. la differenziazione del parahaemolyticus comporta grandi cambiamenti nella regolazione della divisione cellulare, nella morfologia cellulare e nel posizionamento di macchine macromolecolari come flagellA e chemiotassi - processi che richiedono la localizzazione specifica delle proteine ​​secondo il ciclo cellulare. Così, la capacità di studiare la localizzazione intracellulare di tali proteine ​​è essenziale per la comprensione dei suddetti processi cellulari. Per eseguire tali studi è necessaria la microscopia a fluorescenza sulle singole cellule. Ciò può essere particolarmente impegnativo quando le cellule di immagini che esistono all&#39;interno di popolazioni batteriche densi, come avviene per le cellule swarmer. Ci sono stati tentativi di indurre una differenziazione di swarmer in supporti liquidi, che potenzialmente potrebbero generare singole cellule per studi di microscopia. E sebbene su un livello trascrizionale queste cellule hanno in parte indotto il programma di differenziazione swarmer, non subiscono gli stessi cambiamenti morfologici distinti, come le cellule swarmer completamente differenziate coltivate su un mezzo solido 8 . Questo documento offre un protocollo robusto e riproducibile di un metodo per indurre swarmer ceLl differenziazione su una superficie di agar. Il protocollo produce una popolazione di cellule swarmer facilmente accessibili prontamente disponibili per la microscopia a cellule singole e successive analisi. Inoltre, il protocollo consente di localizzare studi di proteine ​​etichettate con fluorescenza in entrambi i tipi di nuoto e swarmer (sezioni 1, 2, 3, 4). Inoltre, il protocollo descrive il flusso di lavoro successivo su come elaborare e analizzare i dati generati dagli esperimenti di microscopia a fluorescenza, che consente l&#39;analisi demografica delle società batteriche (sezione 5).

<table><tbody><tr><td>Media components</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>LB medium</td><td>Roth</td><td>X968.3</td><td></td></tr><tr><td>Difco Agar, granulato</td><td>BD</td><td>214510</td><td>Per la preparazione di LB agar con LB medium</td></tr><tr><td>Difco Heart Infusion Agar</td><td>BD</td><td>244400</td><td>Per la preparazione di piastre di sciamatura HI agar</td></tr><tr><td>Agarose NEEO, ultra qualità</td><td>Roth</td><td>2267.3</td><td>Per la preparazione di tamponi di agarosio per microscopia</td></tr><tr><td>Nome</td><td>Azienda</td><td>Numero di catalogo</td><td>Comments</td></tr><tr><td>Additives</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>L-arabinosio</td><td>Roth</td><td>5118.3</td><td>Utilizzato per indurre derivati pBAD</td></tr><tr><td>2,2'-Bipiridile</td><td>Sigma Aldrich</td><td>D216305-25G</td><td>Per la preparazione di piastre di sciamatura HI agar</td></tr><tr><td>Cloruro di calcio diidrato</td><td>Roth</td><td>5239.1</td><td>Per la preparazione di piastre di sciamatura HI agar</td></tr><tr><td>Sale sodico di ampicillina</td><td>Roth</td><td>K029.3</td><td></td></tr><tr><td>Cloramfenicolo</td><td>Roth</td><td>3886.3</td><td></td></tr><tr><td>tampone PBS</td> <td>-</td><td></td> <td>Ricetta standard per soluzione salina</td></tr> <tr>tamponata con fosfato<td>D(+) Saccarosio</td><td>Roth</td><td>4621.1</td><td>Per la preparazione di celle elettrocompetenti</td></tr><tr><td>Glicerolo</td><td>Roth</td><td>3783.5</td><td>Per la preparazione di celle elettrocompetenti</td></tr><tr><td>Name</td><td>Company</td><td>Catalog Number</td><td>Comments</td></tr><tr><td>Hardware</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Piastra di Petri 150 mm x 20 mm con camme</td><td>Sarstedt</td><td>82.1184.500</td><td>Per la preparazione di piastre di sciamatura di agar HI</td></tr><tr><td>kelvitron t (B 6420)</td><td>Heraeus-Utilizzato</td><td></td> <td>per l'essiccazione di piastre di sciamatura di agar HI</td></tr><tr><td>Gene Pulser Xcell Microbial System</td><td>BioRad</td><td>1652662</td><td>Utilizzato per l'elettroporazione del DNA plasmidico</td></tr><<tr><td>strong>Nome</td><td>Azienda</td><td>Numero di catalogo</td><td>Comments</td></tr><tr><td>Software</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>MetaMorph Offline (versione 7.7.5.0)</td><td>Molecular</td> <td>Devices-Utilizzato</td> <td>per l'analisi delle immagini al microscopio</td></tr><tr><td>Excel</td><td></td> <td>Microsoft-Utilizzato</td> <td>per l'analisi dei dati al microscopio</td></tr></tbody></table>

induzione della differenziazione cellulare e dell&#39;immagine delle cellule singole di<em&gt; vibrio parahaemolyticus</em&gt; nuotatore e cellule swarmer

Induction of Cellular Differentiation and Single Cell Imaging of Vibrio parahaemolyticus Swimmer and Swarmer Cells

La capacità di studiare la localizzazione intracellulare delle proteine ​​è essenziale per la comprensione di molti processi cellulari. A sua volta, questo richiede la possibilità di ottenere singole celle per la microscopia a fluorescenza, che può essere particolarmente impegnativa quando le cellule di immagini che esistono all&#39;interno delle comunità batteriche. Ad esempio, il patogeno umano Vibrio parahaemolyticus esiste come brevi cellule nuotatori a forma di bastoncino in condizioni liquide che, al contatto con la superficie, si differenziano in una sottopopolazione di cellule swarmer altamente allungate specializzate per la crescita su superfici solide. Questo articolo presenta un metodo per eseguire un&#39;analisi microscopica di una singola cellula di V. parahaemolyticus nei suoi due stati differenziali. Questo protocollo produce molto riproducibilmente la differenziazione del V. parahaemolyticus in un ciclo vitale della cellula swarmer e facilita la loro proliferazione su superfici solide. Il metodo produce fasci di cellule swarmer differenziate che si estendono da tÈ il bordo della colonia. Notevolmente, alla punta delle bruciature di swarm, le cellule swarmer esistono in un unico strato di cellule, che consente loro facile trasferimento a una diapositiva del microscopio e successiva microscopia a fluorescenza di singole cellule. Inoltre, viene presentato il flusso di lavoro dell&#39;analisi delle immagini per la rappresentazione demografica delle società batteriche. Come prova del principio, è descritta l&#39;analisi della localizzazione intracellulare delle matrici di segnalazione chimotassie in nuotatori e cellule swarmer di V. parahaemolyticus.

Induzione della differenziazione e della generazione di colonie di brulicante La figura 1 fornisce uno schema delle fasi importanti per la produzione di colonie di V. parahaemolyticus ( Figura 1A-C ). Una cultura del nuotatore è stata individuata su agar aghi e incubata a 24 ° C, inducendo una differenziazione e una proliferazione del swarmer sulla superficie del solido agar. ...

Questo protocollo consente la microscopia a cellule singole del nuotatore diverso Vibrio parahaemolyticus e delle cellule swarmer. Il metodo produce una popolazione di cellule swarmer facilmente accessibili per l&#39;analisi delle cellule singole e copre la preparazione delle colture cellulari, l&#39;induzione della differenziazione swarmer, la preparazione del campione e l&#39;analisi delle immagini.

Induzione della differenziazione cellulare e dell&#39;immagine delle cellule singole di<em&gt; Vibrio parahaemolyticus</em&gt; Nuotatore e cellule Swarmer

The ability to study the intracellular localization of proteins is essential for the understanding of many cellular processes. In turn, this requires the ...

L'obiettivo generale di questo metodo è indurre la differenziazione cellulare del batterio Vibrio parahaemolyticus e la formazione di una popolazione di cellule nuotatrici differenziate facilmente accessibili per l'analisi a livello di singola cellula mediante microscopia a fluorescenza. Questo metodo aiuterà i ricercatori a comprendere come i batteri regolano l'organizzazione intracellulare durante la differenziazione cellulare e la morfogenesi. Poiché l'analisi di immagini di cellule all'interno di comunità batteriche può risultare complessa, il principale vantaggio di questa tecnica consiste nella produzione di una popolazione di cellule nuotatrici differenziate disposte in un singolo strato cellulare, immediatamente disponibili per l'analisi microscopica a livello di singola cellula.Le implicazioni di questa tecnica si estendono verso una migliore comprensione di come i batteri regolino i cambiamenti nel ciclo cellulare, nella morfologia cellulare e nell'organizzazione intracellulare durante la differenziazione cellulare. La dimostrazione di questo metodo è fondamentale poiché l'induzione affidabile della differenziazione cellulare e la formazione di cellule disponibili per l'a

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Ricerca

JoVE Journal

Immunology and Infection

Immunologia e Infezioni

Fonte: Heering, J., et al. Induzione del differenziamento cellulare e imaging di singole cellule di Vibrio parahaemolyticus Swimmer e Swarmer. J. Vis. Exp. (2017)Questo video dimostra l'induzione della differenziazione delle cellule swarmer in Vibrio parahaemolyticus utilizzando un terreno di agar appositamente preparato. Manipolando i segnali ambientali come l'esaurimento del ferro, l'integrazione di calcio e il contatto con la superficie, i batteri sono stimolati a passare dalla loro forma di...

Induzione del differenziamento di Vibrio parahaemolyticus in cellule Swarmer

Fonte: Heering, J., et al., Induzione della differenziazione cellulare e imaging di singole cellule di Vibrio parahaemolyticus Swimmer e Swarmer. J. Vis. Exp. (2017).Questo video mostra la preparazione di cellule swarmer da una colonia di Vibrio parahaemolyticus per l'imaging a fluorescenza. I batteri sono geneticamente modificati per esprimere una proteina marcata con fluorofori che si localizza unipolarmente nelle cellule nuotatrici e bipolarmente nelle cellule a sciame allungate, consentendo...

Preparazione delle cellule Swarmer di Vibrio parahaemolyticus per l'imaging

Fonte: Morales-Soto, N. et. al., Preparazione, imaging e quantificazione dei saggi di motilità della superficie batterica. J. Vis. Exp. (2015)Questo video mostra un test di sciamatura utilizzando batteri che esprimono la proteina fluorescente verde per osservare la motilità superficiale sull'agar molle. L'imaging time-lapse cattura l'espansione coordinata e la formazione dei viticci, evidenziando la motilità della superficie batterica.

Saggio di sciamatura per la visualizzazione della motilità della superficie batterica

La motilità della sciamatura è influenzata da fattori fisici e ambientali. Descriviamo un protocollo in due fasi e linee guida per aggirare le sfide comunemente associate alla preparazione del saggio a sciame e alla raccolta dei dati. Una tecnica di imaging macroscopico viene impiegata per ottenere informazioni dettagliate sul comportamento dello sciame che non sono fornite dalle attuali tecniche di analisi.

Preparazione, Imaging, e la quantificazione di Surface batterica motilità Assays

Il ruolo di assortimento (segregazione spaziale) in scenari evolutivi può essere esaminato utilizzando semplici sistemi microbici in laboratorio che permettono la regolazione della distribuzione spaziale controllato. Modificando la densità cellulare fondatore, vari livelli di assortimento possono essere visualizzati utilizzando ceppi batterici fluorescente nei biofilm colonie di Bacillus subtilis.

Il monitoraggio spaziale segregazione in superficie Colonizzare microbiche Popolazioni

Presentiamo un metodo per l'analisi di microfluidica di lignaggi di singola cellula batterica utilizzando Bacillus subtilis come esempio. Il metodo sormonta le imperfezioni dei tradizionali metodi analitici in microbiologia, consentendo l'osservazione di centinaia di generazioni di cellulari in condizioni di crescita uniforme e ben controllabile.

Analisi Microfluidic unicellulare del Bacillus subtilis

L'imaging delle cellule batteriche è un approccio biologico dei sistemi emergenti incentrato sulla definizione di processi statici e dinamici che dettano la funzione di grandi macchine macromolecolari. Qui, l'integrazione dell'imaging quantitativo delle cellule vive e della tomografia crioelettronica viene utilizzata per studiare l'architettura e le funzioni del sistema di secrezione Legionella pneumophila tipo IV.

Applicazione di Live Cell Imaging e tomografia Cryo-Electron a risolvere le caratteristiche spatiotemporali del sistema di secrezione Legionella pneumophila Dot/Icm

Molti batteri usano la motilità guidata dalla flagella per navigare nel loro ambiente e colonizzare un ambiente favorevole sia individualmente che collettivamente. Qui è dimostrato l'uso di tre metodi consolidati che sfruttano la motilità come strumento di selezione per identificare componenti / percorsi che contribuiscono al nuoto e alla motilità brulicante.

Investigare la motilità guidata dalla Flagella in Escherichia coli applicando tre tecniche consolidate in una serie

Questo protocollo di imaging cellulare vivo-batterico consente di vedere le interazioni tra più specie batteriche a livello di singola cellula nel tempo. L'imaging time-lapse consente l'osservazione di ogni specie batterica in monocultura o cocoltura per interrogare le interazioni interspecie in comunità batteriche multispecie, tra cui la motilità e la vitalità delle singole cellule.

Visualizzazione cinetica delle interazioni batteriche interspecie a uni cell

Qui, descriviamo l'uso di piastre a gradiente induttore per valutare la motilità dello sciame batterico ottenendo contemporaneamente risposte di concentrazione multiple.

Quantificazione della motilità dello sciame di superficie batterica su piastre gradienti induttori

La Salmonella invade e si replica all'interno delle cellule epiteliali intestinali sia nei vacuoli specifici della Salmonella che libera nel citosol (iperreplicazione). Un protocollo basato sulla microscopia a fluorescenza ad alta produttività è descritto qui per quantificare i fenotipi intracellulari di Salmonella mediante due analisi di immagini complementari attraverso ImageJ, raggiungendo la risoluzione e il punteggio di una singola cellula.

Analisi automatizzata dei fenotipi intracellulari di Salmonella con ImageJ

Scopri come indurre la differenziazione cellulare in Vibrio parahaemolyticus per ottenere cellule swarmer in un singolo strato. Questo metodo consente l'analisi microscopica a cellula singola per studiare l'organizzazione intracellulare durante la morfogenesi batterica.

Induzione della differenziazione cellulare e dellimmagine delle cellule singole di Vibrio parahaemolyticus Nuotatore e cellule Swarmer (Video) | JoVE Journal

Induzione della differenziazione cellulare e dell'immagine delle cellule singole di

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